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방법 논문

그 닫기 동족체, NOR1 및 Nur77에 대하여 교차 반응의 Nurr-1 특정 클론 항체 무료 제작

7.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52963

⸱

2015년 8월 17일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Neurobiology Laboratory, Psychiatry, McLean Hospital, 2Department of Biochemistry, College of Medicine, Konyang University

이 논문에서

요약

여기에서는 가장 다양한 영역을 가진 동물을 면역화한 다음 사전 흡착으로 교차 반응성 항체를 제거하여 고도로 보존된 단백질 계열의 특정 구성원에 대한 항체를 선택적으로 표적으로 합니다.

초록

핵 수용체 아족 4(NR4A)는 DNA 결합 도메인(DBD)과 리간드 결합 도메인(LBD)을 공유하는 3개의 관련 단백질로 구성됩니다. 핵 수용체와 관련된 1 개의 단백질 (Nurr1 또는 NR4A2)은 도파민 시스템의 유지에 중요한 역할을합니다. Nurr1 유전자와 관련된 도파민 기능 장애에는 파킨슨병, 정신분열증, 조울증 등이 있습니다. 또한 최근의 증거에 따르면 Nurr1은 해마와 같은 다른 뇌 영역에서도 발현되며 학습 및 기억에 중요한 역할을 합니다. 이 과의 다른 구성원은 신경 성장 인자 IB(Nur77 또는 NR4A1)와 뉴런 유래 고아 수용체 1(NOR1 또는 NR4A3)입니다. 도파민 및 기타 뇌 영역 관련 신경 기능 장애에서 Nurr1의 정확한 기능적 역할을 조사하기 위해 Nur77 및 NOR1에 대한 교차 반응이 없는 항체가 필요했습니다. 단백질은 DNA 결합 도메인보다 LBD에서 더 다양하기 때문에 정제된 LBD를 사용한 면역은 Nur77 및/또는 NOR1에 대한 최소한의 반응으로 Nurr1에 특이적인 항체를 생성해야 합니다. 항 Nurr1 항체가 성공적으로 생성되었지만, 이 항체는 가족의 다른 구성원에 대해 상당한 면역 반응을 보였습니다. 고정된 단백질 A에 대한 친화성 크로마토그래피에 이어 고정된 Nur77 및 NOR1 LBD에 대한 사전 흡착을 통해 교차 반응성이 없는 Nurr1 특이적 항체를 생성했습니다. 여기서, 우리는 가장 다양한 영역을 가진 동물을 면역화한 다음 사전 흡착으로 교차 반응 항체를 제거하여 고도로 보존된 단백질 계열의 특정 구성원에 대한 항체를 선택적으로 표적화합니다. 이 프로토콜의 목표는 교차 반응성 항원에 대한 사전 흡착을 통해 다클론 항체 특이성을 높이는 것입니다.

서론

전사 인자 Nurr1 및 동족체 (Nur77 및 NOR1은) 핵 수용체 아과의 4A (NR4A 1)에 속한다. 자신의 내인성 리간드는 아직 확인되지 않기 때문에 그들은 또한 고아 수용체이다. Nurr1 먼저 1992 년에 복제되고 알려져 있지만 뇌 2로 표현되는, 개발 및 중뇌 도파민 신경 세포의 유지 보수를 위해 자사의 중요한 역할은 녹아웃 마우스 연구 (3)에 의해 밝혀졌다. 또한, 중뇌 도파민 신경 세포의 유지에 대한 중요한 역할은 최근 조건부 녹아웃 공부 (4)에 의해 입증되었다. 인해 중뇌 도파민 뉴런 Nurr1의 중요한 역할을 나타내는 이들 고급 연구에 많은 후속 연구는 주로 도파민 뉴런 및 도파민 - 관련 신경 변성 질환에 초점을 맞추고있다 중뇌 파킨슨 병 (PD) 5.

특히, Nurr1은 중뇌 도파민 (MDA) 신경 세포뿐만 아니라, 다이에서뿐만 아니라 발현강하게 Nurr1 다양한 뇌 기능에 중요한 역할을한다는 것을 보여주는 최근의 연구에 의해 지원되는 많은 비 다 분야에서 기능적인 역할을 할 수 있음을 시사 구절 뇌 영역 2. 예를 들어, 이러한 학습으로 해당 메모리 유도 활동을 보였다, 또는 다른 해마에 의존하는 작업까지 규제 해마 6,7에서 Nurr1의 발현을 초래. 또한, 다운 해마 Nurr1 발현 노크 강하게 Nurr1 많은 뇌 영역에서 다양한 역할을한다는 것을 제안하는, 장기 메모리 및 / 또는 시냅스 8-11을 저해하기에 충분했다. 따라서, 상기의 Nurr1 세포 형 특이 적 및 세포 내 발현을 이해하기 위해서는 그 동족체 Nur77 또는 NOR1 어떠한 교차 반응성을 나타내지 않는다 Nurr1 - 특이 적 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 이 논문은 그것의 특이성을 보여주는 Nurr1 특정 항체와 현재 추가 데이터를 생성하는 사전 흡착 프로토콜을 설명합니다.

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프로토콜

주의 : 아래에 인용 된 모든 용액의 조성은 재료 / 장비 테이블에서 발견 될 수있다.

1. 단백질 열 항체 정제

  1. 단백질을 스핀 컬럼 이전 절차를 시작하기에 15 분 동안 실온에 필요한 모든 버퍼 평형.
  2. 면역 혈청 희석 1 : 1 단백질의 IgG는 버퍼를 바인딩. (혈청 5ml를 권장).
  3. 조심스럽게 뚜껑에 박혀 될 수있는 수지를 꺼 내려 단백질을 벤치 위에 스핀 열을 누릅니다. 상단 캡을 제거하고 부드럽게 바닥 폐쇄을 스냅. 15 ml의 수집 튜브에 열을 놓고 스토리지 솔루션을 배출 할 수 있습니다.
  4. 버퍼를 결합 단백질의 IgG 5 mL를 추가하고 솔루션을 배출 할 수 있습니다.
  5. 컬럼에 희석 면역 혈청을 적용하고 흐름을 통해 수집합니다. 최상의 결과를 위해 칼럼의 항체 - 결합 capacit의 80 % 미만의 농도로 항체를 포함하는 샘플 볼륨을 추가Y.
  6. 버퍼를 결합 단백질의 IgG의 15 ㎖로 또는 280 nm에서의 흡광도가 0.1 이하가 될 때까지 열을 씻으십시오.
  7. 다섯 라벨 수집 튜브에 중화 버퍼의 100 μl를 추가합니다.
  8. 단백질에 열을 IgG의 용출 버퍼 5 mL를 추가하고 중화 버퍼의 100 μl를 포함하는 튜브의 각 1 ㎖의 분수를 수집합니다.
  9. 0.5보다 큰 흡광도를 280 nm에서 풀 분획 각 분획의 흡광도를 측정한다. 투석에 대한 준비가 될 때까지 얼음에 풀링 분수를 유지합니다.
  10. IgG를 용출 완충액 8ml를 첨가하여 열을 재생성하고 용액을 컬럼을 통해 흐르도록 허용한다.
  11. 7.4 용리액 pH가 돌아갈 때까지 단백질의 IgG 결합 액과 열을 씻어.
  12. 저장 용액 5 ㎖ (PBS에 0.​​02 %의 아 지드 화 나트륨)를 첨가하여 열을 보관. 약 3 ㎖ 열, 모자 바닥에 남아 상단 캡을 고정합니다. 4 ° C에서 열을 저장합니다.
  13. 길이 O를 결정F 투석 튜브 제조업체의 지시에 따라 필요. 16mm 평면 직경의 튜브 용액 1 ㎖ 당 튜브 길이의 5.47 CM을 사용하여 사용하는 것은 투석한다. 튜브를 잘라 15 ~ 30 분 동안 PBS 산도 7.4 씻어.
  14. 접어 투석 튜브의 한쪽 끝을 클립, PBS pH를 7.4으로 평형화 투석 튜브에 함유 분획을 풀링 IgG를 전송하고 다른 쪽 끝을 닫는다.
  15. 2 시간 동안 pH 7.4의 PBS를 200 볼륨에 대해, 실온에서 투석.
  16. 투석 완충액 (pH 7.4의 신선한 PBS)를 변경하고, 실온에서 추가로 2 시간 동안 투석.
  17. 투석 버퍼 (신선한 PBS의 pH 7.4)를 변경하고 4 ℃에서 밤새 투석.
  18. 추가의 정제 단계를 진행 할 준비가 될 때까지 4 ℃에서 투석 항체 솔루션을 유지합니다.
  19. 280 nm에서 흡광도를 사용하여 항체 농도 및 210,000 M -1 cm -1 (12)의 280 nm에서의 항체의 몰 흡광 계수를 평가한다.

LBD 단백질 2. 커플 링은 커플 링 수지를 AminoLink하기

  1. 두 개의 열, NOR1에 대한 하나 Nur77의 다른를 준비합니다. 두 단백질 같은 프로토콜을 따르십시오.
  2. 단백질을 해동하는 얼음 수지에 결합한다. 그것의 몰 흡광 계수가 280 내지 12에서의 흡광도를 사용하여 단백질 농도를 결정한다.
    1. 대안 적으로, bicinchoninic 산 분석 13으로 단백질 결정 분석을 사용한다. 단백질을 커플 링 완충액 대 아민 - 함유 버퍼 투석 또는 버퍼 교환에 용해되는 경우. 단백질이 적절한 버퍼 (여유 아민)가없는 경우 그것을 커플 링 버퍼의 4 배 희석.
  3. 단백질의 2 mg을위한 수지 2 ㎖를 사용합니다. 다음의 모든 단계는 10 ml의 열에서 2 ml의 수지에 대한 것입니다. 단백질 10 ㎎까지 수지의 1 ㎖ (1 슬러리 1 2 ㎖) 당 연결될 수있다.
  4. 바닥에 프릿을 밀고 그것을 통해 PBS 산도 7.4을 실행하여 10 ml의 컬럼을 준비합니다. 캡 T그는 칼럼의 바닥과 커플 링 버퍼 2 ㎖를 추가합니다.
  5. 상기 컬럼 (수지 2 ㎖를 얻었다 4 mL)에 슬러리의 원하는 양을 추가 하단 캡을 제거하고 컬럼 배수하자. 커플 링 버퍼의 6 ㎖ (3 수지 침대 볼륨)의 총 열을 씻어 열을 배출 할 수 있습니다. 결합 버퍼가 고갈되면, 하단 캡을 교체한다.
  6. (280 nm에서의 흡광도 또는 bicinchoninic 분석법을 사용하여 단계 2.11 용출액의 단백질 농도를 비교하여 결합 효율을 평가하기 위해, 단백질 용액의 분취 량을 유지) 컬럼에 결합 완충액 단백질 2-4 ml를 추가 . 모자와 균질 한 용액을 가지고 말을 통해 끝을 섞는다.
  7. 빈 1.8 ML의 microcentrifuge 관의 무게를 측정하고 흄 후드로 이동합니다. 조심스럽게 미리 무게 튜브에 NaCNBH 3 (0.05 g)을 전송합니다. 튜브를 닫고 NaCNBH 3가 들어있는 튜브의 무게. 후드 외부 튜브를 열지 마십시오.
  8. 중량 기준NaCNBH 3은 튜브로 옮기고 1 M NaOH를 첨가하여 5 M 용액을 만든다. NaCNBH (3)의 분자량은 62.84 g 따라서는 0.05 g (0.05 / 62.84 = 7.96 X 10-4 몰) 7.96 X 10-4 몰과 동일하다. 5 M 용액의 추가 (7.96 × 10 -4 / 5) 1 M NaOH를 159 μl를 확인하십시오.
  9. 반응물의 총 부피가 고려 수지 부피 복용을 측정한다. 반응 1 ㎖ 당 5 M NaCNBH 3의 10 μl를 추가합니다.
    1. 예를 들어 : 4 ml의 반응 볼륨 (5) M NaCNBH 3의 40 μl를 추가합니다. 수지 1 ml를 첨가하여 단​​백질과 3 ㎖를 들어, 총 4 ml의 부피이다.
  10. 열 캡과 끝을 통해 끝을 섞는다. 튜브 회전에 열을 안전하고 반응이 4 ℃에서 하룻밤을 계속 할 수 있습니다.
  11. 아침에, 화학 후드에 열을 가지고 조심스럽게 약간의 가스가 형성 될 수 있으므로 뚜껑을 제거합니다. 깨끗한 튜브로 열을 배출시키고 단백질 콘을 측정하는 용출액을 절약280 nm의 방법 (12)에서의 흡광도 또는 bicinchoninic 산 분석 단계 2.6에서 출발 단백질 농도와 비교를하여 자기 중심.
  12. 커플 링 버퍼의 4 mL로 수지를 세척하고 열 배출을 할 수 있습니다.

3. 차단 남은 사이트

  1. 버퍼를 담금질의 4 mL로 수지를 씻으십시오. 배수 및 하단 캡을 교체합니다. 버퍼를 담금질 2 ㎖를 추가하고 수지를 일시 중지합니다.
  2. 수지 량과 담금질 버퍼 볼륨 후 반응 부피 1 ㎖ 당 5 NaCNBH M (3)의 10 μL를 추가 측정하여 총 반응 부피를 평가한다.
  3. 30 분 엔드 오버 엔드 실온에서 부드럽게 섞는다. 30 분 후, 흄 후드의 열을 가지고. 조심스럽게 상단을 제거하고 하단 캡을 제거하고 폐기물 튜브에 열 소모를 할 수 있습니다.
  4. 세척 용액의 5 수지 볼륨에 열을 씻으십시오. 용출액의 abso을 측정하여 잔류 단백질의 존재 여부를 모니터링 세척280 nm에서 rbance. 비 결합 단백질은 높은 염분 농도에 의해 세척.
  5. 탈기 함유 PBS pH 7.4의 0.02 % 나트륨 아 지드 6 ml의 수지를 씻는다. 필요할 때까지 4 ° C에서 열을 유지합니다.

Nurr1 특정 항체 4. 정제

  1. PBS pH 7.4의 10 mL로 Nur77 LBD 결합 열을 씻어 열 배출을 할 수 있습니다. 컬럼의 바닥을 모자와 새로운 15 ml의 수집 관에 배수 Nur77 LBD 결합 열을 배치합니다.
  2. 단백질 5 ml의 정제 된 안티 Nurr1 항체를 추가로 1 시간 동안 4 ℃에서 회전에 열과 장소 캡. 상단 및 하단 캡을 제거하고 통한 흐름을 수집한다. NOR1 LBD 결합 열을 추가 할 준비가 될 때까지 얼음에 따로 설정합니다.
  3. PBS pH 7.4의 10 mL로 NOR1 LBD 결합 열을 씻어 열 배출을 할 수 있습니다. 컬럼의 바닥을 모자와 15 ml의 포집 관에 NOR1 LBD를 결합 열을 배치합니다.
  4. Nur77 LBD 쿠데타에서 흐름을 통해 추가주도 컬럼은 1 시간 동안 4 ℃에서 회전에 열과 장소 캡. 상단 및 하단 캡을 제거하고 통한 흐름을 수집한다.
  5. 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 항체 농도를 측정한다.

정제 된 안티 Nurr1 항체 5. ELISA 기반 분석

  1. 96 웰 플레이트의 웰에 100 ㎕의 단백질 (2.5 μg의 / ㎖)를 첨가. 3 가지 단백질을 테스트하는 경우, H4에 우물 A1, H8에 우물 A5에 단백질이 100 ㎕, 및 H12에 우물 A9에 단백질 3 100 ㎕에 단백질 1의 100 μl를 추가합니다. 플레이트를 커버하고 4 ℃에서 밤새 품어.
  2. pH 7.4의 PBS의 웰 당 300 μL로 두 번 코팅 된 웰을 세척하고, 전체 항원 코팅 된 ELISA 웰에 블로킹 완충액 300 ㎕를 추가하고 실온에서 2 시간 동안 배양한다.
  3. 플레이트 정제 항 Nurr1 항체의 원하는 시작 희석을 준비하는 동안 차단 ELISA 블로킹 버퍼 (10 내지 100 μg의 / ㎖의 범위).
  4. 차단의 2 시간 후, 모든 우물에 신선한 ELISA 블록 버퍼 100 ㎕와 ELISA 블록 버퍼를 교체합니다.
  5. 직렬 C는 행 행 B에서 용액 100 μl를 전사 하였다 행 B의 웰에 로우에서 용액 100 μl를 전송하여 항체를 희석 행 A. 모든 웰에 희석 된 정제 된 안티 Nurr1 항체 100 ㎕를 추가 아래 계속하는 G가 추가 100 μl를 폐기 행의 우물에 솔루션을 혼합 한 후 샷을 행합니다. 행 H에 웰스는 버퍼를 차단의 초기 100 μl를받을 수 있습니다. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션.
  6. PBS 산도 7.4의 판을 0.05 % 트윈 20을 잘 당 300 μL와 3 회 반복한다 과잉 세척 버퍼를 제거 판을시킨다.
  7. 말 무 퍼 옥시 다제 (HRP) ELISA 블록 버퍼에 희석 결합 염소 항 - 토끼 IgG를 100 ㎕ 추가 (1 : 8000 희석, 일반적인 범위는 1 : 25000 : 5000 (1)). 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션.
  8. 판 일을 씻으십시오REE (3)은 5.6 배에 기재된. 탈 이온수 300 μL로를 작성하여 모든 우물을 씻어. 종이 흡수에 반전 판에 의해 과잉의 물을시킨다.
  9. 모든 웰에 테트라 메틸 벤지딘 (실온으로 가온) (3)의 100 μL, 3, 5 ', 5'를 추가하고 실온에서 15 분간 어둠 속에서 30을 배양한다.
  10. NH 2 SO 4 (2) 50 μl를 첨가하여 반응을 정지.
  11. 650 nm에서 배경을 뺀 450 nm에서 흡광도를 참조하십시오.

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결과

단백질의 비교 Nur77 LBD 및 NOR1 LBD 컬럼을 통과 한 다음 정제 된 안티 Nurr1 항체가 알 수있는도 1.로 도시되어 단백질과 컬럼 정제 Nurr1 특이 항체, 단백질 A-정제 Nurr1 항체는 강한 결합을 나타내 Nurr1 LBD에. 그러나, 그것은 또한 Nur77 LBD와 NOR1 LBD에 결합 중요한 보였다. 단백질 정제 Nurr1 항체 더 Nur77 LBD와 NOR1 LBD, Nurr1 항체가 Nur77과 NOR1과의 교차 반응 이었다는 것을 보여주는, Nur77 LBD 또는 NOR1 LBD에 결합 탐지와 Nurr1 LBD에 특이 적으로 결합을 전시 정제 최종 친화력에 대해 정제 할 때 완전히 제거.

이 특이성은 더 전체 길이 Nurr1, NOR1, 또는 Nur77 단백질을 (그림 2) 태그 MYC 융합 운반하는 발현 벡터로 형질 전환 된 CHO 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석에 의해 입증되었...

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토론

이 프로토콜의 성공은 관심의 단백질 가족의 특정 멤버에 대해 제기 항체의 특성 분석을위한 순수한 단백질의 가용성에 의존합니다. 그것은 명확히 ELISA 및 웨스턴 블롯에 의하여 상당한 교차 반응성이 있다는 것을 확립 될 때까지의 단백질 A / G를 사용하여 항체를 정제 할 필요가 없다.

본문에 언급 된 바와 같이, 이러한 트리스 나 글리신과 같은 아민 - 함유 버퍼 열로 가교 될 단백질 (들)을 현탁 피하는 것이 중요하다. 또한 가교 결합에 사용되는 최적의 단백질 농도는 실험적으로 결정되어야한다. 너무 작은 흡착 효율을 감소시킬 수있는 동안 너무 칼럼에 많은 단백질은 입체 장애의 원인이됩니다. 따라서, 좋은 방법은 2 내지 10 ㎎ / ㎖ 범위의 단백질 농도를 테스트하도록하고, 생성 된 항체의 질을 평가하는 것이다.

여러 가지 요인이 때 일 고려되어야한다기술은 매우 특이적인 항체를 생성하는 데 실패합니다. 이들은 다음을 포함...

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

이 작업은 NIH 보조금(NS070577 및 NS084869)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Nurr1, Nor 1 및 Nur77컬럼 저장 용액
AminoLink 커플링 수지 및 키트Thermo Scientific44890
단백질 A 스핀 컬럼Thermo Scientific89978
Dulbecco의 인산염 완충 식염수Corning21-031-CV
96 웰 플레이트-바닥 플레이트, 하이 플랜지, 330 &뮤; lThermo Scientific3455
10% 일반 염소 세럼KPL50-675-69
우유 희석제/ 차단 농축액 KPL50-82-01
IgG 용리 완충액Thermo Scientific21004
Micro BCA 단백질 분석 키트Thermo Scientific23235
말 무 과산화효소 접합 염소 항토끼 IgG (H+L)Thermo Scientific31460
Ni-NTA 수지Thermo Scientific88221
3, 3', 5, 5' TetramethylbenzydineThermo Scientific34028
2N H2SO4MacronFine ChemicalsH381 05
Protein A IgG Binding BufferThermo Scientific21001
IgG 용리 완충액Thermo Scientific21004
컬럼 저장 용액Phosphate Buffered 0.02% 아지드화나트륨
Spectra/Por 7 전처리 투석 튜브Spectrum Labs132128
10ml 일회용 컬럼Thermo Scientific29924
AminoLink 커플링 버퍼0.1M 인산나트륨, 0.05% NaN3, pH 7.0
담금질 버퍼1M Tris. HCI, 0.05 % NaN3, pH
7.4
세척 용액1M NaCl, 0.05 % NaN3
ELISA 차단 버퍼1 % 일반 말 혈청 (NHS), 1X KPL 우유 희석제에 1 % 일반 염소 혈청 (NGS)
0.02 % 아지 화 나트륨저장 용액
마이크로 피펫 : 10 μ l; 20 &뮤; l; 200 &뮤; l; 1000 &뮤; 엘
의 정제된 리간드 결합 도메인를 함유한 식염수 함유 PBS pH 7.4

참고문헌

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  3. Zetterström, R. H., et al. Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice. Science. 276 (5310), 248-250 (1997).
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  10. Hawk, J. D., et al. NR4A nuclear receptors support memory enhancement by histone deacetylase inhibitors. J. Clin. Invest. 122 (10), 3593-3602 (2012).
  11. Bridi, M. S., Abel, T. The NR4A orphan nuclear receptors mediate transcription-dependent hippocampal synaptic plasticity. Neurobiol Learn Mem. 105, 151-158 (2013).
  12. Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal. Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).
  13. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  14. Zetterström, R. H., Williams, R., Perlmann, T., Olson, L. Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system. Brain Res. Mol. Brain Res. 41 (1-2), 111-120 (1996).
  15. Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization. Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).

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재인쇄 및 허가

태그

Nurr1 특이적 항체교차 반응 제거리간드 결합 도메인 정제단백질 A 친화성 크로마토그래피사전 흡착 기술ELISA 웨스턴 블롯 분석Nur77 NOR1 LBD 컬럼항체 특이성 향상도파민성 시스템 연구핵 수용체 하위 가족 4A
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