방법 논문

실험 시신경의 탈수 초화의 쥐 모델에서 시각 유발 전위 기록

DOI:

10.3791/52934

⸱

2015년 7월 29일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Australian School of Advanced Medicine, Macquarie University, 2Save Sight Institute, The University of Sydney

이 논문에서

요약

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국소 탈수초화는 리솔레시틴 미세주입을 사용하여 시신경에서 유도됩니다. 시각 유발 전위는 생체 내에서 시각 경로를 따라 신호 전도를 검사하기 위해 시각 피질에 이식된 두개골 전극을 통해 기록됩니다. 이 프로토콜은 전극 이식 및 시신경 미세 주입의 기초가 되는 수술 절차를 자세히 설명합니다.

초록

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VEP(Visual Evoked Potential) 기록은 급성기에서 시신경염의 중증도를 평가하고 추적 관찰 기간 동안 질병 경과를 모니터링하기 위해 임상 실습에서 널리 사용됩니다. VEP 매개변수의 변화는 시신경의 병리학적 손상과 밀접한 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 시신경에서 부분적인 탈수초 병변이 생성되는 시신경 미세주입의 설치류 모델에 대한 자세한 설명을 제공합니다. VEP 기록 기술에 대해서도 설명합니다. 두개골 이식 전극을 사용하여 재현 가능한 세션 내 및 세션 간 VEP 추적을 얻을 수 있습니다. VEP는 시신경의 기능적 변화를 종단적으로 평가하기 위해 일정 기간 동안 개별 동물에 기록될 수 있습니다. VEP 기록 프로토콜과 함께 시신경 탈수초 모델은 탈수초화 및 재수초화와 관련된 질병 과정을 조사하기 위한 도구를 제공하며, 잠재적으로 새로운 재수초화 약물 또는 신경 보호 요법의 효과를 평가하는 데 사용될 수 있습니다.

서론

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시신경염은 시신경병증의 가장 흔한 형태 중 하나로, 시력의 완전 또는 부분적 상실을 유발합니다1. 조직학적으로, 그것은 염증성 탈수초화, 망막 신경절 세포 축삭 손실 및 시신경의 다양한 정도의 수초화에 의해 특징지어집니다2. 시신경염은 일반적으로 다발성 경화증의 명백한 발병입니다. VEP(Visual Evoked Potential)는 시각 시스템의 기능을 조사하기 위한 비침습적 도구입니다. 이는 망막에서 1차 시각 피질에 이르는 망막 후 기능을 반영하며, 많은 시신경 질환 상태에 영향을 받습니다3. VEP는 주로 시신경염 환자에서 시각 경로의 무결성을 평가하기 위해 사용되어 왔습니다4.

시각 경로를 따라 신호 전도의 속도를 반영하는 VEP의 잠복기는 시신경의 수초 관련 변화 수준을 정확하게 측정한 것으로 간주됩니다5; VEP의 진폭은 망막 신경절 세포(RGC)의 축삭 손상과 밀접한 상관관계가 있는 것으로 여겨집니다6. 이 가설은 리솔레시틴 유도 시신경 탈수초화(lysolecithin-induced optic nerve demyelination)5의 랫트 모델을 사용하여 상당히 잘 확립되었습니다.

여기에서는 설치류의 시신경 미세주입 기술에 대한 포괄적인 프로토콜을 설명하며, 이는 안구 외 근육 및 혈관과 같은 인접 조직뿐만 아니라 신경 자체에 대한 외과적 조작 관련 손상을 최소화할 수 있습니다. 또한, 두개골 전극 이식 수술은 동물의 VEP 기록을 위해 기술되어 있다7. VEP 기록은 탈수초/재수초화 관련 변화와 시신경의 축삭 무결성에 미치는 영향을 평가하기 위해 일정 기간 동안 동물에 대해 반복적으로 수행할 수 있습니다.

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프로토콜

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윤리 문 : 동물과 관련된 모든 절차는 관리 및 과학적인 목적을위한 동물의 사용 및 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 방침의 지침 연습 호주 코드에 따라 수행되었으며, 승인했다 맥쿼리 대학의 동물 윤리위원회.

1. VEP 전극 주입

  1. 복강 내 주사 케타민 (75 ㎎ / ㎏) 및 메데 토미 (0.5 밀리그램 / kg)으로 동물을 마취.
    마취의 유도에 따라 수술을 시작하는 표시로 철수 반사 (핀치 검사, 각막과 눈꺼풀 반사 등)과 부재을 준수합니다. 수술 내내 계속 동물을 모니터링하고 반사가 존재하는 경우 추가 마취약 (상위 - 업 케타민 당 초기 용량의 10 %)을 관리. 성인 쥐 (> 12주)는 실험에 사용된다.
  2. 외과 영역의 피부를 면도.수술 중 체온을 유지하기 위해 온난화 패드 (37 ° C)에서 동물을 놓습니다. 포비돈 - 요오드의 국소 응용 프로그램을 통해 피부를 준비합니다. 수술 입체 재단을 적용합니다. 전신 마취하에 각막 건조를 방지하기 위해 국소 안과 연고를 적용합니다. 멸균 악기를 사용하여 무균을 유지한다.
  3. 헤드 피부의 중간 선에 길이의 피부 절개를합니다. 두개골의 좋은 노출을 달성하기 위해 결합 조직을 취소합니다.
  4. 조심스럽게, 수동으로 브레 그마 뒤에 7mm과 중간 선에 3mm 측면에서 마이크로 핸드 드릴을 사용하여 작은 버 구멍을 드릴.
  5. 약 0.5 mm의 깊이로 피질을 관통하는 피질 (영역 (17))에 두개골을 통해 임플란트 나사 전극. 브레 그마로 정중선 3mm의 입쪽에 기준 나사 전극을 이식. 나사를 싸는하고 해결하기 위해 치과 시멘트를 적용합니다 (항상 필요하지 않음).
  6. RECO하는 동물을 머리의 피부 봉합 피부에 항생제 연고를 관리 허용버전 온난화 패드에 마취에서.
    주 : 대안 적으로, 전극이 노출 남아있을 수 있다는 것을 피부에서 각각의 기록 재개 할 필요가없는, 그래서. 수술 전에 즉시하지만 마취 회복의 정지시에, 비 스테로이드 성 항 염증 약물 (NSAID) (아니라면 사전에 동작 투여) 또는 아편 유사 진통제를 투여. 마취 완전히 외래에서 완전히 회복 될 때까지 지속적으로 동물을 모니터링합니다.
  7. 동물이 수술의 사전 VEP 기록을 복구하는 적어도 일주 허용합니다.

2. 시신경 주입

  1. , 동물을 마취 피부를 준비하고 (1.1 및 1.2) 이상으로 드레이프 적용됩니다.
  2. 무작위로 선택된 눈의 궤도 위의 피부에 1 - 1.5 cm의 절개를합니다. 미세 홍채 가위를 사용하여 궤도 캐비티에 도달하기 위해 피하 조직을 엽니 다. 결막을 열고 운영 현미경으로 장부의 캡슐을 전방.
  3. 안구 후퇴근육과 intraobital 눈물 분비는 시신경의 약 3mm 길이를 노출합니다. 길이 방향으로 안과 블레이드를 사용하여 시신경 주위의 경막과 지주막 물질 층을 엽니 다.
  4. 세계에 2mm 후방의 거리에서 시신경에 유리 피펫을 삽입합니다. 유리 마이크로 피펫은 해밀턴 주사기에 부착된다.
  5. 약 30 초에 걸쳐 천천히 신경으로 - (수초에 효과가없는 0.02 % 에반 블루와, 1.0 μL, 0.4), 1 % 리소 레시틴을 주입한다.
  6. 피부 절개 봉합. 감염을 방지하기 위해 항생제 연고를 적용합니다. 동료의 눈은 전기 생리학 레코딩을위한 내부 통제 역할을 할 수있다.
  7. 마취에서 회복 온난화 패드에 동물을 놓습니다.

3. VEP 기록

  1. 동물을 마취하고 1.1 및 1.2로 피부를 준비합니다.
    참고 : 마취제의 낮은 복용량은 전기 생리 RECO 사용할 수 있습니다rding (케타민 40 ㎎ / ㎏과 0.25 ㎎ / ㎏을 메데 토미).
  2. 어두운 방에서 쥐를 놓고는 5 어둠에 적응 할 수 - 30 분. 어떤 경우에는 쥐가 각각 포토 픽 VEP 녹음 8 적응 암순응 또는 빛 어두운 적응 O / N이 될 수 있습니다.
  3. 직장 온도계 프로브 homoeothermic 블랭킷 시스템에 의해 37 ± 0.5 ℃의 체온을 유지한다.
  4. 1.0 % tropicamide 눈 방울과 학생들을 팽창. 액세스하기 위해 두개골을 통해 피부를 열고 사전 배치 현장 나사 전극에서.
  5. 자극 눈의 반대편 시각 피질과 앰프에 대한 참조 나사를 통해 나사를 연결합니다. 지상으로 꼬리에 바늘 전극을 삽입합니다. 측정하고 5 kΩ의 아래 전극 임피던스를 유지한다.
  6. 뛰어난 눈 절연 (7)을 제공하기 위해 눈꺼풀 주위의 피부에 직접 미니 Ganzfeld 자극을 놓습니다. 자극기의 조명이 미리 보정해야광도계에 의해.
  7. 각각 1 내지 100 Hz의 낮은 및 높은 밴드 패스 필터 설정을 1 Hz의 주파수에서 빛을 깜박 100 회 빛의 자극을 전달한다. 신호 샘플링 레이트는 5 kHz에서이다.
    참고 : 신호는 적어도 약 250 샘플링한다 - 더 두 개의 샘플은 각주기 동안 수집되는 것을 보장하기 위해 300 Hz에서.
  8. 다시 피부를 봉합하고 마취에서 회복하기 온난화 패드에 동물을 유지. 녹화 반복 시간 기간 동안에 기능적 변화를 모니터링하기 위해 각각의 동물에 기록 될 수있다.
  9. 최종 시점에서, 동물을 안락사 나트륨 펜토 바르비 톤 (100 밀리그램 / kg, IP)의 과다 주사를 관리. 심장 마비, 호흡 정지 및 체온의 감소에 의해 안락사를 확인합니다.

4. 조직 준비 및 조직학

  1. 현미경으로 안락사 동물에서 시신경을 제거하고 1 % 파라 포름 알데히드의 O / N의 조직을 고정합니다.
    2. <리> 식염수로 철저하게 조직을 씻으십시오. 자동 조직 프로세서에서 처리하고, 조직을 파라핀에 포함. 회전식 마이크로톰을 사용하여 - (10 μm의 5) 컷 섹션.
    참고 : 면역 조직 화학 연구를 들어, 1 % 파라 포름 알데히드에 조직을 고정 식염수로 세척하고 30 % 자당 O / N로 품어. OCT에서 임베드 조직 매체를 포함하고 저온 ​​유지 장치를 사용하여 저온부을합니다.
  2. 56 ° C에서 같은 룩솔 (95 % 에탄올) O / N으로 0.1 % 빠른 블루 솔루션 섹션을 품어. 다음 다른 30 ​​초 70 % 에탄올을 30 초 동안 0.05 %의 탄산 리튬의 섹션을 차별화하고. 마지막 섹션을 장착하기 전에 30 초 동안 0.1 % 크레 실 바이올렛 용액 Counterstain과. 시신경 5 수초를 식별하기 위해 빠른 파란색 염색을 사용합니다.

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결과

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재현성 인트라 셔널 VEP 트레이스는도 1에 도시되어 있으며 대기 N1에서 상당한 지연은 시신경 주입 후에 알 수있다. 탈수 초화의 부분 시신경 병변 룩솔 패스트 블루 염색법을 이용하여 조직 학적 5 절에서 발견 될 수있다. 2 시신경의 중심에 작은 초점 탈수 초 병변 대표적인 부분을 도시한다. 단면은 병변의 총 부피를 대표하지 않습니다. 탈수 초 영역 삼차원 재구성을 사용하여 병소 용적을 추론 신경의 각 연속 단면에서 측정 될 수있다. 우리는 우리의 이전 연구에서이 모델을 사용하여 대기 시간 지연 및 병변 볼륨 사이에 강한 상관 관계를 증명하고 식염수 주입 컨트롤 5에는 VEP 대기 시간 지연이 없었다.

이것은 플래시 조명 다음 초기 VEP 성분보다 안정한 것으로 여겨진다 7 5 탈수 초화와 강한 선형 관계...

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토론

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시신경은 기계적 손상에 매우 취약합니다. 1초 동안 시신경 압착 손상은 2주 동안 RGC의 약 75% 손실로 이어질 수 있습니다10. 따라서 수술을 시행하는 동안 각별한 주의가 필요합니다. 저자의 경험에 따르면, 시신경에 수직 방향으로 관통하는 것보다 신경의 방향을 따라 시신경 주변 조직을 노출시키고 통과하도록 무딘 해부 접근법을 적용하는 것이 훨씬 낫습니다. 또한 경막과 지주막은 RGC 축삭에 대한 축소절개술과 같은 손상을 피하기 위해 세로로 풀어야 합니다. Evan의 파란색은 일반적으로 염료의 존재가 주사 부위의 신경을 연한 파란색으로 만들기 때문에 미세 주사를 용이하게 하는 데 사용됩니다.

VEP 기록의 재현성은 이 실험에 매우 중요합니다. 다양한 유형의 마취제와 마취 깊이가 VEP 파형에 영향을 미칠 수 있습니다11. 이소플루란은 아마도 GABA성 활성으로 인해 뇌파 반응12에 대한 파열 억제로 이어질 수 있으므로...

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공개 사항

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저자 중 누구도 경쟁하는 이해관계나 상충되는 이해관계를 가지고 있지 않습니다.

감사의 글

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이 연구는 호주 안과 연구소 (오리 아)에 의해 지원되었다. 우리는 처음에 VEP 기록 기술을 개발하기 위해 우리를 도와, 교수 Algis Vingrys 박사 빅뱅 부이, 멜버른 대학 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
케타민 100 mg/ml (Ketamil)Troy LaboratoriesAC 116
Medetomidine 1 mg/ml (Domitor)Pfizersc-204073
Tropicamide 1.0% (Mydriacyl)Alconsc-202371
Homoeothermic blanket systemHarvard ApparatusNC9203819
Impedance meter 잔디F-EZM5
나사 전극 마이크로 패스너M1.0× 3mm Csk 슬롯 M/T 304 S/S
피하 바늘 전극 잔디F-E3M-72
빠른 수리 DeguDent GmbH
발광 다이오드 니치아NSPG300A
바이오앰프CWE, Inc.BMA-400
CED 시스템Cambridge Electronic Design, Ltd.Power1401
해밀턴 주사기 해밀턴87930
리솔레시틴시그마L4129
에반 S 블루 시그마E2129

참고문헌

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  6. You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Gupta, V. K., Graham, S. L. Axonal loss in a rat model of optic neuritis is closely correlated with visual evoked potential amplitudes using electroencephalogram based scaling. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3662(2012).
  7. You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis. Doc Ophthalmol. 123 (2), 109-119 (2011).
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