모든 바이러스 코딩 염기서열이 결여된 고용량 아데노바이러스 벡터를 생성하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 벡터 게놈에 포함된 전이유전자의 클로닝은 homing endonucleases를 기반으로 합니다. 부착 세포로 성장하고 현탁액에서 생산자 세포의 바이러스 증폭은 트랜스에 바이러스 유전자를 제공하는 보조 바이러스에 의존합니다.
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이 논문에서
요약
초록
모든 바이러스 코딩 염기서열이 없는 고용량 아데노바이러스 벡터(HCAdV)는 높은 패키징 용량(최대 35kb), 낮은 면역원성 및 낮은 독성으로 인해 가장 진보된 유전자 전달 벡터 중 하나입니다. 그러나 많은 실험실에서 HCAdV의 사용은 벡터 게놈 구성 및 바이러스 생산을 위한 복잡한 절차로 인해 방해를 받고 있습니다. 여기에서는 HCAdV 게놈을 포함하는 플라스미드 pAdFTC를 기반으로 HCAdV의 효율적인 클로닝 및 생산을 위한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다. HCAdV 게놈의 구축은 호밍 엔도뉴클레아제(I-CeuI 및 PI-SceI)를 활용하는 클로닝 벡터 시스템을 기반으로 합니다. 최대 14kb의 관심 유전자는 I-CeuI 및 PI-SceI의 측면에 있는 다중 클로닝 부위를 포함하는 셔틀 벡터 pHM5에 subclone할 수 있습니다. 셔틀 벡터로부터 전이유전자의 I-CeuI 및 PI-SceI-매개 방출 후, 전이유전자를 HCAdV 클로닝 벡터 pAdFTC에 삽입할 수 있습니다. pAdFTC 플라스미드의 크기가 크고 강력한 DNA 결합과 관련된 사용된 효소의 인식 부위가 길기 때문에 클로닝 단편을 신중하게 처리해야 합니다. 바이러스 생산을 위해 HCAdV 게놈은 NotI digest에 의해 방출되어 Cre 재조합효소를 안정적으로 발현하는 HEK293 기반 생산자 세포주에 transfection됩니다. 아데노바이러스 증폭을 위한 모든 아데노바이러스 유전자를 제공하려면 loxP 부위 옆에 있는 패킹 신호를 포함하는 도우미 바이러스와의 동시 감염이 필요합니다. 벡터의 사전 증폭은 표면에서 성장한 생산자 세포에서 수행되고 벡터의 대규모 증폭은 현탁액에서 성장한 생산자 세포가 있는 스피너 플라스크에서 수행됩니다. 바이러스 정제를 위해 염화세슘 구배를 기반으로 하는 두 가지 초원심분리 단계를 수행한 후 투석을 수행합니다. 여기에서는 이 HCAdV 벡터 시스템으로 지난 몇 년 동안 개발된 팁, 요령 및 바로 가기를 소개합니다.
서론
유전자 치료 응용 것이 바이러스 단백질의 발현, 유전자 자체 또는 수신 바이러스 단백질에 의한 세포 독성 및 면역 부작용을 방지하기 위해 매우 중요하다. 아데노 바이러스 벡터 (ADV)가 널리 도입 유전자 발현 1,2의 영향을 조사하기 위해 다양한 세포에 외래 DNA를 도입하기 위해 사용된다. ADV의 가장 진보 된 버전은 모든 바이러스 코딩 서열 3,4-함으로써 낮은 면역 원성 및 저독성 5-8 결합 35킬로바이트까지 패키징을 제공하는 능력이 결여 된 고용량 아데노 바이러스 벡터 (HCAdV)으로 표시된다. 때문에 높은 포장 용량 그들은 하나의 벡터 용량을 사용하여 크거나 여러 유전자의 전달을 할 수 있습니다. 따라서, 그들은 연구 지역 사회를위한 유용한 도구를 나타냅니다.
대조적으로, 제일 - 또는 VEC를 2 세대 ADV 쉽게 상업용 키트를 사용하여 제조 할 수있다 초기 유전자 E1 및 / 또는 E3 결여 할토르 HCAdV의 게놈 구조와 바이러스 생산은 더 복잡하다. HCAdV 게놈의 건설을위한 시스템은 모든 바이러스 코딩 시퀀스 및 셔틀 플라스미드 pHM5 9-12없는 HCAdV 게놈을 운반하는 플라스미드 pAdFTC을 기반으로합니다. 최대 14 킬로베이....
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프로토콜
플라스미드 pAdFTC 기반으로 재조합 HCAdV 게놈 1. 건설
참고 : 모든 플라스미드는 이전에 11, 12를 설명하고 요청에 따라 사용할 수있다. 클로닝 과정은도 1에 개략적으로 도시되어있다.
- pHM5-GOI를 생성하기 위해, 선택의 클로닝 전략을 사용하여, 셔틀 플라스미드 pHM5으로 프로모터 및 폴리아 데 닐화 신호 (PA)를 포함하여 관심 유전자 (GOI)를 복제.
주 : pAdFTC가 비교적 큰 플라스미드 때문에, 고전 플라스미드 제조 프로토콜 실리카 막에 기반 상업 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드 DNA의의 전단은 피해야한다. I-CEU I 및 PI -Sce 나는 강하게 DNA에 결합하여 소화 DNA의 전기 영동 이동성을 변경합니다. 따라서, 페놀 - 클로로포름 추출 및 침전을 EtOH (130 단계), 아가 로스 겔 전기 영동 전에 요구된다. - PHM의 다이제스트 20 μg의100 μL의 총 부피 37 ℃에서 3 시간 동안 I-CeuI (10 U) 5-GOI과 pAdFTC 10 μg의은 (~ 2.8 KB + GOI ORF의 순서와 ~ 31킬로바이트, 각....
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결과
복제, 증폭 및 HCAdV 준비 정화용 여기에 대표적인 예는 표시됩니다. 효소 소화 제한에 의해 복제 전략의 개요 (그림 1)과 복제에 대한 대표적인 예와 HCAdV 게놈의 릴리스는 (그림 2)이 제공된다. 소화 나는 PI- SceI 제한 I 및 I-CEU에 의해 pHM5에서 GOI-발현 카세트 및 후속 페놀 - 클로로포름 추출 및 EtOH로 침전의 출시 후 일반적인 제한 패턴 (그림 2A)를 표시된다 (도 1.2 ~ 1.5 단계). 일반적 pHM5 플라스미드 백본 및 GOI의 발현 카세트에 대응하는 제 2 대역에 대응 ~ 3킬로바이트 밴드를 관찰 할 수있다. GOI 발현 카세트를 함유하는 밴드이어서, 아가 로스 겔로부터 정제한다. 정제 된 GOI-발현 카세트는 정제, 탈 인산화 pAdVFTC와 함께 아가 로스 젤에 분석 W 그정확한 크기를 확인하.......
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토론
여기에 제시된 프로토콜은 전술 한 절차에 기초 4,12 인간 아데노 바이러스 형 5에 기초 HCAdV 벡터들의 정화를 허용한다. pAdFTC 플라스미드 내의 HCAdV 게놈은 모든 아데노 바이러스 유전자의 결여 만 5'- 및 3'- LTR에 및 포장 신호를 전달한다. 이 전략에서 HV AdNG163R-2 (4)는 트랜스 효율적인 바이러스 생산에 필요한 모든 유전자를 제공한다. 또는 아데노 관련 바이러스 (AAV) 기반 벡터 - 이것은 명확하게 제 1 및 제 2 세대 AdVs 또는 널리 사용되는 렌티 바이러스 (LV)을 outcompetes 최대 35킬로바이트의 포장 용량을 제공합니다. 특히 생체 내 (in vivo) 적용을위한 HCAdV의 두번째 장점은 제일 - 대조적 또는 2 세대 AdVs 그들이 세포 독성의 감소 된 수준과 5-8 바이러스 단백질의 발현으로 인한 면역 부작용을 표시한다는 점이다.
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공개 사항
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 DFG 보조금 EH 192/5-1(A.E.), EU(E-rare-2) 프로젝트 Transposmart(A.E.), UWH Forschungsförderung(E.S. 및 W.Z) 및 University Witten/Herdecke(PB)의 박사 과정의 지원을 받았습니다. J.L.은 중국 장학금 위원회(Chinese Scholarship Council)의 급여와 Else Kröner-Fresenius 재단(EKFS)의 TB 및 M.G의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| CeuI | New England Biolabs | R0699S | 제한 다이제 |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | 제한 다이제 |
| T4 Ligase | New Engand Biolabs | M0202S | 결찰 |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | 제한 다이제 |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | 제한 다이제스트 |
| 송아지 장 알칼리성 인산가수분해효소 (CIP) | New England Biolabs | M0290S | 소화된 플라스미드의 탈인산화 |
| Hygromycin B | PAN Biotech | P02-015 | 116 세포를 발현하는 CRE 선택 |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | Hek293T 세포 배양 배지 |
| 최소 필수 배지 (MEM) Eagle | PAN Biotech | P04-08500 | 116 세포 배양 배지 |
| 둘베코' s 인산염 완충액 식염수(DPBS) | PAN Biotech | P04-36500 | 세포 세척, 세포 재현탁 |
| 250ml 저장 병 | Sigma | CLS430281-24EA | 현탁액에서 성장한 116개 세포의 감염 |
| 500ml PP 원심분리기 | Sigma | CLS431123-36EA | 현탁액 배양에서 세포 침 |
| 스피너 플라스크 | Bellco | 1965-61030 | 116개 세포의 성장 서스펜션 |
| 울트라 클리어 초원심분리기 튜브 | Beckmann Coulter | 344059 | 밀도 구배 원심분리 |
| 초원심 | Beckmann Coulter | 밀도 구배 원심분리 | |
| SW-41 로터 | Beckmann Coulter | 밀도 구배 원심분리 | |
| Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane | VWR | 132129 | 투석 튜브 |
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| peqGOLD 조직 DNA 미니 키트 | Peqlab | 12-3396-02 | 게놈 DNA |
| 분리 SuperFection 형질주입 시약 | Qiagen | 301305 | 116개 세포의 형질전환 |
| opti MEM (10% FBS) | Gibco | 31985-062 | 116개 세포의 형질전환 |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 170-8882 | q-PCR |
| CFX 96 C1000 터치 | Biorad | qPCR 기계 | |
| 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 | Carl Roth | A156.1 | DNA |
| 정제 세슘 클로라이드 | Carl Roth | 8627.1 | 밀도 구배 원심분리 |
| 아세트산 나트륨 99% | Carl Roth | 6773.2 | DNA 침전 |
| LB 매체 | Carl Roth | X968.3 | 세균 성장 매체 |
| 에탄올 99.8% 순수 | Carl Roth | 9065.5 | DNA 침전 및 세척 |
| SDS 99.5% | Carl Roth | 2326.2 | 용해 완충액 |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | 용해 완충액 |
| Tris-HCl 99% | Carl Roth | 9090.3 | 투석 완충액/ 용해 완충액 |
| 글리세롤 99.5% | Carl Roth | 3783.1 | 투석 완충액 |
| MgCl2 98.5% | Carl Roth | KK36.2 | 투석 완충액 |
| NaCl | Carl Roth | 3957.1 | 선택적 투석 완충액 |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.2 | 선택적 투석 완충액 |
| 자당 | Carl Roth | 9286.1 | 선택적 투석 완충액 |
| Na2HPO4x2H2O | Carl Roth | 4984.2 | 선택적 투석 버퍼 |
| 1.5-ml 튜브 | SARSTEDT | 72,730,005 | -80°C에서 바이러스 제제 저장; 씨 |
참고문헌
- Benihoud, K., Yeh, P., Perricaudet, M. Adenovirus vectors for gene delivery. Curr Opin Biotechnol. 10 (5), 440-447 (1999).
- Crystal, R. G. Adenovirus: the first effective in vivo gene delivery vector. Hum Gene Ther. 25 (1), 3-11 (2014).
- Parks, R. J., et al.
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