여기 프로토콜은 사전에 감염된 수지상 세포 (DC)에서 transinfection 통해 항원 제시 동안 발생하는 CD4 + T 세포에 의해 세균 캡처를 측정하기 위해 제공됩니다. 일차 전지, DC, DC / T 세포 복합체 형성의 감염, 박테리아 T 세포 형질의 측정의 분리 : 우리는 필요한 단계를 수행하는 방법을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
최근에는 앞서 설명한 것과는 반대로 적응면역세포의 패러다임인 CD4+ T세포가 감염된 수지상 세포(DC)에서 이식이라는 과정을 통해 박테리아를 포획한다는 것을 보여주었습니다. 여기에서는 항원 제시 과정에서 발생하는 감염 과정에 대한 분석을 설명합니다. 이 과정은 형질전환 OTII 마우스의 CD4+ T 세포를 사용하여 공개되었으며, 이 세포는 오보알부민(OVAp)의 펩타이드에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 가지고 있으므로 이 특정 OVAp가 로드된 감염된 수지상 세포와 안정적인 면역 복합체를 형성할 수 있습니다. DC-T 세포 전달 중 녹색 형광 단백질(GFP) 발현 박테리아의 역학은 라이브 셀 이미징으로 모니터링할 수 있으며 박테리아 감염의 정량화는 유세포 분석으로 수행할 수 있습니다. 또한, 이식은 세포 외 박테리아를 죽이지만 세포 내 박테리아는 죽이지 않는 비투과성 아미노글리코시드 항생제인 겐타마이신(gentamicin)을 사용하는 보다 민감한 방법으로 정량화할 수 있습니다. 이 고전적인 방법은 이전에 미생물학에서 박테리아 감염의 효율성을 연구하는 데 사용되었습니다. 이로써 우리는 일차 세포의 분리에서 transinfection의 정량화에 이르기까지 전체 프로세스의 프로토콜을 설명합니다.
서론
병원균은 숙주를 감염 할 때, 일반적으로 세균 통관에 필요한 타고난 및 적응 면역 반응의 활성화가있다. 선천성 면역은 대부분의 감염을 방지 방어의 첫 번째 줄입니다. 선천성 면역은 미생물의 다양한 그룹들 사이에서 보존되는 정확한 방법 요소 (병원체 관련 분자 패턴, PAMPS) 1 구분합니다. 선천성 면역 메카니즘 식세포 (대 식세포, 호중구 및 수지상 세포), 비만 세포, 호산구, 호염기구, 및 천연 킬러 세포를 포함 실제 피부와 같은 장벽 화학 장벽 (항균 펩티드 리소자임) 및 선천적 백혈구를 포함 2. 이 세포는 접촉을 통해 또는 병원체 덮어 및 살해를 포함 식균 작용을 통해 그들을 공격하여 하나 확인하고 병원균을 제거한다. 이 시스템은 P에 대한 면역 학적 기억을 부여 적응 면역, 대조적으로, 평생 방어를 허용하지 않습니다athogens. 적응 면역 시스템은 방어의 두 번째 라인 및 인식하고 여러 미생물 및 비 미생물 물질 3의 특정 항원에 반응 할 수있다. 적응 면역 시스템의 주요 구성 요소는 B 및 T 세포 림프구를 포함이다. B 세포는 병원체 또는 외래 단백질에 대한 항체를 분비, 체액 성 반응에 관여한다. 그러나, T 세포의 사이토 카인 분비 또는 죽이는 병원체에 감염된 세포를 4 면역 반응을 조절....
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프로토콜
참고 : 실험 절차는 대학교 Autònoma 마드리드의 연구 윤리위원회의 승인을 스페인과 유럽 지침에 따라 동물 복지 및 보건 대학교 Autònoma 마드리드 헤드의 감독하에 실시 하였다. 마우스는 특정 병원체 무료 (SPF) 하우징에 자란하고 이산화탄소를 사용하여 훈련과 자격을 갖춘 사람 (CO 2) 흡입 방법으로 안락사시켰다.
1. 마우스 뼈 수지상 세포의 분화 및 감염 골수 유래
참고 : 그림 1은 첫 번째 단계를 요약 한 것입니다. 모든 절차 만 멸균 미디어, 악기, 피펫 팁 및 배양 접시를 사용하여,이 시점에서 후드에서 수행되어야한다.
- 마우스 골수 유래 수지상 차별화
- 하나 C57 / BL6 마우스 (22)에서 경골과 대퇴골을 해부하고 RPMI 배지 10 ml의 플라스틱 접시에 전송합니다.
- 멸균 가위, 각 골단을 잘라 특성 밝은 붉은 색이 골수를 노출.
- 멸균 페트리에 멸균 주사기를 사용하여 0.5 % 소 혈청 알부민을 함유하는 인산염 완충 식염수 10 ㎖ (PBS) (BSA), 5 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (PBS ....
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결과
유동 세포 계측법 및 겐타 마이신 생존 분석 그림 1은 세포를 획득하는 절차를 요약 한 것입니다. 여기에서 우리는 감염된 골수 유래-DC가 어떻게 두 개의 서로 다른 접근 방식을 통해 박테리아 transinfection을 측정하는 방법에서 쥐의 T 세포 박테리아 transinfection을 수행하는 방법을 설명했다. 수지상 9 일간 GM-CSF와 골수 세포를 배양하여 생성된다. 그리고 DCS는 OVA (OVAp)의 특정 펩타이드 나중에 그들을로드의 막에 MHCII을 증가 LPS와 숙성된다. 대조군으로, 어떤 DC가이 OVAp으로로드되지 않습니다. (OVAp -로드 및 비 로딩)는 모두 DC의 감염 다중도 (10)의 박테리아 (MOI)로 감염된다. 한편, CD4 + T 세포는 특정 OVAp 인식 OTII 트랜스 제닉 마우스의 림프절로부터 분리된다. (2)가 수행하고 적절한 음성 대조군을 포함.......
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토론
T 세포 또는 T 림프구는 적응성 면역 반응 (26)에 세포 성 면역에 중요한 역할을 담당하고 속하는 백혈구 유형이다. T 세포는 시험 관내에서 감염에 반응하지만 일부 리포트들은 생체 14,15에 감염 될 수 있다는 것을 나타낸다. 면역 시냅스 동안 APC와 T 세포의 친밀한 접촉은 HIV (11)와 같은 일부 바이러스를 포함하는 생체 재료 (13)를 교환하기위한 플랫폼 역할을합니다. 그것은 최근에 교리, T 세포에 그 반대를 줬습니다 적응 면역 세포의 패러다임은, 또한 효율적으로 감염된 수지상 11,16에서 transinfection에 의해 박테리아를 캡처 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 그가 감염 BMDCs에서 체외에서 T 세포 박테리아 transinfection을 정량화하는 프로토콜을 자세히 보여줍니다.
T 세포는 박테리아 .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 스페인 과학혁신부의 보조금 BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC 및 Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas(CSIC)의 PIES201020I046의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| r-GMCSF | Peprotech | 315-03 | |
| LPS | SIGMA | L2630-10mg | |
| Na Pyruvate | Thermo Scientific | SH3023901 | |
| 2-ME | Gibco | 31350-010 | |
| OVAp OTII (323– 339) | GenScript | ||
| 세포 여과기 70uM | BD | 352350 | |
| 30 uM 주사기 Filcons 멸균 | BD | 340598 | |
| AutoMacs Classic | Miltenyi Biotec | 130-088-887 | |
| Gentamicin | Normon | 624601.6 | |
| Transwell | Costar | 3415 | |
| LB | Pronadisa | 1231 | |
| Agar | Pronadisa | 1800 | |
| Paraformaldehyde 16% | 전자 현미경 과학 | 15710 | |
| Triton X-100 | |||
| CD8 biot | BD Biosciences | 553029 | |
| IgM Biot | ImmunoStep | Clone RMM-1 | |
| B220 Biot | BD Biosciences | 553086 | |
| CD19 biot | BD Biosciences | 553784 | |
| MHC-II Biot (I-A/I-E) | BD Biosciences | 553622 | |
| CD11b biot | Immunostep | 11BB-01mg | |
| CD11c biot | Immunostep | 11CB3-01mg | |
| DX5 biot | BD Biosciences | 553856 | |
| Gr-1 biot | BD Biosciences | 553125 | |
| CD16/CD32 | ImmunoStep | M16PU-05MG | |
| anti Salmonella | ABD Serotec | 8209-4006 | |
| CD11cPE | BD Biosciences | 553802 | |
| CD4-APC | Tonbo Biosciences | 20-0041-U100 | |
| Gr-1 APC | BD Biosciences | 553129 | |
| MHC-II (IA/I-E) FITC | BD Biosciences | 553623 | |
| Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 항체, 고도의 교차 흡착 | Invitrogen | A-21245 | |
| CMAC (7-아미노-4-클로로메틸쿠마린) | 생명 기술 | C2110 | |
| BSA | 그마 | A7030-100G | |
| 스트렙타비딘 마이크로비즈 | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences |
참고문헌
- Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. New York. (1989).
- Pancer, Z., Cooper, M. D.
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재인쇄 및 허가
