세포 이동은 인간의 발달과 생활에서 중요한 부분을 차지합니다. 세포 이동을 변경할 수 있는 메커니즘을 이해하기 위해 3D 콜라겐 매트릭스에서 화학주성을 조사할 수 있는 평면 구배 확산 시스템을 제시하여 기존 분석법의 최신 확산 챔버 한계를 극복할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
세포 이동의 중요성은 인간 생명의 발달을 통해 볼 수 있습니다. 세포가 이동할 때 힘을 생성하고 이러한 힘을 주변 영역으로 전달하여 세포의 이동과 이동을 유도합니다. 세포 이동을 변경 및/또는 영향을 미칠 수 있는 메커니즘을 이해하기 위해 이러한 힘을 연구할 수 있습니다. 이론적으로 세포 이동의 기저에 있는 근본적인 메커니즘과 힘을 이해하는 것은 질병을 치료하고 세포 이식을 촉진하기 위한 효과적인 접근 방식을 약속합니다. 안타깝게도 개발된 최신 화학주성 챔버는 일반적으로 2차원(2D)으로 제한되며 복잡한 확산 구배를 가지고 있어 실험을 해석하기 어렵습니다. 이를 위해 우리는 화학주성 연구를 위한 직접 관찰 챔버를 개발했으며, 이 백서에서는 이를 통해 3D 환경에서 챔버 내 세포력과 특정 농도를 측정할 수 있는 최신 화학주성 챔버 장애물을 극복하고 세포 3D 이동을 연구할 수 있다고 설명합니다. 더욱 매력적인 이 접근 방식을 사용하면 3D 콜라겐 매트릭스를 통한 확산을 성공적으로 모델링하고 다양한 콜라겐 농도를 통한 화학유인물질의 확산 계수를 계산하는 동시에 견인력 현미경(TFM) 및 디지털 부피 상관(DVC) 분석을 위해 시스템을 단순하고 사용자 친화적으로 유지할 수 있습니다.
서론
화학 주성으로 공지 된 농도 구배를 향해 세포의 바람직한 움직임, 신체의 병리 생리 학적 과정에 중요한 역할을한다. 이러한 예로는 피부와 점막 상처 치유 1, 2 형태 형성, 염증 3 및 종양 성장 4,5-이다. 또한, 암세포가 모두 개인과 단체 셀 마이그레이션 전략 1-6 이주 할 수 있다는 것으로 알려져있다. 또한, 확산 불안정성 메커니즘 영양소 원을 향해 이민 따라서 넓은 영역 및 조직 7 침입 수 후 종양 바디 / 물체로부터 단일 클러스터 또는 세포의 분리를 유도하고있다.
또한, 다양한 이동 메커니즘으로 인해 부착 분자 (8)의 다른 역할로, 2 차원에서 3 차원으로 활성화 될 수 있음을 보여왔다. 따라서, 체외 분석에 생리 학적으로 관련에 이동 measureabl에서 세포 운동성을 조사하기 위해즉 간단한 방법은 세포 이동 현상 이해 9에 중요하다. 불행히도, 세포 이동을 분석하는데 어려움이 광범위한 정량 화성 분석은 일반적으로 공평한 세포 운동성 및 이동 현상 모델의 측정에 기초하고 긴 힘드는 방법을 필요로한다.
세포의 화학 주....
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프로토콜
1. 3 차원 금형 설계 및 부품
- 곰팡이
- 작업을 시작하기 전에, 실리콘 엘라스토머 키트 생균 촬상 챔버 22mm 유리 커버 슬립, 및 치수 10.07 mm X 3.95 mm X 5.99 mm와 가공 알루미늄 금속 큐브를 얻었다. 바닥 홀더 커버 슬립을 배치하고 공급 업체의 지시에 따라 실의 나머지 부분을 조립하여 성형 용 라이브 세포 이미징 챔버를 준비합니다.
- 다음에, 집게를 사용하여, 생균 촬상 챔버 하우징의 중간과 커버 슬립 위에 가공 된 알루미늄 금속 덩어리를 배치 한 다음 방치.
- 엘라스토머 5 mL로 제조자의 프로토콜에 따라 실리콘 엘라스토머 솔루션을 섞는다.
- 일회용 랩 주걱을 이용하여, 생균 촬상 설정 챔버로 실리콘 엘라스토머 용액을 부어 배치 가공 된 알루미늄 금속 큐브를 이동하지 않도록 보장한다. 경화 안전한 위치 O / N에서, 실험실 벤치에 시스템을 놓습니다.
- 다음날 아침, 해체라이브 세포 이미징 챔버는, 제조업체가 권장하고 집게를 사용하여 곰팡이를 잡아 당깁니다. 집게를 사용하여 조심스럽게 금형에서 가공 된 알루미늄 금속 큐브의 압축을 풉니 다. 싱크대로 가서 탈 이온수로 금형을 씻어. 건조 종이 타월에 금형을 놓습니다.
- 일단 드라이, 취미 유틸리티....
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결과
정확하게 세포의 이동을 평가하기 위해이 분석의 능력은 시스템의 좋은 설정에 의존한다. 따라서, 정확하게 확산 시스템 금형을 설계하고,도 1에 도시 된 바와 같이, 소수성과 친수성을 모두 커버 슬립을 배치에 상당한주의를 기울 반드시 중요하다. 시스템이 적절하게 설계하고 매우를 찾을 보장 확산 모델링 단계에서되면 시스템의 확산을 분석하기 위해,도 2에 도시 된 바와 같이 하나의 좋은 달성 할 수있는 선형 시작 라인 좋은 이미지를 형광.
성공적인 세포 주 화성 분석의 핵심은 확산 모델링 및 소프트웨어 연산으로 생성 된 코드를 통해 확산 및 특정 농도 방정식의 계수를 발견하는 일반적인 확산 방정식을 해결한다. 분석을 계산 소프트웨어로 이미지를 가져 오기 및 실행 한 후 (그림 3), 확산 계수평가 될 수있다 (표 2).도 4는 다섯 테스트 콜라겐 농도의 로다 민 .......
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토론
또는 세포없이 성공적으로 확산 실험을위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 올바르게 금형 조립을 설정하는 단계; 소수성 커버 슬립의 추출시 파손을 방지하기 위해 필요한 손재주를 현상하는 단계; 올바르게 확산 계수를 계산하기 매우 좋은 선형 시작 라인을 찾을 수 있도록; 콜라겐과 화학 유인 물질 모두의 실험적인 계산을 수정; 제대로 건조하지 않는 행렬을 보장하기 위해 라이브 세포 이미징 시스템의 사용; 및 멸균, 건강한 문화를 유지.
확산 실험을 실시하면, 확산 플롯 (도 4) 선형 확산 모델의 기존 형상과 일치하는지 확인하는 것이 필수적이다.
타행에보고 된 각 샘플에 여러 다른 위치에서 X-분석 실행, 그것은, 콜라겐의 다양한 농도의 로다 민위한 확산 계수의 평균을 산출 할 수있다 BLE 2. 콜라겐의 농도는 매트릭스의 다공성으로 인해 증가 감소 이러한.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 세포 실험에 대한 통찰력을 제공해 준 Jonathan Reichner 박사와 Angle Byrd 박사에게 감사를 표합니다. 미국 국립과학재단(National Science Foundation) 대학원 연구 펠로우십 프로그램(GRFP)이 이 작업을 지원했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 실리콘 엘라스토머 키트 | Dow Corning Corp | 182 SIL ELAST KIT .5KG | 10:1 믹스 |
| 라이브 셀 이미징 챔버 | 라이브 셀 기기 | CM-B18-1 | 18 mm 라운드 커버슬립 |
| 22 mm 유리 커버슬립 | 피셔 사이언티픽 | NC0180281 | Neuvitro Corp. 커버 슬립 22 mm 1.5 |
| 가공 알루미늄 금속 큐브 | |||
| 취미 유틸리티 나이프 | X-Acto | X3201 | |
| 3-(아미노프로필) 트리메톡시실란 | 시그마-알드리치 | 281778-5ML | |
| 글루타르알데히드 | Polysciences, Inc | 00216A-10 | 글루타르알데히드, EM 등급, 8% |
| 50ml 튜브 | Fisher Scientific | 14-432-22 | 표준 바닥 모델 및 탁상용 원심분리기 |
| 유리 페트리 디쉬 | Fisher Scientific | 08-747A | 재사용 가능한 페트리 디쉬: 완전한 (60 x 15 mm) |
| 펜치 | Fisher Scientific | 22-327-379 | 파인 포인트 펜치 |
| 커버 안경 | Fisher Scientific | 12-518-105A | 직사각형; 30 x 22 밀리미터; 두께 번호 1 |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl | Gelest | SIT8174.0 | |
| 아세트산 | Sigma-Aldrich | 320099 | 아세트산 ACS 시약, ≥ 99.7% |
| Hexane Sigma-Aldrich | 296090 | 무수, 95% | |
| 에틸 알코올 | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof, 분자생물학용 |
| 고정밀 다이아몬드 스크라이빙 도구 | Lunzer | PV-081-3 | 직선 확장 팁 스크라이브, .020" (.50 mm) 직경이 .200"(5.0 mm) 팁 길이 |
| 진공 그리스 | Dow Corning | 14-635-5C | 고진공 그리스 |
| 15 ml 튜브 | Fisher Scientific | 14-959-49D | 15 ml 원추형 원심분리기 튜브, 소수성, 생물학적으로 불활성 표면 |
| 10x 인산염 완충 용액 | Fisher Scientific | BP399-500 | 1.37 m 염화나트륨, 0.027 m 염화칼륨 및 0.119 m 인산염 버퍼 |
| 1 N 수산화나트륨 | Sigma-Aldrich | 38215 | 수산화나트륨 콘센트레이트 |
| 콜라겐 I, 쥐 꼬리 | BD Biosciences | 354236 | 쥐 꼬리 |
| 마이크로 원심분리기 튜브 | Fisher Scientific | 02-681-332 | 용량: 2.0 ml; O.D. x L: 13 엑스 40 밀리미터; 멸균; single-wrapped |
| [header] | |||
| Carboxylate-modified microspheres | Invitrogen | F-8813 | 카르복실레이트 변성 마이크로스피어, 0.5 &마이크로; m, 황록색 형광등(505/515), 형 |
| Rhodamine | Sigma-Aldrich | 83689 | Rhodamine B |
참고문헌
- Adzick, N. S. The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair. Ann Surg. 225 (2), 236(1997).
- Reddi, A. H. Bone morphogenetic proteins: an unconventional approach to isolation of first mammalian morphogens. Cytokine Growth F. R. 8 ....
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재인쇄 및 허가
