인간 만능 줄기 세포에서 전사 인자의 과발현에 의해 직접 Hemogenic 내피 세포의 유도 및 혈액

요약

이 프로토콜은 전사 인자의 강제 발현을 통해 인간 만능 줄기 세포에서 혈구 내피 및 다중전위 조혈 전구 세포의 효율적인 유도를 설명합니다.

초록

개발하는 동안, 조혈 세포가 혈관 내피 세포의 전문 집합에서 발생, hemogenic 내피 (HE). 체외에서 모델링 HE 개발은 내피 - 조혈 전환 및 조혈 사양의 기계 론적 연구에 필수적이다. 여기서, 우리는 전사 인자의 다른 세트의 과발현로서 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)로부터 HE의 효율적인 유도하는 방법을 설명한다. GATA2 TAL1 및 전사 인자의 결합은 적혈구 및 거핵 세포 가능성 HE의 생성을 허용하면서 ETV2 및 GATA1 또는 GATA2과 TF들의 조합은 팬 - 골수 가능성 HE를 유도하기 위해 사용된다. GATA2 및 TAL1 조합에 LMO2의 추가는 실질적으로 차별화를 가속화하고 적혈구와 거핵 세포 세포의 생산을 증가시킨다. 이 방법에서 hPSCs HE 유도 효율적이고 빠른 방법을 제공하고 내피 hematopoieti의 관찰을 허용배양 접시에서 C 전환. 이 프로토콜은 hPSCs 전달 절차 및 HE의 후 전달 분석 및 혈액 전구 세포를 포함한다.

서론

자기 갱신과 혈액을 포함한 세 가지 배엽의 세포로 분화하는 조혈 개발의 역학적 연구에 그들에게 가치있는 도구를 만들어, 혈액 질환의 모델링, 약물 검사에 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)의 독특한 능력, 독성 연구 및 세포 요법의 개발. 내피 조혈 전환 ^{1, 2를} 통해 (HE) hemogenic 내피 세포에서 배아 진행 혈액 형성, 문화 HE의 발생 조혈 전환 및 조혈 사양 내피 조절 분자 메커니즘을 연구하는 것이 필수적 것 때문에. 그는 연구에 대한 현재의 방법은 조혈-지지 기질 세포 ^6,7 또는 세포 외 두 개의 차원 문화 hPSCs의 조혈 사이토 카인 ^3-5의 추가와 골재 (사채)에서 hematoendothelial 분화 유도 및 공 배양을 기반으로 행렬과 C^8,9 ytokines. 이러한 고전 분화 방법은 세포 표면에서 작용하는 결국 hematoendothelial 개발을 유도 전사 프로그램의 활성화로 이어질 분자 경로 캐스케이드를 개시하는 외부 신호의 도입에 기초한다. 따라서, 이러한 시스템에서의 분화 hPSCs의 효율은 그 신호의 효과적인 유도 핵 신호 전달 및 특정 전사 레귤레이터 얻어진 활성화에 의존한다. 또한, 기존의 분화 배양 년의 연구는 세포 정렬을 사용하여 HE에게 세포를 분리하는 추가 단....

프로토콜

1. 바이러스 준비 및 전사 인자 조합

1. pSIN-EF1α 렌티 바이러스 발현 플라스미드 ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 및 LMO2 (표 1)에 대한 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 솔루션을 준비합니다.
2. 230 나노 미터, 260 나노 미터, 그리고 280 nm에서 분광 광도계 UV 흡수를 기록하여 렌티 바이러스 생산을 위해 사용 된 플라스미드 제제의 농도 및 순도를 측정한다. 참고 : 1.8보다 큰 DNA 준비 시연 A260 / 280과 A260 / 230의 값은 일반적으로 좋은 품질로 간주됩니다. 저급 A260 / 230 값이 염 또는 일부 용제와 같은 페놀 불순물을 표시하면서 하부 A260 / 280 값은 단백질 오염을 나타낼 수있다. 권장 플라스미드 농도는 1-3 μg의 / μL이다.
3. 이전에 발행 된 프로토콜 ^(11)에 설명 된대로 transductions에 대한 렌티 바이러스를 생성합니다. 팬 골수 잠재력을 가진 그는 유도는 ETV2 및 GATA1, 또는 ETV2 및 GATA2의 공동 발현을 필요로한다.적혈구와 거핵 세포 잠재력을 가진 그는 유도는 GATA2 및 TAL1을 필요로한다. LMO2 첨가 크게 GATA2 TAL1 및 ^(10)의

결과

GATA2가, TAL1는 +/- LMO2 조합은 주로 에리스로 거핵 세포 조혈을 유도하면서 그와 전사 인자의 과발현에 의해 hPSCs에서 혈액 유도의 개략도는 팬 골수 조혈을 유도 GATA1 또는 GATA2 조합 그림 1. ETV2에 표시됩니다. 두 TF 조합 직접적이어서 조혈 분화 구별 스펙트럼 혈액 선조로 변환 HE 세포를 유도. 혈액 만능 상태에서 hPSCs의 차별화 그는 평균 사일 취 생산. 둥근 혈액 세포의 분화는 제 5 일에 의해 등장. 그 후, 다수의 부동 혈액 세포가 표시와 문화에 확장합니다. 혈액 세포를 부동의 수를 최대화하기 위해, 포스트 - 형질 배양 10-14 일 동안 연장 될 수있다. 세포 계보 원하는 조혈 사이토킨의 적절한 조합으로 둘러 접착 조건으로 확장 될 수있다.도 2의 DEMonstrates ETV2을 사용 hPSCs 및 GATA1 또는 GATA2과 TF에서 혈액의 유도. ETV2과 GATA2와 전달에 이어, 세포 분화의 날 (4)에 .......

토론

TF가의 과발현 hPSCs의 조혈 분화 상기 방법은 인간 배아 줄기 세포 및 이에 최대 30 수백만 혈액 세포의 생산에서 허용 iPSCs로부터 HE 및 골수와 erytho-magakaryocytic 전구 세포의 생성을위한 빠르고 효과적인 방법을 나타낸다 백만 만능 줄기 세포 ^(10). 이 방법은 다수의 hESC iPSCs 및 라인 ^(10)에 일관된 분화를 나타내었다. ETV2 및 GATA2로 분화하는 동안, GATA1 요인뿐만 아니라 GATA2 및 TAL1 요인, 세포, 그는 혈액 생산 내피 세포를 형성하고 조혈 전환에 내피를 받다. HE의 형성은 일반적으로 3 일 및 분화 (4) 사이에 관찰된다. 그는 무대가 현저하게 축소 된 반면 LMO2, TAL1의 전사 보조 인자를 첨가, GATA2 및 TAL1 조합에 크게 분화의 견고성을 증가했다.

감독 differentia의 성공전사 인자에 의해 hPSCs 기의 중심 (I)의 세포 내로 핵산의.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
표 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.
pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61061	렌티바이러스 벡터
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61063	렌티바이러스 벡터
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	렌티바이러스 벡터
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	렌티바이러스 벡터
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61064	렌티바이러스 벡터
헥사디메트린 브로마이드(폴리브레네)	감염 효율을 높이기 위해 사용되는	Sigma-Aldrich	107689-10G
Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK 억제제	STEMCELL Technologies	72302	RHO / ROCK 경로 억제제
ROCK StemPro Accutase 세포 해리 시약	Life Technologies	11105-01	세포 해리 시약
불완전(성장 인자 없음) 배양 배지                                                                                          mTeSR1 맞춤형 제형	WiCell Research Institute(위스콘신주 매디슨)	MCF	무혈청 mTeSR1 매체;
human SCF	Peprotech	300-07	프리미엄 등급
human TPO	Peprotech	300-18	연구 등급
human FGF-basic	Peprotech	100-18B	프리미엄 등급
CD144 (VE-cad) FITC	BD Biosciences	560411	Endothelial marker (FACS)
CD226 PE	BD Biosciences	338305	Hematopoietic ( FACS)
CD43 PE	BD 생명과학	560199	조혈(FACS)
CD73 APC	R& D 시스템	FAB5795A	내피 마커 (FACS)
CD45 APC	BD Biosciences	555485	Hematopoietic (FACS)
7AAD	Life Technologies	A1310	Live/Dead assay (FACS)
파라포름알데히드	시그마-알드리치	P6148-500G	세포 고정
트리톤 X-100	시그마-알드리치	T9284-500ML	투과성
FBS	Fisher Scientific	SH3007003	소 태아 혈청
마우스 anti-human CD43	BD Biosciences	551457	순수, 면역형광(IF) 염색을 위한 1차 항체
Rabbit anti-human VE-cadherin	BenderMedSystem	BMS158	Primary (IF)
Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated	JacksonResearch	715-486-152	Secondary (IF)
안티-마우스 Alexa Fluor 594-conjugated	JacksonResearch	715-516-150	보조(IF)
DAPI 핵산 염색	Life Technologies	D1306	Live/Dead 분석(IF)
클론 생성 매체 MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	4435	CFC-assay
Wright 염색 용액	Sigma -Aldrich	32857	염색 cytospins
표 2. hPSCs culture.
인간 만능 줄기세포(hPSC)	WiCell Research Institute (Madison, WI)	hESCs (WA01, WA09) 인간 배아 줄기 세포; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) 유전자 전이 없는 유도 만능 줄기 세포	hPSCs는 자가 재생이 가능하고 세 개의 배아층의 세포로 분화할 수 있습니다.
hPSCs의 배양을 위한 완전한 무혈청 매체;                                                                                                     mTeSR1 미디어	WiCell 연구소(위스콘신주 매디슨)	M500	무혈청  ESC/iPSC의 무급유 배양을 위한 성장 인자를 가진 배지
Matrigel	BD Biosciences/ 코닝		인간 ESC/iPSCs
DMEM/F-12의 유지를 위한 356234 매트릭스, 분말	Life Technologies	12500-062	기초 매체
HyClone Dulbecco's PBS powder	Fisher Scientific	dSH30013.04	PBS
Dispase II, powder	Life Technologies	17105-041	중성 프로테아제, 세포 해리
표 3. 바이러스 게놈 통합 검출을 위한 프라이머.
프라이머 이름	<스트롱>포워드(Fwd)  5' -->3'	Reverse (Rev) 5'-->3'	Discription
pSIN EF1a Fwd	TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA-	-	EF1a 프로모터 서열
GATA1 Rev	-	-TCC CTG 태그 태그 GCC AGT GC	코딩 영역
GATA2 Rev	--	GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG&	NBSP; 코딩 영역
TAL1 Rev	--	AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT	코딩 영역
LMO2 Rev	--	GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC	&NBSP; 코딩 영역
ETV2 개정판	--	GAA CTT CTG GGT GGA GTA AC	코딩 영역

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