드 노보 지방 생성 및 β - 지방산 산화는 간세포의 주요 대사 경로, 지방간 질환 등 여러 가지 대사 장애에 교란되는 경로를 구성한다. 여기에서 우리는 마우스 차 간세포의 분리를 보여와 β-지방산 산화 및 지방 생성의 정량화를 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
간의 지질 대사는 복잡합니다. 지단백질을 통해 지질을 수입하고 내보내는 것 외에도, 간세포는 지방산 산화를 통해 지질을 산화시키거나 새로운 지방형성을 통해 새로운 지질을 합성할 수 있습니다. 이러한 경로의 총합은 여러 요인에 의해 결정되며, 특정 질병 상태에서는 지방간 질환을 유발합니다. 과도한 간 지질 축적은 전신 인슐린 저항성 및 관상 동맥 심장 질환과 관련이 있습니다. 간세포의 지질 대사를 연구하는 도구는 특정 대사 장애에서 간 지질 대사의 역할을 이해하는 데 유용합니다.
간에서 간세포는 각각 β-fatty oxidation과 de novo lipogenesis를 통해 지방산의 분해와 합성을 조절합니다. 이러한 경로에서 신진대사를 정량화하면 간 지질 처리에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. in vitro 정량화와 달리 1차 간세포를 사용하여 in vivo 측정을 수행하는 것은 기술적으로 까다롭고 자원 집약적입니다. 따라서 배양된 마우스 간세포에서 β-지방산 산화 및 새로운 지방형성을 정량화하는 것은 간세포 지질 취급을 평가하는 간단한 방법을 제공합니다.
여기에서는 일차 마우스 간세포를 분리하는 방법을 설명하고, 방사성 표지된 기질을 사용하여 β-지방산 산화 및 새로운 지방 형성의 정량화를 보여줍니다.
서론
비알코올성 지방간 질환은 서구화된 문화권에서 간 질환의 주요 원인 중 하나입니다1,2. 간 내 지질 축적은 아직 알려지지 않은 메커니즘을 통해 세포 사멸, 섬유증 및 간 부전과 관련이 있습니다3-6. 지방간 질환에서 간세포 매개 β지방산 산화와 새로운 지방형성은 순 지질 축적의 중요한 결정 요인이다7,8. 따라서 이 기사에서는 간세포 분리에 초점을 맞춘 다음 β-지방산 산화 및 새로운 지방 형성의 정량화에 중점을 둘 것입니다.
간세포 지질 대사를 조사하기 위해 수많은 방법론이 개발되었습니다. 안정 동위원소를 사용하여 생체 내에서 지방의 대사를 측정하는 것이 가능하지만9,10, 이러한 방법은 비용이 많이 들고 많은 수의 동물이 필요합니다. 또한 외인성 화학 물질의 영향을 조사할 수 있는 능력은 생체 내 실험의 특성으로 인해 제한됩니다. 이와는 대조적으로, 생쥐의 간에서 원발성 간세포를 분리하는 것은11을 추구할 수 있는 저렴한 방법을 제공한다. 또한 배양 내 간세포를 연구하면 연구자가 생체 내 실험의 어려움을 우회하면서 다양한 화학 물질이 지질 처리에 미치는 영향을 연....
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프로토콜
모든 동물 실험은 지역 및 연방 규정에 따라 및 기관 IACUC 및 방사선 안전 관리의 승인을 수행해야한다.
1. 준비
- 몇 일 전에 분석에, 간 다이제스트 중간 (LDM)의 500㎖의 병을 해동하고 50 ML 원뿔 튜브 ~ 35 mL를 분취을 재 냉동. 필요할 때까지 -20 ℃에서 보관하십시오.
- 어느 날 이전의 분석에, 오토 클레이브에 의해 깨끗한 해부 도구를 미리 소독.
- 분석 당일, 콜라겐 24- 웰 배양 플레이트의 필요량을 치료.
- PBS의 50 부를 3 ㎎ / ㎖ 래트 꼬리 콜라겐 1 부를 섞는다. 24 웰 플레이트의 각 웰에 약 500 μl를 추가하고 실온에서 3 ~ 5 분 (RT) 동안 품어. 콜라겐을 제거하고 판은 후드에서 공기 건조 할 수 있습니다. 적어도 하나의 추가 시간을 반복합니다.
참고 : 콜라겐 코팅이 광고에 일주까지 수행 할 수 있습니다밴스와 플레이트는 플라스틱 포장에 밀봉 4 ℃에서 보관.
- PBS의 50 부를 3 ㎎ / ㎖ 래트 꼬리 콜라겐 1 부를 섞는다. 24 웰 플레이트의 각 웰에 약 500 μl를 추가하고 실온에서 3 ~ 5 분 (RT) 동안 품어. 콜라겐을 제거하고 판은 후드에서 공기 건조 할 수 있습니다. 적어도 하나의 추가 시간을 반복합니다.
- 37 ° C로 해동 LDM 및 따뜻하고 1 N KOH를 사용하여 7.4으로 산도를 조정합니다 분석을 위해 LDM을 준비합니다. 순환 42 ° C의 물을 욕조에 0.2 μm의 주사기 필터와 장소를 사용하여 필터....
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결과
3 × 10 7 총 세포 - 간세포 아이솔레이션는 일반적으로 1을 초래한다. 밤새 배양 한 후, 세포는 (그림 2) 이핵됩니다 많은 육각형를 나타납니다. 건강한 세포는 세포 죽음을 나타내는 있습니다 과립 또는 소포,없는해야한다.
일반적으로, 지방산 산화 분석은 시험 화합물 당 3-4 회 반복 실행됩니다. CO 2 샘플 카운트 산 용해성 물질 유래의 약 1/5이다. 우리는 일반적으로 (즉, 시트르산 회로를 통해 산화 량이다) 완전 산화의 척도로서 산 용해성 물질에 CO 2의 비율을 계산한다. 이러한 카르 보닐 시안화 -4- (트리 플루오 로메 톡시) 페닐 (FCCP)로서 세포 호흡을 촉진 물질, TCA 사이클을 통해보다 산화를 나타내는, CO 2 방향이 비율을 이동한다. 호흡 사슬의 억제는 전체에 산화를 감소합니다(그림 3). 이 분석을.......
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토론
관류에 희생에서 시간은 이상적인 관류 및 간 콜라게나 소화 미만 3 분이어야합니다. 관류 매체 관류가 시작되면, 간은 즉시 빨간색은 엷은에서에 모양을 변경해야합니다. LDM과 부화의 약 10 분 후, 간은 부어 핑크 나타납니다. 관류이 불충분하다는 경우, 간은 이러한 변화를 나타내지 않으며, 이는 일반적으로 낮은 수율 간세포 초래할 것이다.
세척 단계 후, 절연 간세포 전에 도금을 빙냉 현탁액에 몇 시간 동안 저장 될 수있다. 도금 후, 배양 간세포 준수하고 확산하기 위해 몇 시간을 필요로한다. 도금 배지에서 배양 2 시간에 따라, 간세포는 작고 둥근 유지됩니다. 하룻밤 배양 후, 간세포는 이핵됩니다 많은 것이 더 특징적인 육각형 모양에 걸립니다. 제제가 비정상 인 경우, CELL 학생은 세포의 죽음을 나타내는 수많은 과립 및 비정기에 blebbing을 전시 할 예정이다. 가장 배양 생존을 유지하기 위해, 매체는 24 시간마다 교환해야 공기를 열 노출을 최소화하는 데 걸리는 .......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 나타냅니다.
감사의 글
간세포 분리 프로토콜의 기술적 측면에 도움을 준 Susan Gray와 Umadevi Chalasani에게 감사드립니다. 이 작업은 NIDDK 보조금 5R01DK089185(M.P. Cooper에게) 및 UMMS의 DERC 파일럿 및 타당성 프로그램(M.P. Cooper에게)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Liver Perfusion Medium | Life Technologies | 17701038 | |
| Liver Digest Medium | Life Technologies | 17703034 | 부분 표본 및 -20°C에서 보관; C |
| PBS | 코닝 | 21-040-CV | |
| 10X DPBS | 코닝 | 46-013-CM | |
| DMEM | 코닝 | 10-017-CV | |
| FBS | 라이프 테크놀 | 26140079 | |
| 콜라겐 | 라이프 테크놀로지 | A1048301 | |
| 폴리비닐피롤리돈으로 코팅된 콜로이드 실리카 | GE Life Sciences | 17-0891-01 | |
| 피루브산 나트륨 | Cellgro | 25-000-CI | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Cellgro | 30-001-CI | |
| 인슐린 | 시그마 | I0516-5ML | |
| 덱사메타손 | 시그마 | D2915-100MG | |
| 알부민(BSA), Fraction V | MP Biomedicals | 103703 | |
| 24-Well Culture Dish | Corning Falcon | 353047 | |
| 타이곤 S3 튜빙 | Cole Parmer | 06460-34 | |
| 남성 Leur Lock to 200 Barb Connectors | Cole Parmer | 45518-00 | |
| 24 G x 3/4" 카테터 | SurFlo | SROX2419CA | |
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| 4 " 0.8mm 팁 전체 곡선 미세 해부 집게 | Roboz | RS-5137 | 오토클레이 |
| 60ml 주사기 | Becton Dickinson | 309653 | |
| 50ml 원뿔형 튜브 | Corning Falcon | 352070 | |
| BCA 단백질 분석 | Thermo Scientific | 23225 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| CO2 Incubator | |||
| 혈청학 피펫 | |||
| 1,000, 200, 20 μ L 피펫과 팁 |
참고문헌
- Clark, J. M., Brancati, F. L., Diehl, A. M. The prevalence and etiology of elevated aminotransferase levels in the United States. The American journal of gastroenterology. 98, 960-967 (2003).
- Lazo, M., et al.
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재인쇄 및 허가
