인간 동시 감염은 체외에서 복제하기 어렵습니다. 그러나 인간 말라리아 기생충은 HIV에 자연적으로 감염된 갓 분리된 인간 말초 혈액 단핵 세포와 마찬가지로 체외에서 쉽게 배양할 수 있습니다. 이는 HIV 동시 감염의 맥락에서 말라리아 기생충에 대한 조기 면역 반응을 연구하기 위한 훌륭한 모델을 제공합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
말라리아와 HIV 동시 감염은 점점 더 건강의 우선순위가 되고 있습니다. 그러나 현재 말라리아나 HIV에 대한 대부분의 연구는 각 감염에 개별적으로 초점을 맞추고 있습니다. 이러한 각 병원체의 질병 역학을 독립적으로 이해하는 것이 중요하지만 이러한 병원체 간의 상호 작용을 조사하고 이해하는 것도 중요합니다.
우리는 HIV 감염의 맥락에서 말라리아에 대한 숙주 면역 반응을 연구하기 위해 HIV-말라리아 동시 감염의 다목적 체외 모델을 개발했습니다. 우리의 모델은 세포 상등액, 세포 표면 및 세포 내 단백질 마커, RNA 발현 수준에서 분비되는 인자를 연구할 수 있게 해줍니다. 사용된 실험 설계 및 방법은 변동성을 제한하고 데이터 신뢰성과 재현성을 높입니다.
이 모델에 사용된 모든 병원체는 자연 인간 병원체(Plasmodium falciparum 및 HIV-1)이며, 감염된 모든 세포는 자연적으로 감염되어 신선하게 사용됩니다. 우리는 P. falciparum 에 기생하고 지속적인 체외 배양으로 유지되는 인간 적혈구를 사용합니다. 우리는 만성 HIV에 감염된 지원자로부터 새로 분리된 말초 혈액 단핵 세포를 얻습니다. 사용되는 모든 질환에는 적절한 대조군이 있으며(P. falciparum 기생균 vs. 정상 적혈구), HIV에 감염된 모든 공여자는 HIV에 감염되지 않은 대조군을 가지고 있으며, 이 대조군으로부터 세포는 당일에 채취됩니다. 이 모델은 HIV 감염의 맥락에서 말라리아 기생충과 인간 면역 세포 간의 상호 작용을 연구할 수 있는 현실적인 환경을 제공합니다.
서론
공동 감염, 복수의 동시 감염 감염은 자연 환경의 규범이다. 공동 감염 질환의 병리에 각각 감염의 임상 적 관리에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 공동 감염, 백신 및 약물 효능뿐만 아니라 진단 테스트의 맥락에서 부정적인 영향을받을 수있다 (1에서 검토). 그러나, 그것의 중요성에도 불구하고, 병원균 연구의 대부분은 하나의 감염을 고려한다.
말라리아 및 HIV-1 (HIV)는 전 세계적으로 이환율과 사망률의 원인을 선도하고 있습니다. 10 - 말라리아와 에이즈 endemicity 분야 공동 감염의 위험에 수백만의 사람들을 가하고 그 결과 더 심한 임상 질환 2의 위험, 넓은 지리적 중복을 공유 할 수 있습니다. 두 질환에 부정적인 상호 작용합니다. HIV 감염자 높은 HIV 바이러스 부하와 CD4 + T 세포 수가 일시적으로 감소하면서, 말라리아 감염 중에 알 수말라리아 기생충 부담과 임상 중증 말라리아의 위험이 공동 감염된 개인 2,3,5,7,8,10에서 더 높다. 에이즈 말라리아의 심각성을 증가하는 메커니즘은 완전히 이해하여 추가 조사를 보증하지 않습니다.
여기에서 우리는 체외에서<....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
이 프로토콜은 기생충 문화에 사용되는 혈청과 적혈구에 대한 기증자의 채용이 필요하며, PBMC 분리에 대한 HIV (+)와 감염되지 않은 기증자. 기관 검토 보드는 모든 연구를 승인해야하고 모든 기증자 혈액 추첨 이전에 동의를 제공해야합니다.
주의 : 인간의 혈액 샘플과 인간 말라리아 기생충 작업은 예방 조치가 필요합니다. 항상 레벨 2 바이오 안전성 캐비닛에 실험실 코트, 장갑, 작업을 착용하십시오. 인간 말라리아에 실수로 경피 노출의 경우, 예방 적 치료에 대한 건강 및 안전에보고한다. 추가 안전 고려 사항은 또한 HIV (+) 혈액 작업을위한 장소에 넣어해야합니다. 다시 폐쇄 실험실 코트를 착용 할 것. (맨 장갑은 라텍스한다) 더블 장갑입니다. 레벨 2 바이오 안전성 캐비닛에 모든 처리를 수행합니다. 모든 유리 또는 날카로운 물체를 사용하지 마십시오. 흡입기를 사용하지 마십시오. 폐기에 앞서 1 시간의 최소 virox 솔루션 또는 표백제에 오염 된 모든 항목을 놓습니다.사용 다음 1 시간 동안 virox 및 UV와 모든 표면을 세척 할 것. 각 기관이 준수해야 할 필요가 자신의 특정 바이오 안전성 규제를해야합니다 있습니다. 평가 가능한 노출 후 예방의 고려에 대한 건강 및 안전에 HIV에 감염된 혈액에 대한 모든 사고 피폭을보고합니....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
그래프 NKT 세포 집단을 수득 CD56 + CD3 + γδ- 게이트들을 이용하여, NKT 세포에서 IFNγ 생산 (도 2)의 레벨을 도시한다 (데이터는 보이지 않음). 세포 염색 전에 72 시간 동안 배양 하였다. 일단 10 만 CD3 + 세포는 사이토 NK, NKT 및 γδ 세포 (관심의 세포)의 충분한 인구를 얻는 흐름에 취득한, 스테인드. 5,600 NKT 세포의 최소 각 그래프에 표시된다. TNF 생산은 동일한 방식으로 수득된다 (데이터는 미도시). (-)에 노출 된 개인 PfRBC 그래프 명확 IFNγ 생산은 HIV (+) HIV에 비해 개인의 세포에서 낮은 것을 보여준다.
유동 세포 계측법 분석은 매우 주관적이다. 이는 각각의 실험에 대한 모든 적절한 제어를 갖는 것이 필수적이다 (도 2 참조). 배경 레벨은 사이토 카인 염색 진정한 표현 가능 FMO 샘플들을 이용하여 계산된다.PMA / 이오 노마 이신.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
우리의 프로토콜은 가장 사실적으로 체외에서 HIV-말라리아 공동 감염을 연구하기 위해 최적화되었습니다. 첫째, 신선한 인간의 적혈구와 혈청은 말라리아 기생충 문화가 필요합니다. 이 말라리아 기생충의 건강한 인구를 얻기 위해 매우 중요합니다. 라이브 P. 사용시 사이토 카인 생성을 훨씬 더 빠르고 강력한 같이 기생충 해물 라이브 기생충 치환 될 수 없다 원충은 적혈구 (PfRBC) 17, 18에 감염된. 또한, NK 세포와 같은 세포 유형의 활성화는, 전체 PfRBCs 필요하고, 기생충 해물으로 효율적으로 작동하지 않는다. 이는 PfRBC와 백혈구 사이의 직접 접촉의 필요성에있을 수 있습니다 또는 세포 표면 수용체 (18)과 상호 작용하는 기생충 유도 리간드의 불안정한 성격 때문일 수 있습니다. 말라리아 PfRBC 문화는 물론 실험에 앞서 (프로토콜 4) 동기화해야합니다. 동기화 PfRBCs은 실험 데이터의 재현성을 향상시킬 수 있습니다. 이.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
C.A.M.F.와 L.S.는 프로토콜 설계, 데이터 수집 및 분석, 논문 초안 작성에 참여했습니다.
저자는 Kain 박사, Loutfy 박사, Wasmuth 박사, Ayi 박사의 기여에 감사드립니다.
C.F.는 CTN/Ontario HIV Treatment Network(OHTN) 박사후 연구원의 지원을 받았습니다.L.S.는 OHTN Junior Investigator Development Award의 지원을 받고 있습니다. 본 연구는 캐나다 보건 연구소(CIHR) 운영 보조금(MOP-13721 및 115160)과 CIHR New Investigator Catalyst 보조금의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| alanine | Sigma | A7377 | |
| 항체 (다른 표 참조) | |||
| BD Cytofix/Cytoperm with BD GolgiPlug | BD | 555028 | brefeldin A, cytofix/cytoperm buffer 및 perm/wash buffer가 포함됩니다 |
| BD Vacutainer ACD Solution A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Sodium Heparin | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS (칼슘 없음, 마그네슘 없음) | Corning | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | 사용 전 열 비활성화 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| 겐타마이신 (10 mg/ml) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 염색 세트 | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| 하이포잔틴 | 시그마 | H9636 | |
| 아이오노마이신 | 시그마 | I3909 | |
| MEM 비필수 아미노산(10mM) | Gibco | 11140 | |
| PMA | 시그마 | P8139 | |
| RPMI-1640 분말 | Life-Technologies | 31800-022 | |
| RPMI-1640 L-글루타민 및 HEPES | 열 포함 Scientific | SH30255.01 | |
| 중탄산나트륨 (분말, 세포 배양) | Sigma | S5761 | |
| 피루브산 나트륨 (100 mM) | Gibco | 11360 | |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| Trypan Blue (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | 사용된 항체에 따라 다릅니다 |
| 기생충 가스 혼합물 | 특별 주문 | 3% CO2, 1% O2, balance N2 | |
| Equipment | |||
| 0.2 μ m 필터 장치 | |||
| 유리 슬라이드 | |||
| T25 플라스크, | |||
| T75 플라스크, | |||
| 50ml 튜브 | |||
| 24 웰 배양 플레이트 | |||
| 플러그가 뽑혀 있습니다, 파스퇴르 피펫이 | |||
| 막혔습니다. 파스퇴르 피펫이 막혔습니다. | |||
| 멸균 이송 피펫 | |||
| 혈구분석기 | |||
| 유세포 분석기 (3 레이저) | |||
| 유세포 분석에 사용되는 항체 | |||
| Anti-TNF | eBiosciences | 551487 | FITC (fluorophore) 2 μ l |
| 안티-IFNγ | Biolegend | 506507 | PE (형광단) 20 μ l |
| 300914 | Anti-CD8 | Biolegend | 1 μ l |
| 안티 CD14 | Biolegend; BD Biosciences | 325624; 551487 | Biotin (형광단) 0.5 μ l Streptavin PE-TR (형광단) 0.1 μ l |
| 안티 CD56 | Biolegend | 318322 | PerCP / Cy5.5 (형광단) 5 μ l |
| 안티-γ δ | Biolegend | 331212 | APC (형광단) 5 μ l |
| 안티 CD3 | Biolegend | 300426 | APC-Cy7 (형광단) 5 μ l |
| 안티-CD4 | 바이오레전 | 드 317424 | 퍼시픽 블루 (형광단) 1 μ 엘 |
참고문헌
- Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large. Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).
- French, N., et al. I....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
