우리는 마우스의 모터 유닛의 기능의 생체 모니터링 허용 정제 프로토콜을 제시한다. 기술 좌골 신경에서 신경 지배 마우스 뒷다리 근육의 복합 근 활동 전위 (CMAP)와 모터 유닛 번호 추정 (무네)을 측정하는 것이 설명된다.
방법 논문
우리는 마우스의 모터 유닛의 기능의 생체 모니터링 허용 정제 프로토콜을 제시한다. 기술 좌골 신경에서 신경 지배 마우스 뒷다리 근육의 복합 근 활동 전위 (CMAP)와 모터 유닛 번호 추정 (무네)을 측정하는 것이 설명된다.
CMAP(Compound Muscle Action Potential) 및 MUNE(Motor Unit Number Estimation)는 생체 내에서 운동 단위 풀의 기능 상태를 모니터링하는 데 사용할 수 있는 전기 생리학적 기술입니다. 이러한 측정은 신경근 시스템의 정상적인 발달과 퇴화에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이러한 측정은 진단 및 임상 인간 연구에 일상적으로 적용되기 때문에 명확한 번역 잠재력을 가지고 있습니다. 우리는 쥐의 좌골 신경 기능을 기록할 수 있도록 인간에게 사용되는 것과 유사한 전기 생리학적 기술을 제시합니다. CMAP 반응은 말초 신경의 극상 자극에 따른 근육 또는 근육 그룹의 전기 생리학적 출력을 나타냅니다. MUNE는 CMAP 응답의 수정을 기반으로 하는 전기생리학적 기술입니다. MUNE는 테스트 중인 근육 또는 근육 그룹에 공급하는 운동 뉴런 또는 축삭돌기(운동 제어 입력)의 추정 수를 나타내는 계산된 값입니다. 우리는 마우스의 좌골 신경을 자극한 후 표면 기록 전극을 사용하여 근위 다리 근육의 CMAP 반응을 기록하는 방법을 제시합니다. 증분 MUNE 기법은 평균 SMUP(Single Motor Unit Potential) 크기를 결정하기 위해 준최대 자극을 사용하여 설명됩니다. MUNE는 CMAP 진폭(peak-to-peak)을 SMUP 진폭(peak-to-peak)으로 나누어 계산합니다. 이러한 전기생리학적 기법을 통해 신생아 마우스와 성체 마우스 모두에서 반복적인 측정을 수행할 수 있으며, 이러한 방식으로 신속한 분석 및 데이터 수집을 용이하게 하는 동시에 실험 테스트에 필요한 동물의 수를 줄일 수 있습니다. 또한 이러한 측정은 인간 연구에서 기록된 것과 유사하여 보다 직접적인 비교가 가능합니다.
모터 장치 번호 추정 (무네)는 원래 McComas 등으로 설명했다. 지난 3 년 전 1. 본래 기술 준 최대 증가를 얻기 위해 자극 점진적인 증가를 채용 복합 근 활동 전위 (CMAP) 기록 방식의 변형이었다. 이 증가분은 합산 단일 모터 유닛 전위 (SMUP)의 예상 크기를 결정하도록 평균화 하였다. 이 크기는 모터 유닛의 개수를 추정 CMAP 응답으로 테스트되는 근육에 분포 나누었다. 원래의 설명에 이어, 전기 생리 반응과 증분 힘을 모두 사용하여 다수의 변형 (기계적) 측정은 인간 및 동물 연구 모델 (2) 모두에서 사용되어왔다. 무네 기술은 근 위축성 측삭 경화증 (ALS) 3, 4의 마우스 모델을 조사하기 위해 Shefner 및 동료에 의해 수정되었습니다.
현재의 설명에서, 우리는 세부 simplif수행 빠른있는 무네 기술의 IED 수정. 중요한 것은, CMAP와 무네는 신생아와 성인 쥐 5-8 모두에서 신뢰할 수있는 조치를 할 수 있습니다. 경험이 풍부한 사람들은 동물 당 10 ~ 20 분에이 조치를 수행 할 수 있으며, 반복 측정은 길이 데이터 (5)의 인수를 허용하는 가능하다. 현재의 연구에서 우리는 임상 전기 진단 시스템을 사용한다. 우리의 경험에 의하면, 임상 전기 진단 시스템은 생체 내에서 전기 생리 데이터의 신속하고 효율적인 캡처에 최적화되어, 그럼에도 불구하고 표준 전기 생리 리그는 쉽게 응용 프로그램에 적용 할 수 있습니다.
이 프로토콜은 승인과 오하이오 주립 대학 웩 스너 의료 센터의 동물 관리 및 윤리 지침을 준수 하였다.
1. 동물 준비 및 마취
2. R설치 및 장비 ecording
3. 데이터 수집
CMAP와 무네의 기술은 최소 침습 전극 배치 (그림 1)를 이용 좌골 신경 지배 뒷다리 근육의 신경 근육 기능의 녹음을 할 수이 보고서는 설명했다. 근육 그룹의 총 출력을 나타낸다 Supramaximal CMAP 크기, 진폭 및 영역 (도 2)의 파라미터를 이용하여 설명 될 수 있지만, 현재의 방법에서, 우리는 CMAP과 SMUP 크기를 정량화하는 진폭을 사용한다. CMAP 응답 대책 근육 내 근육 섬유의 탈분극을 합산 때문에, 어디서나 근섬유로 운동 신경 병리에서 CMAP의 크기의 감소가 발생할 수있다. 따라서, CMAP은 전체 기능 상태의 우수한 측정을 제공합니다. 예상대로, CMAP의 크기는 개발 5시 증가 할 것이다. 때문에 다음과 같은 탈 신경 (즉 담보 돋)를 발생할 수 있습니다 보상 변화, CMAP의 크기는 모터 neur의 프로세스에도 불구하고 유지 될 수있다또는 모터 축삭 손실. 따라서, 무네의 기술은 근육 또는 근육 군에 또는 운동 신경 축삭 입력 테스트중인을 결정하도록 요구된다. 개별 단위의 기록 (그림 3) 모터 장치의 기능 상태에 대한 자세한 정보를 제공하는 단일 모터 단위 (SMUP 크기)의 평균 출력의 추정을 할 수 있습니다.
CMAP 및 무네는 다양한 신경 근육 질환의 마우스 모델에서 신경 근육 기능을 측정하기 위해 이용 될 수있다. 그림 4에서, 성인 제어 마우스 및 좌골 신경 호감 다음 성인 마우스 11주의 연구 결과는 대조된다. 좌골 신경 호감에 따라, 무네는 심각하게 제어 마우스 278 기능성 모터 단위의 일반적인 연구 결과에 비해 50 추정 기능성 모터 단위로 감소한다. 대조적으로, 분쇄 동물 CMAP 진폭 (39.6 MV는 기준 피크, 74.9 피크 - 투 - 피크 MV) 대조군 (49.0 MV 기준선 대에 비해 단지 경미한 감소를 나타낸다- 피크, 84.2 MV 피크 - 투 - 피크)에 의한 담보의 발아에.

그림 1. 전극 위치. 블랙 (E1) "활성"전극 (A)과 빨간색 (E2) "참조"기록 전극 (B)는 무릎에있는 비복근의 근위 부분에서 비복근 위에 배치됩니다. 자극 음극 (블랙) (C)과 양극 (적색) (D)의 선단부 응답을 생성하도록 상기 기록 전극에 근접하게 피하 삽입된다. 일회용 디스크 전극 (D)는 이슈를 최소화하기 위해 접지로 뒷다리, 꼬리 또는 천골에 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 2. 복합 근육 활동 전위. 사진 된이 대표 CMAP 응답의 그림입니다. (A)베이스 라인 - 투 - 피크 진폭 (음의 전압이 기준 이상으로 묘사된다) 초기 부정적인 피크 등전점 기준에서 측정한다. ( B)의 피크 - 투 - 피크 진폭이 양의 피크 전압 극성의 피크 전압에서 측정된다. 회색 음영 지역이 음의 피크 면적을 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. 증분 반응. 두 대표 증분 응답은 중첩 솔라에 표시됩니다기. 각 증분 무네 산출 진폭 들어 피크 - 투 - 피크를 측정한다. 증분 # 1은 전부 아니면 어느 것도 기록되어 있지 반응 초기이고 단일 모터 유닛 전위 (SMUP)을 나타낸다. 이후의 증가 (# 2-10) 이전 응답에 중첩 계량 적 증가를 나타냅니다. 따라서 단위로 2-10의 SMUP 진폭을 얻기 위해, 이전 응답의 진폭을 얻을 증가의 진폭에서 제외된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4 실시 예와 좌골 CMAP 무네. (A)에서 성인 좌골 복합 근 활동 전위 (CMAP) (생후 6 개월) 기준 피크 49.0 MV의 진폭 및 피크 - 대와 제어 마우스84.2 MV의 피크 진폭. 스크린 감도 = 부문 당 10 MV 및 화면 기간 10 MS. (B) (제어 마우스에서) 텐 해당 증분 응답 3.028 MV의 총 진폭은 평균 SMUP 크기 (0.3028 MV)를 결정하기 위해 (10)에 의해 구분된다. 스크린 감도 = 0.5 MV 및 부문 당 1 밀리 스위프 속도. 계산 무네 = 278 (무네 = CMAP / 평균 SMUP (84.2 MV / 0.3028 MV)) (C) 좌골 CMAP 약간 감소베이스 라인 - 투 - 피크 진폭을 나타내는 성인 마우스에서 좌골 신경 호감 (생후 6 개월) 다음 11주 ( 39.6 MV) 및 피크 - 투 - 피크 진폭 (74.9 MV). 스크린 감도 = 부문과 부문 당 1 밀리 스윕 속도 당 10 MV. (D) 텐 (10)으로 나눈 14.923 MV의 총 피크 - 투 - 피크 진폭 (신경 호감을 가진 마우스에서) 증가 응답을 대응하는 평균 SMUP을 얻었다 1.4923 MV의 크기입니다. 스크린 감도는 = 2 부문 당 MV 및 부문 별 1 ms의 스위프 속도. 계산 무네 = 50 (무네 = CMAP/ 평균 SMUP (74.9 MV / 1.4923 MV)). (** 좌골 호감 마우스의 증가 응답에 대한 서로 다른 감도를 참고). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
무네와 CMAP 자주 조사 연구 및 루게릭 병 및 척수 성 근위축증 (SMA) 9, 10 등의 신경 근육 질환 환자 모니터링에 사용되는 임상 적으로 적절한 조치를합니다. 예를 들어, SMA에, CMAP와 무네 연령, 중증도와 임상 잘 상관 관계 기능 10-14의 조치. 두 방법은 최소 침습하고 동일한 개인에 길이 방향으로 기능의 평가를 할 수 있습니다. 중요한 것은, 이러한 조치는 피질 운동 뉴런에 의해 활성화 또는 모터 유닛의 채용을 측정 할 수 없지만 운동 신경의 무결성 및 기능적 대응, 모터 유닛의 임상 적 관련성 평가를 제공한다.
신경 근육 질환의 동물 모델은 인간 질병의 발병 메커니즘의 이해 및 잠재적으로 효과적인 치료제의 전임상 개발에 중요하다. 결과 측정 할 수있는 바이오 마커를 번역 할 수있는 능력촉진하고 인간의 임상 시험에 유망한 임상 연구 결과의 번역을 촉진 할 수 종에 걸쳐 이용했다. 몇몇 그룹은 이전 마우스 모델 2-4, 15-22에 모터 유닛 기능을 추정하는 전기 생리 학적 힘 (기계적) 측정 모두를 이용 하였다. 때문에 측정의 상대적 복잡성, 우리는 생쥐에서 더 광범위한 사용 및 구현 할 수 있도록 시각적 형식으로 이러한 기술을 정제했다. 비디오 데모 및 명령의 형식, 절차의 주요 단계를 강조하고 잠재적 인 함정이 해결 될 수 있습니다. 운동 신경 질환에서 잠재적 인 치료의 임상 시험에 대한 이들 기술의 적용은 인간의 질병에서 추정 된 마우스 요법 번역을 향상시킬 수있다.
CMAP와 무네 응답을 취득하는 과정에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 적절하고 일관된 기록 전극의 위치와 뒷다리와 충분한 전극 접촉사지 재현성 측정 진폭 및 배경 잡음을 감소시키기위한 중요하다. 따라서, 뒷다리 피부와 전극 간의 긴밀한 접촉을 지속적으로 확인해야한다. 우리는 표면 전극 바늘 전극보다 더 일관성 CMAP와 무네 녹음을 제공하는 것으로 나타났습니다. 때문에 매우 얇은 피하 조직에, 바늘 기록 표면의 작은 움직임은 CMAP 진폭에 다양한 변화가 발생할 수 있습니다. 또한, 바늘 전극의 더 침습적 인 성격으로 인해 잠재적 인 근육 장애 및 부상으로 신생아 마우스 또는 종 연구를위한 최적되지 않습니다. 특정 근육 다른 비해 다소 복잡하고, 이는 ALS 마우스 모델 (21)에보고 된 경우, 비 선택적, 표면 전극 레코딩의 하나의 잠재적 인 단점은 감소 된 표현형 분석의 가능성에 관한 것이다.
SMUP 평균 크기를 획득하는 것은 기술적으로 CMAP 비해 더 많은 도전이다. 때문에 작은 응 답에배경 잡음 (μV보다는 MV의 범위에서) E의 크기가 더 문제가 될 수있다. 배경 잡음은 실험 장치 근처에 다른 전기 장비를 접지 전극, 음극, 양극을 조정하고, 검사에 의해 감소 될 수있다. 일반적으로 세포 내 전기 생리학 용도에 사용 패러데이 케이지는, 요구되지 않는다. 개별 SMUP 응답의 시각 결정은 취득 할 수있는 가장 어려운 기술이다 적절한 반복과 일치하는 결과에 대한 연습이 필요합니다. 그것은 기록되는 SMUPs CMAP가 최대 응답 시간 이내에 시작하는 것이 중요하다. 우리는 수행과 인트라 간 평가자의 신뢰성을 높이기 위해이 프로세스를보다 간단하게 개인 증분의 답변 수용 기준을 정의했습니다.
증분 무네 기법의 하나의 잠재적 인 단점으로 인해 모터 차량의 모터를 교대로 기능 유닛의 수를 과대 평가의 가능성을 포함R 단위. 우리는 Shefner 등의 알과 유사한 기술을 사용했다. 그 각각의 응답은 재현성이 현상 (3)의 영향을 줄이기 위해 3 회 전체를보아야한다.
우리의 경험에 의하면, 임상 전기 진단 시스템에 의한 제어의 용이성을 가능하게 개선 심사관 - 전기 진단 시스템 인터페이스 인체 공학에 여기에 기술 된 연구에 최적화되어 있습니다. 우리의 실험에 이용 2 채널 시스템은 디지털 변환기 (24)와 비트 아날로그 증폭기와 채널 당 48 kHz의 샘플링 레이트를 사용하여 두 개의 비 - 스위칭 증폭기 채널을 갖추고있다. 하드웨어 게인 100 MV / 사단 10nV에서 조정될 수있다. 저주파 필터는 0.2 HZ-5 kHz에서의 범위를 가지며, 고주파 필터 설정은 30 Hz에서 10 kHz의 범위. 정전류 자극은 (:; : 0.02-1 MS 기간 0-100mA 강도)가 사용됩니다. 대부분의 임상 적 시스템은 유사한 적절한 기능이 적절히 CMAP 및 무네 응답을 기록하도록 조정될 수있다.dditionally 표준 전기 생리 릭 적절히 CMAP 및 무네를 기록하기 위해 조립 될 수 있지만, 인터페이스는 자극 및 조정 CMAP SMUP 반응의 신속한 식별을 용이하게하기 위해 조절 될 필요가있다.
우리는 이전에 CMAP의 기술을 이용하고 무네 성인기 5 출생 초기 기간 동안 마우스의 뒷다리의 좌골 신경 지배 근육을 신속하고 재현성 평가를 허용하기 위해 여기에 설명. 운동 기능에 대한 행동 시험이 가능하지 않거나 신뢰성이 떨어지는 경우 이러한 기술은 마우스 모델에서 평가를 할 수 있습니다. 신생아 마우스에이 기술을 적용 모터 유닛 개발 연구를 용이하게 운동 신경 신경 분포 및 가지 치기에 대한 이해를 확장 할 수있는 잠재력을 갖는다. 예를 들어, 우리는 무네로 촬영 기능 모터 유닛의 개수가 처음 두 주 동안 mononeuronal 신경 분포에 polyneuronal에서 치기 중에 증가 할 것으로 나타났다신생아 쥐 5 삶의의. 이 기술 장시간 마우스를 테스트 할 수있는 능력은 말초 신경 손상, 유전성 신경 근육 장애 및 노화에 모터 유닛 반응 연구라는 것으로.
저자는 공개할 것이 없습니다.
WDA는 NIH-NICHD(5K12HD001097-17) 및 Cure SMA의 보조금으로 지원됩니다. SJK는 NINDS(K08NS067282 및 U01NS079163)의 보조금으로 지원됩니다.
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