우리는 단순화된 (아날로그) 판독으로 핵산을 정량화하기 위한 종말점 디지털 분석을 설명합니다. 당사는 특수 기기가 아닌 표준 qPCR 기계를 사용하여 액적 기반 디지털 분석의 벌크 형광을 측정하고 현미경 검사로 결과를 확인합니다.
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이 논문에서
요약
초록
디지털 분석은 세포 및 희소 개별 핵산 분자의 계수의 검출을 가능하게 강력한 방법이다. 그러나 디지털 분석은 일상적으로 인한 비용과 시중에서 판매하는 방법과 관련된 특정 장비에 적용되지 여전히. 여기서 우리는 액적 기반 디지털 벌크 분석법 형광을 측정하는 종래의 실시간 PCR 기기를 사용하여 디지털 액적 분석의 판독을 위해 단순화 된 방법을 제시한다.
우리는 합성 액적 혼합물 및 액적 디지털 다중 변위 증폭 (MDA) 분석을 이용하여 벌크 분석의 판독 성능을 특성화. 디지털 반응 형식에서 양적 MDA는 특히 이점, 그러나 우리의 새로운 방법은 모든 디지털 분석에 적용됩니다. 디지털 PCR 등의 설립 디지털 분석 프로토콜의 경우,이 방법은 속도와 분석 판독을 단순화하는 역할을한다.
우리 벌크 판독 partitione 방법론의 장점을 가져온다전문 판독 장비가 필요없이 D 분석. 이 표준에 대한 요구가 종래의 실시간 실험보다 덜 까다로운 있지만 벌크 판독 방법의 주된 제한, 액적 계산 플랫폼 및 표준 시료에 대한 필요성에 비해 동적 범위가 감소된다. 정량적 전체 게놈 증폭 (WGA)는 WGA 반응에서 오염물을 테스트하는 데 제약 품질 제어 및 우주 생물학 등 다양한 응용 분야에있어서 큰 가능성을 제공 미지 서열과 함께 DNA 단편의 존재를 검출하기위한 가장 민감한 방법이다.
서론
핵산 정량 (디지털 PCR) 1-4 및 기본 순서 (서열)에 대한 디지털 분석은 강하게 생명 과학 및 의학에 영향을하고 있습니다. 디지털 분석은, 높은 감도를 제공하는 실험을 통해 용이 한 비교를 가능하게하고, 결정적으로, 비교 데이터 (5) (표 1)을 함유하는 큰 데이터베이스의 구성을 가능하게 절대치 스케일 (제어에 대해 생략)에 분자 계수의 정량화를 제공한다.
지난 15 년 동안, 전체 게놈 증폭 (WGA)은 핵산 증폭 용 PCR 일반 공구로 나란히 나타났다. PCR 원한다면, WGA는 용이하게 검출 또는 염기 서열 분석 등 후속 분석을 위해 사용할 수있는 레벨까지 분 샘플을 증폭 소자에 의해 분석하고 예비 애플리케이션에 유용하다. PCR 달리 WGA 오히려 미지 서열을 포함한 시료 중의 모든 서열의 증폭을 허용하는, 특정 DNA 유전자좌에 특이하지 않다.PCR 및 WGA 간의 기본적인 차이점은 서로 상보 만드는 방법 및 그 응용이 다른 과제가 발생한다.
WGA 반응 (6)의 높은 수율은 단일 분자 (7), 단일 세포 (8) 및 정량 또는 추가 분석을 위해....
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프로토콜
주 :이 프로토콜은 기존 상업용 방울 방울 결정자 23,29 형성 할 수있는 미세 유체 소자를 제작하는 단계, 상기 분석에 대한 필요가 없다.
1. 물방울 형성 미세 유체 소자를 확인
- SU-8 마스터 제조 프로토콜에 채널 마스터 주형을 제조 이전 31 약술하지만 방울 생성기 마스크 패턴 (32).
- 소프트 리소그래피 (32, 33)의 기술을 이용하여 PDMS의 장치를 제작.
2. 대량 물방울 판독에 대한 반응 믹스를 준비
주 : 프로토콜은 증폭 반응의 다양한 형태를 사용하여 핵산을 정량하는데 사용될 수있다. 예로서, 몇몇 람다 DNA 농도 MDA 필요한 시약 주어진다. 시약 세부 사항은 특정 시약의 표에 나열되어 있습니다. 액적 내의 템플릿의 분포에 의존 sufficien시료의 t 혼합.
- 구하거나 Purify를 Phi29 DNA 중합 효소.
- 이전에 공급 업체로부터 7 또는 구매 한 바와 같이 Phi29를 정화. 도시 된 실험에 사용 ....
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결과
종래의 벌크 / 실시간 정량적 PCR이 판독 및 WGA 정량 분석 (도 1) 모두에 사용될 수 있지만, 디지털 정량 분석은 이점이있다 (표 1)을 제공한다. 기재된 방법에서는 단순한 벌크 종료점 측정 (도 2)과 미세 액적 형태로 디지털 분석법을 판독. 이 방법은 광범위하게 적용 할 수 있지만이 방법은 기존의 실시간 분석을위한 특별한 도전을 제시하기 때문에, 우리는 양적 WGA (MDA)에 초점을 맞추고있다.
우리의 실시간 PCR 장비는 오일에 분산 형광 미세 방울의 다양한 분수를 감지 할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 우리는 형광과 비 형광 방울 (그림 2)의 합성 혼합물의 대부분 형광을 측정 하였다. 벌크 형광 양성 액적 카운트 (독립적 형광 현미경에 의해 평가)이 예상대로 (형광 방울의 입력 부분과 선형 스케일도 3a).
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토론
디지털 분석법 희귀 세포의 검출 및 핵산 분자의 개인의 계산을 가능하게 강력한 방법이다. 그러나, 디지털 분석은 여전히 통상적으로 시판되는 방법과 관련된 특수 장비의 비용을 부분적으로 분석 실험실에서 기인인가되지 않는다. 여기서 우리는 표준 정량 실시간 PCR 기계를 사용하여 단순화 된 아날로그 판독하여 핵산을 정량 종점 디지털 분석법을 설명한다. 이 방법은 설정 신속하고, 판독 방울 계산 방법보다 훨씬 간단하다.
우리의 분석은 표준 장비를 사용하여 한꺼번에 종점 측정 편의상 개별 액적 측정 단일 분자 (단일 액적) 감도 상실. 우리의 디지털 MDA 실험에서 우리는 형광 현미경 실제 FRA의 확인에도 불구하고, 배경에서 200 부정적인 방울 당 1 개의 긍정적 인 물방울보다 구별 할 수 없습니다긍정적 인 방울의 ction의 (그림 4) 예상대로. 대량 형광 측정 한계에 감도와 배경 낮은 양의 물방울 분수의 대량 측정 분석의 감.......
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공개 사항
Broad Institute는 이 작업의 측면을 포함하는 특허 출원을 제출하기 위해 움직일 수 있습니다.
감사의 글
저자는 MDA 시약 및 프로토콜을 제공한 Liyi Xu에게 감사를 표합니다. 또한 이 작업과 관련된 토론에 대해 David Feldman과 Navpreet Ranu에게 감사드립니다. 이 작업은 Scientific Interface to PCB에서 Burroughs Wellcome Career Award의 일부 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Evagreen 염료 | Biotium | 31000 | |
| 소 혈청 알부민 | New England Biotechnologies | B9000S | |
| Phi29 DNA 중합효소 반응 버퍼 | New England Biotechnologies | B0269S | 를 용해할 때까지 주기적으로 Vortex |
| New England Biotechnologies | N3011S | 50 oC로 가열하고 담금질 희석 전 얼음 | |
| 무작위 MDA 올리고 | 통합 DNA 기술 | 5'-NNNNN*N-3'PCR | |
| 프라이머 | 통합 DNA 기술 | 5'-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3' 및 5'-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3' | |
| UltraPure Nuclease-free water | Life Technologies | 10977-015 | 사용 전 Stratalinker 2400에서 30분 동안 UV 처리(선택 사항) |
| ROX 참조 염료 | Life Technologies | 12223-012 | |
| PCR 광학 스트립 캡 | Life Technologies | 4323032 | |
| PCR 튜브 | Agilent Technologies | 401428 | |
| dNTP(각 25마이크로몰) | Agilent 기술 | 200415 | |
| Thermocycler - Mx3000P qPCR 시스템 | Agilent Technologies | 401403 | |
| 배리어 피펫 팁 | VWR | 89003-046 | |
| Bio-rad | 186-4005 | ||
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893-100RXN |
참고문헌
- Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).
- Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res.
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