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방법 논문

랑겐 돌프 - 관류 쥐 마음에 유도 및 허혈 - 재관류 손상의 평가

23.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52908

⸱

2015년 7월 27일

 ,  , 
1Department of Medicine/Cardiology, Gazes Cardiac Research Institute, Medical University of South Carolina, 2Ralph H. Johnson VA Medical Center, Medical University of South Carolina

이 논문에서

요약

고립된 쥐 심장은 허혈 재관류 손상에 대한 지속적인 모델입니다. 여기에서는 허혈성 모욕의 정도를 확인하기 위해 제자리 대동맥 삽 관술, 심장의 Langendorff 관류, 시뮬레이션된 허혈-재관류 손상 및 경색 염색을 통해 쥐에서 박동하는 심장을 채취하는 과정을 설명합니다.

초록

급성 환경에서 허혈 재관류 손상을 둘러싼 생화학적 사건은 흉부 수술의 심근 경색 및 심장 합병증에 대한 새로운 치료 옵션을 발전시키는 데 매우 중요합니다. 허혈 재관류 손상에 대해 심근을 전제 조건화하는 특정 약물의 능력은 여러 임상 시험으로 이어졌지만 거의 성공하지 못했습니다. 분리된 심장 모델을 사용하면 허혈-재관류 손상 창 이전 또는 내에서 언제든지 시행되는 다양한 약물 중재의 효과를 포함하여 허혈 재관류 손상의 기능적 효과를 실시간으로 예리하게 관찰할 수 있습니다. 짧은 기간의 허혈은 허혈성 손상에 대해 심장을 사전 조건화할 수 있기 때문에 사전 조절되지 않은 심근의 기능 평가를 허용하기 위해 현장 대동맥 삽관술이 수행됩니다. 식염수로 채워진 풍선을 좌심실에 삽입하여 압력 발생을 실시간으로 측정할 수 있습니다. 허혈성 손상은 관류 완충 흐름의 중단에 의해 시뮬레이션된 후 재관류가 뒤따릅니다. 허혈과 재관류의 지속 시간을 조절하여 주어진 시점에서 생화학적 사건을 검사할 수 있습니다. Langendorff 분리 심장 모델은 허혈 및 재관류에 영향을 미치는 전신 사건을 고려할 수 없지만, 허혈 재관류 손상 창 내에서 급성 기능 및 생화학적 사건을 조사하고 심장 사전 및 사후 조절에 대한 약리학적 중재의 효과를 조사하기 위한 훌륭한 모델입니다. 이 프로토콜의 목표는 Langendorff 모델에서 허혈/재관류 손상에 이어 제자리 대동맥 삽관 및 심장 절제를 수행하는 방법을 보여주는 것입니다.

서론

모두 허혈 및 재관류에 심장 응답의 기초가되는 사건의 해명은 대동맥 - 클램핑 (2)를 필요로 심근 경색 (1) 심장 수술의 치료 개선에 필수적이다. 허혈 재관류 손상의 생체 내 모델이 매우 유용 종료점을 분석 할 수 있지만, 그들이 실시간으로 급성 허혈 재관류 손상의 작용 효과를 연구하기위한로서 효과적이지 않다. 생체 허혈 재관류 모델은 일반적으로 재관류시의 경색 크기에서 상당한 변동성 및 심장 약물의 직접 전달을 생산에 또한 도전. 허혈 재관류 손상을 연구 랑겐 돌프 격리하는 마음 시스템의 활용은 약물 치료, 경색 조직의 균일 한 영역, 직접 심근에 약물의 즉각적인 전달의 실시간 기능 평가를 할 수 있습니다.

먼저 B를 설명1895 년 3 Y 오스카 랑겐 돌프는 랑겐 돌프 격리하는 마음은 지난 40 년 4,5에 대한 허혈 재관류 연구에 사용 된, 허혈 재관류 손상 연구를위한 강력한 모델이다. 여기에 일부 수정 기능 분석을 위해 고립 된 마음을 최적화하기 위해 만들어집니다. 대동맥의 현장 삽관에서 심장 박동이 심장 허혈 재관류 시험 (6)의 결과를 바꿀 것 허혈 양상을 경험하지 않는 것을 보장된다. 이를 용이하게하기 위해, 기관 절개 환기 있도록 수술시 쥐의 생리 안정성 확보를 행한다. 심장이어서 크렙스 Henseleit 버퍼 ​​대동맥에 직접 역행 관류 통해 전달되는 유리 물 재킷 나선형 기둥에 부착된다. 염수로 채워진 풍선 좌심실에 삽입 및 심실 내에서 압력을 실시간으로 측정 할 수있는 압력 변환기에 부착되고여러 기능 매개 변수의 D 계산. 실험이 끝날 때, 심장 수축과 DNA, RNA 및 단백질 수준의 하류 분석을 가능하게 액체 질소에 냉동 플래시 체포 냉 식염수로 불어 낸다. 따라서 수정을 Langendorff 관류 심장 허혈 재관류 손상시 급성 언제든지 약리학 적 개입의 생리적 효과를 직접 모니터링을위한 효과적인 시스템 역할을한다.

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프로토콜

여기에 나열된 모든 절차는 사우스 캐롤라이나 의과 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 여기에 설명 된 실험 급성 비 생존 실험이다. 따라서,이 눈 연고의 아무 소용이 없으며 멸균 운영 스위트 룸은 필요하지 않습니다. 안락사는 마음의 수확시 방혈에 의해 달성된다.

1. 실험 준비

  1. 일정한 압력 또는 일정한 흐름을 Langendorff 관류 장치 (4)를 설정합니다.
  2. 수정 크렙스 Henseleit 버퍼의 4 L 준비 (MM의 : (112)의 NaCl, 5 KCl을, 1.2 황산을 1, K 2 HPO 4, 1.25 염화칼슘 2, 25 NaHCO3를, 11 D- 글루코스, 0.2 옥 탄산, 산도 = 7.4).
    1. 10 배 재고 버퍼를 확인합니다.
      1. 3 L의 초순수에의 NaCl, KCl을, 황산, 및 K 2 HPO 4를 녹여.
      2. 500ml의 초순수 위스콘신에 CaCl2를 녹이고1 N 염산 40 mL로 일.
      3. 천천히 1.2.1.1에서 만든 버퍼에 염화칼슘이 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 4 L. 총 충분히 초순수를 추가 0.8 μm의 필터를 통해 여과 전에 1 시간 동안 교반을 허용합니다. 4 ℃에서 보관하십시오.
      4. 4 L의 초순수에 NaHCO3를 해산. 0.8 μm의 필터로를 통해 필터링하기 전에 1 시간 동안 교반을 허용합니다. 저장 4 ° C에서
    2. 400 ml의 10 배 NaHCO3를 버퍼와 400 ml의 10 배 크렙스 Henseleit 버퍼를 결합합니다. 교반하면서 당과 옥 탄산을 녹이고 4 L. 총하기에 충분한 초순수를 추가합니다. 0.8 μm의 필터를 통해 필터링합니다.
  3. 심장을 위해 시스템을 준비합니다.
    1. 4 L 병에 필터링 된 버퍼의 2 L을 추가 대동맥 정맥에 붙어있는 꼭지 위의 38을 배치. 이 권장 관류 압 4 중심부에 70 ~ 80 mmHg로의 관류 압력을 제공 할 것입니다.
    2. 병에 버퍼에 가스 분산 버블을 삽입합니다.
    3. 튜브 내부에서 모든 거품을 제거해야되고, 시스템을 통해 버퍼를 실행합니다.
    4. 심장은 시스템 상에 배치 될 전에 가스 (95 %, O2 / 5 % CO 2) 적어도 30 분에 돌려. 산소 포화도를 확인하기 위해 가스 유동 프로브 및 혈액 가스 분석을 사용한다.
  4. 수술 용품 및 풍선을 준비합니다.
    1. 마음의 수확, 6.75 일쌍 "수술 가위, 4.5 일쌍"가위, 27 G 바늘, 0 게이지 실크 봉합사의 2 개 (약 15 지혈제 이쌍, caramalt 집게 두 세트, 두 개의 주사기를 준비 길이 cm), 하나 1/16 인치 철 뉼러, 한 기관 캐뉼라.
    2. 기관 캐뉼라를 조립하려면 Y 커넥터에 1/16 인치 직경의 플라스틱 튜브의 짧은 조각을 접착제.
    3. 풍선 장치를 조립 : 1/16 인치 튜브의 조각에 위관 바늘을 부착 한 후 압력 변환기의 하우징에 튜브를 연결합니다. 압력 TR의 다른쪽에 부착 된 작은 주사기ansducer 하우징은 풍선의 인플레이션과 디플레이션을 수 있습니다.
      1. 중앙에 위관 바늘의 플라스틱 포장과 장소 팁의 사각형을 잘라. 위관 바늘 주위의 플라스틱 포장 랩.
      2. 식염수로 풍선을 채우고 두 봉합으로 묶을. 누수가 없는지 확인하기 위해 풍선을 팽창. 팽창 된 풍선 내의 식염수의 부피는 약 200 μL해야하지만 쥐의 크기에 따라 달라질 수있다.
      3. 또한, 플라스틱 랩 대신 라텍스 손가락 침대를 사용합니다. 손가락 침대에서 위관 바늘을 놓고 식염수로 채우고 묶을.

2. 수확 심장

  1. decapicone 구속 또는 기타 수동 소자를 이용한 스프 라그 돌리 래트를 제지. 쥐의 무게를.
  2. 쥐를 마취하는 복강 내 주사를 통해 케타민 / 자일 라진 혼합물 (0.85 ㎎ / ㎏ 케타민 0.15 ㎎ / ㎏ 자일 라진)를 관리합니다. 마취제의 용량은 충분한 마취를 제공 할 것입니다20-40 분하지만 절차는 신속히 마취가 확인 가능한 후에 완료한다.
  3. 테스트 발가락 핀치 반사에 의한 마취의 적절한 수준을 확인합니다.
  4. 기관 절개술
    1. 절개를 만들기 위해 펠트와 가위를 상승 지혈제를 사용, 턱의 기본 중순 앞발에서 펠트를 제거합니다. 펠트 따라 절단하고 제거하는 일을 허용, 기본 근육에서 분리하는 상승 펠트를 유지합니다.
    2. 지혈제를 사용하여, 선의 조직을 들어 올려 선의 조직 근막에 수평 절개 열등합니다. 닉하지 경정맥을 돌보는 오픈 절개를 확산 지혈제를 사용합니다.
    3. , 지혈제를 사용하여 핀치 근육 기관을 덮는 및 사용 가위는 지혈제의 끝 아​​래 근육에 횡 절개를합니다. 지혈제를 사용하여 기관을 나타 내기 위해 따로 조직을 확산.
    4. 조심스럽게 부드럽게 전진과 지혈을 후퇴에 의해 진행하면서 근막을 제거, 기관에서 지혈제를 삽입합니다.
    5. 지혈이 성공적으로 기관 뒤에 배치되면, 지혈제와 0-0 실크 봉합사를 꼬집어 가위의 작은 날카로운 쌍의 기관을 hemisect.
    6. , hemisected 기관으로 기관 캐뉼라를 삽입기도 뒤에 봉합을 당겨와 외과 의사의 매듭 캐 뉼러의 Y 사타구니에 봉합사를 고정, 유관 기관 주위 봉합 넥타이.
    7. 27 G 바늘을 사용하여 경정맥에 1000 U / kg 헤파린 주입하고 30 초 동안 순환 시키도록 허용한다.
  5. 개흉술
    1. 지혈제로 곤란과 가위로 절단하여 중간 앞발 지역 중순 복부에서 펠트를 제거합니다.
    2. 바로 다이어프램 아래, 복부 근육의 벽에 ¾ 인치 가로 절개를합니다.
    3. 흉골을 따라 절단, 복부 벽과 가슴 벽까지 수직 절개를합니다.
    4. 다시 양자 다이어프램을 절단 한 후 마음이 확산 남아 보장하는 지혈제와 클램프 흉곽을 나타 내기 위해 흉곽을 확산.
    5. 지혈제를 사용하여 부드럽게 상행 대동맥을 노출, 흉선을 제거합니다.
    6. 지혈제의 팁을 통해 수 있도록 끈을 확산 부드럽게 진행하고 지혈을 후퇴하고, 대동맥 루프를 통해 지혈을 애무 해줘.
    7. , 상행 대동맥 뒤에 0-0 실크 봉합사를 당겨 느슨한 반 사각 매듭으로 봉합을 묶어 지혈을 사용합니다.
    8. 관류 버퍼, hemisect 대동맥의 흐름을 시작하고 즉시 대동맥 루멘에 캐 뉼러를 삽입 꼭지를 돌립니다. 신속하게 반 사각 매듭을 식은 죽 먹기 철저하게 강화, 매듭을 완료합니다.
    9. 멀리 큰 혈관에서 심장을 해부 가슴에서 심장을 제거하고 관류 열을 연결하는 가위를 사용합니다.
    10. 초과 폐 조직을 잘라 내고 마음이 풍선을 삽입하기 전에 약 15 분 동안 열 평형 수 있습니다. 10-20 ml / 분의 중심부를 통해 버퍼의 정상 유량을 사용한다.

3. 랑겐 돌프 관류 및 허혈 재관류 손상

  1. LV 사전 배치ssure 풍선
    1. 원뿔 모양으로 압연하는 동안 풍선을 수축 및 풍선이 수축 유지 보장하기 위해 꼭지를 켜십시오.
    2. 소비세는 승모판 막에 대한 액세스를 노출 가위의 작은 쌍의 중앙 홀을 떠났다.
    3. 좌심방과 좌심실에 승모판을 통해 풍선을 삽입합니다.
    4. 압력 모니터링 소프트웨어를 시작합니다 (LabChart 프로).
    5. 스톱 콕을 열고 부드럽게 micromanometer로부터 판독 확장기 혈압이 제로를 초과 할 때까지 풍선 식염수의 양을 증가시켜 풍선을 팽창.
    6. 천천히 수축, 길이 긴장 응답을 확인 75 mmHg로의 이완기 압력으로 천천히 풍선을 팽창하기 위해, 한 번 반복합니다.
    7. 풍선에 식염수의 양을 조절함으로써 10 mmHg로에 이완기 압력을 설정합니다. 인플레이션이 수준에서 풍선을 밀봉 마개를 돌려 LV 풍선과 압력 변환기 사이의 폐쇄 압력 시스템을 유지한다.
    8. 플라스틱 가열 챔버 커버 챔버로 낮은 마음.
  2. 광고허혈 재관류 손상의 직무
    1. 가열 된 챔버의 바닥을 연결하고 챔버 토로 버퍼에 기입 할 수 있습니다.
    2. 버퍼가 마음을 침수되면 글로벌 허혈을 유도, 마음에 버퍼의 흐름을 중지 꼭지를 켜십시오. 허혈 시간은 실험의 목적에 따라 달라질 수있다.
    3. 국소 빈혈의 30 분 후, 재관류를 시작, 마음에 버퍼의 흐름을 복원 꼭지를 켜십시오.
    4. 실험을 종료하기 전에 1 시간 동안 마음의 재관류를 허용합니다. 실험의 목적에 따라 변수 재관류 시간을 사용합니다.
  3. 실험의 종료 및 조직의 수확
    1. 꼭지의 사이드 포트를 사용하여, 10 ㎖의 속도로 마음에 4 ° C에서 인산염 완충 생리 식염수 10 ml의 관리 / 분의 마음을 체포합니다.
    2. , 관류 열에서 마음을 제거 심방 조직을 나머지 멀리 트림.
    3. 아빠 커버, 스테인레스 스틸 조직 슬라이스 행렬에 마음을 놓고8 분, 또는 마음까지 -80 ° C에서 rafilm 및 장소는 마시멜로 같은 일관성을 가지고있다.
    4. 냉장고에서 블록을 제거하고 2mm의 조각으로 마음을 슬라이스 매트릭스 슬라이스로 면도날을 삽입합니다. 조직 블록은 2mm 이외의 슬라이스 크기로 구입할 수 있습니다.
    5. 한 번에 조각 하나를 제거하고 생화학 적 연구에 동결 플래시 액체 질소에 놓습니다. 경색 염색의 정점에서 세 번째 심실 슬라이스를 유지.
    6. 생화학 실험에 사용할 때까지 -80 ° C에서 액체 질소 저장에서 조직을 제거합니다.
  4. 경색 염색
    1. 15 분 동안 37 ℃ / V의 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC) 1 % w 10ml에 제 심실 슬라이스 인큐베이션.
      주 : TTC 인큐베이션은 효율성 15에서 변화없이 15 또는 30 분 동안 수행 될 수있다.
    2. 10 % 포르말린에 TTC로부터 조직 절편을 전송하고, 밤새 실온에서 배양 할 수있다. 최적의 결과를 듣고,TS는 포르말린에서 꺼내어 24 시간 내에 4 군데해야합니다.
    3. 같은 ImageJ에 같은 사진 스테인드 조각 사용 소프트웨어는 제조 업체의 프로토콜에 따라 경색 크기를 추정한다. 염료가 시간이 지남에 따라 퇴색되므로, 고정 후 가능한 한 빨리 사진을 가져 가라.

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결과

좌심실 풍선 장치는 좌심실 수축 (도 1)에 의해 개발 된 압력의 실시간 모니터링을 허용한다. 앞서도 7과 같이,이 압접 흔적은 심실 기능 많은 매개 변수를 계산하는데 사용될 수있다. 이러한 계산은, 기준 위상뿐만 아니라 재관류 위상 이루어진 각 그룹 내에서 여러 트레이스 대하여 평균, 우리는 이전에 9했던 것처럼 약리학 적 개입, 심장 전처리에 기인 한 것인지를 결정하기 위해 비교 될 수있다. 하나의 이러한 파라미터는 수축기 혈압과 이완기 종료 압력 사이의 차이로서 계산 내압이다. 정상 관류 쥐 마음에 개발 압력이 70 ~ 130 mmHg로 (그림 1A)에 이르기까지 다양 할 수 있습니다. 허혈 후에 개발 된 압력이 감소되고, 확장기 혈압의 단부로 상승 (도 1b). 때 래트는이러한 클래스 I 및 18 심장 절제에 앞서 개발 된 압력의 감소 및 허혈 재관류 손상과 관련된 단부 ...

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토론

절연 관류 래트 심장 성공적 허혈 재관류 손상 9 심장 전처리에 약리학 적 개입의 효과를 연구하기 위해 사용될 수있다. 그러나, 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 표준화되어야 절차와 몇몇 중요한 단계가있다. 시스템 내에서 37.4 ℃의 온도를 유지하는 것은 심지어 가벼운 저체온증과 고열이 심장 컨디셔닝 10, 11의 원인이되므로 중요하다. 케타민에 장기간 노출이 심장 컨디셔닝 (12)을 방해 할 수 있으므로 마음의 절제에 마취제의 주입에서 경과 전체 시간은 최소로 유지해야합니다. 시츄 대동맥 적시 삽관 심장 절제 전에 심장 또는 동물의 방혈 내의 저산소증의 발달을 예방에 필수적이다. 전반적으로, 마음의 제거에 처음 절개까지의 시간은 더 이상 6-8 분 이상 없어야합니다. 왼쪽 심실 바lloon은 각 실험 전에 누출을 점검하고, 필요한 경우 교체해야합니다. 시스템이 심하게 각 실행 후 증류수로 전체 장치를 세척 및 배관의 내부의 누출 또는 오염을 방지하기...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 책은 사우스 캐롤라이나 의과 대학에서 학술 집, NIH / NCATS 허가 번호 UL1 TR000062로, 사우스 캐롤라이나 임상 및 중개 연구 (SCTR) 연구소에 의해 지원되었다. 추가 지원은 DRM에 버지니아 우수상 BX002327-01에 의해 제공되었다. DJH는 NIH / NCATS 허가 번호 TL1 TR000061에 의해 NIH 허가 번호 T32 GM008716에 의해 지원되었다. 바다 NIH 허가 번호 T32 HL07260에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
염화나트륨시그마 알드리치S3014
염화칼시그마 알드리치P9541
황산마그네슘시그마 알드리치203726
인산칼륨 이염기성 시그마 알드리치RES20765-A7
염화칼슘 이수화물시그마 알드리치C8106
나트륨 중탄산염시그마 AldrichS5761
D-글루코스시그마 AldrichG8270
옥탄산시그마 AldrichC2875
2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드시그마 AldrichT8877
의료용 압력 변환기MEMSCAPSP844
Masterflex 연동 펌프Cole ParmerEW-07521-40
Masterflex 이지 로드 펌프 헤드콜 파머EW-07518-10
가열 순환 수조LaudaM3
튜빙 흐름 모듈천음속TS410
모듈식 연구 콘솔천음속T402
인라인 유량 센서천음속ME2PXN
PowerLab 데이터 수집 장치AD InstrumentsPL3508
LabChart 데이터 수집 소프트웨어AD InstrumentsMLU60/8
륨

참고문헌

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