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방법 논문

소뇌 과립 세포 배양에서 미세 아교 세포의 선택적 고갈 L - 류신 메틸 에스테르를 사용하여

8.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52983

⸱

2015년 7월 7일

 ,  , 
1Department of Neurology, University of Washington, 2Therapeutic Innovation Group, School of Life and Medical Sciences, University College London, 3Department of Neuroinflammation, University College London

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

Microglia는 다양한 비세포 자율 메커니즘에 의해 배양의 뉴런 및 기타 신경교세포에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에서는 1차 신경 세포 배양에서 미세아교세포를 선택적으로 고갈시키는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 신경염증이 특징적인 신경퇴행성 질환에 영향을 미치면서 미세아교세포-뉴런 상호작용의 역할을 규명할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

초록

중추신경계의 상주 면역 역량 세포인 미세아교세포는 선천성 면역을 매개할 뿐만 아니라 신경 기능을 조절하고 조절하는 데 다각적인 역할을 합니다. 1차 설치류 세포 배양 모델은 뉴런-아교세포 상호 작용에 대한 이해를 크게 발전시켰지만, 혼합 배양에서 미세아교세포를 특이적으로 제거하는 방법이 활용된 것은 최근의 일입니다. 여기에 설명 된 그러한 기술 중 하나는 대식 세포와 마이크로 아교 세포에 의해 내재화 된 리소 부트 자극 제제 인 L-류신 메틸 에스테르를 사용하는 것으로, 리소좀 파괴 및 후속 세포 사멸을 유발합니다13 , 14. L-류신 메틸 에스테르를 사용한 실험은 다양한 배양 조건에서 주변 세포 환경에 대한 미세아교세포의 기여도를 확인할 수 있는 능력이 있습니다. 본 연구실에서 최적화된 프로토콜을 사용하여 P5 설치류 소뇌 과립 세포 배양에서 미세아교세포를 제거하는 방법을 설명합니다. 이 접근 방식을 사용하면 실험 데이터에 대한 미세아교세포의 상대적인 영향을 평가할 수 있을 뿐만 아니라 미세아교세포가 뇌졸중, 알츠하이머병 또는 파킨슨병과 같은 신경학적 상태의 배양 모델에서 신경 보호 또는 신경독성 역할을 하는지 여부를 결정할 수 있습니다.

서론

인간의 두뇌는 추정 850 억 뉴런 및 아교 세포를 포함 하나 85000000000 다른 비 신경 세포를 포함한다. 영어로 번역 '아교 세포'의 따라서 그리스 어원 - 신경 과학자가 신경 세포 인구에 주로 초점을 맞추고있다 지난 100 년간의 큰 부분을 위해, 아교 세포를 믿는 것은 뉴런 구조 지원을 제공하는 수동적 인 지원 세포보다 조금 더 할 수 '접착제'. 최근에, 그러나, 신경 - 아교 상호 작용이 신경 생물학, 신경 생리학, 많은 신경 퇴행성 질환의 기원과 진행의 기본 측면에 훨씬 더 근본적인 될 수 있다는 것을 점점 더 분명되고있다. 소뇌 과립 세포 (CGCs), 인간의 두뇌에서 가장 풍부한 균일 신경 인구는 소뇌를 지배하고 세포 구성 성분의 90 % 이상을 차지한다. 따라서, 이러한 세포는 t위한 모델 시스템으로 in vitro에서 광범위하게 사용되어왔다그는 신경 발달, 기능, 병리 2-6의 연구.

그러나, CGC의 문화는 여전히 논란의 여지 상당한 비율의 미세 아교 세포 및 기타 아교 세포가 포함되어 있습니다. 그 결과, 추정되는 다른 세포 치료법에 직접 신경 반응을 표시 CGC 데이터가 실제로 발생할 수 - 부분적 또는 전체로 - 배양에서 신경교 이웃 간접 보조 응답으로부터. 이를 평가하기 위해, 우리는 선택적으로 L-류신 메틸 에스테르 (LME)의 도움으로 CGC의 연결을 문화에서 미세 아교를 제거. LME 원래 선택적 식세포 7을 파괴하는데 사용 lysomotropic 에이전트이며, 이후 선택적 신경, 성상 세포, 및 신경 교세포의 혼합 배양에서 8,9,10 미세 아교 세포를 고갈하는 데 사용되어왔다. LME는 리소좀 파쇄 및 후속 13,14 아폽토시스를 유발하며, 대 식세포와 미세 아교 세포에 의해 내재화된다. 대 식세포와 미세 아교 세포는 그들이 particula로 발생 리소좀에서 특징적으로 풍부LME 처리에 노출시 RLY 취약합니다. 이 프로토콜은 CGC 및 다른 신경 / 아교 세포 배양 시스템을 이용한 실험에서 미세 아교 세포의 기여를 확인 할 수있는 강력하면서도 간단하고 쉬운 방법을 제공합니다.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 실험은 영국의 동물 (과학적인 절차) 1986 년 법에 따라 수행 하였다.

악기, 문화 미디어, 그리고 요리 1. 준비

  1. 두 스테인레스 스틸 실험실 해부 가위와 두 개의 스테인레스 스틸 실험실 집게를 준비합니다. 문화 후드 O의 모든 악기와 장소를 압​​력솥 / N 살균 자외선 (UV) 빛 아래.
  2. 최소 필수 매체 (MEM) 배지 (500 mL로 10 % 태아 소 혈청 [FBS, 20 mM의 KCl을 25 mM의 NaHCO3를, 30 mM의 D- 글루코오스, 2 mM L- 글루타민, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 6 μg의 / ㎖ 암피실린) 및 필터 소독. 달 동안 4 ℃에서 보관하십시오.
  3. 14mm, 번호 1 두께 된 커버를 포함하는 24 잘 배양 플레이트를 준비합니다. 이전에 3 설명한 바와 같이 100 ㎎ / ℓ 폴리 D 라이신 (PDL)의 커버 슬립과 코트를 압력솥. 자외선은 O / N을 소독.

CGC 문화 솔루션 2. 준비

  1. 처리 된 오토 클레이브, UV 광, 멸균 DH에서 '용액 A'(100 ㎖)를 준비 포도당 250 ㎎, 소 혈청 알부민 [BSA] 300 mg을 인산염 완충 염수 [PBS (칼슘 및 955 ㎎을 함유하는 2 O 마그네슘) + 무료, 3.8 %의 1 ml의 황산 4 · 7H 2 O
  2. A. 용액 9 ㎖에 희석 / ㎖ 트립신 5 mg을 1 ㎖를 함유하는 '용액 B'(10 ㎖)를 준비
  3. '용액 C'1000 유닛의 DNase, 대두 트립신 억제제의 0.5 ㎎, A. 용액 10 mL로 희석하여 3.8 % 황산 · 7H 2 O 100 ㎕를 함유하는 (10 ㎖)를 준비
  4. A. 용액으로 20 ㎖로 희석 용액 3.2 ml의 C를 함유 '용액 D'(20 ㎖)를 준비
  5. · 7H 2 O EBSS, 25 mM의 NaHCO3를, 3 mM의 황산을 포함 BSA / 얼의 균형 소금 솔루션 (EBSS) 솔루션을 준비하고,4 % BSA, pH를 7.4으로 이전에 3을 설명했다.
  6. 150 mM의 LME의 최종 농도를 수득 MEM 배지 5 ㎖에 순수한 LME 추가하여 LME 준비 벤치 탑 pH 미터를 사용하여 pH를 7.4까지 용액을 복귀하고, 필터는 28mm의 폴리 에테르 설폰 (PES), 0.2 μm의 주사기를 사용하여 소독 필터.

3. CGCs을 배양

  1. 이전에 3 설명한대로 4-7 일 된 쥐 새끼에서 소뇌를 수집합니다. 얼음에 5 ml의 솔루션을 포함하는 배양 접시에 바로 배치합니다.
  2. 페트리 접시 뚜껑에 소뇌와 장소 조직에서 과잉 솔루션을 붓고.
  3. 적어도 세 개의 서로 다른 방향에서 잘 골조 면도날 미세 조직을 잘라.
  4. 5 분 동안 37 ℃에서 물을 욕조에 솔루션 (손실 제한 조직을 위해 솔루션 페트리 접시를 씻어) B와 장소에 다진 조직을 추가합니다. 분의 부드럽게 모든 커플을 흔들어.
  5. 트립신, 흔들림 센트를 중화하기 위해 튜브에 용액 D (20 ml)에 추가5 분 동안 65 XG에 rifuge.
  6. 상층 액을 붓는다.
  7. 현탁액 가능한 균질해질 때까지, 직경을 감소시키는 세 골조 유리 피펫으로 잘 용액 C. 씹다 4 ㎖ (약 10 회)에 재현 탁.
  8. 천천히 부드럽게 BSA / EBSS 위에이 균질 몇 방울을 추가합니다. 이 BSA / EBSS를 통해 싱크 시작하면, 더 씹다 및 / 또는 균질는 BSA / EBSS의 상단에 레이어에 앉아 있어야 좀 더 솔루션 C를 추가 할 수 있습니다. 흔들지 마십시오. 5 분 동안 100 XG 스핀.
  9. 상층 액과 MEM 배지 1 ㎖에 재현 탁 펠릿 (소프트)를 제거합니다.
  10. MEM 배지 500 μL에 80 만 셀 / 커버 슬립에서 혈구와 플레이트를 사용하여 세포를 계산합니다. 6 % CO 2와 37 ° C에서 인큐베이터에있는 장소.
  11. 매체에게 다음 날 (준비 후 24 ~ 36 시간)을 변경합니다. 세포주기 억제제 아라 비노 푸라 노실 시티 딘 (ARAÇ) 10 μM을 함유하는 MEM 배지 용액을 제조.
    1. 각각커버 슬립은 다시 세포와 정상까지 오래된 매체의 250 μl를 추가, 신선한 24 웰 플레이트에서 기존 매체의 250 μl를 유지 나머지를 대기음, 정상 MEM 배지 250 μl를 추가 한 다음, 세포를 씻어이 대기음 ARAÇ 함유 매체의 250 μL와.
      참고 : 세포는 체외 (DIV)에서 육일에서 사용할 수 있습니다.

4. 선택적으로 미세 아교 세포 고갈 (6 DIV에서 수행)

  1. 150 mM의 LME의 최종 농도를 수득 MEM 배지 별개 분취 량 5 ml의 순수한 LME 추가.
  2. pH 7.4의 용액으로 돌아가서 필터 28mm 폴리 에테르 술폰 (PES), 0.2 μm의 주사기 필터를 이용하여 멸균.
  3. 제어 배양 정상적인 MEM 배지와 함께 10 분 동안 37 O C에서 수욕 MEM 배지 자리에 50 mM의 (2 × LME)의 농도로 용액을 희석.
  4. 반 (250 μL) CGC의 문화 MEM 배지를 제거하고 37 ℃에서 유지한다.
  5. 취급 세포또는 제어 문화에 대한 LME없이 미리 예열 MEM 배지 (250 μL) 25 mm의 잘 농도를주는 1 : 즉, 2 × LME (250 μL)를 포함하는 MEM 배지로 1 희석.
  6. 1 시간 동안 6 % CO 2의 가습 분위기에서 37 ℃에서 세포를 배양한다.
  7. 두번 신선한 미리 예열 MEM 배지에서 세척 세포 LME - 함유 배지를 제거하고 배양 배지를 유지 및 해당 웰 신선한 미리 예열 MEM 매체의 동일 부피를 대체한다.
  8. (37 ° C에서 6 % CO 2 가습) 인큐베이터에 문화를 반환하고 추가 처리하기 전에 24 시간 동안 나머지 둡니다.

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결과

선택적으로 CGC 및 / 또는 혼합 된 문화에서 미세 아교 세포를 제거하기 위해이 기술의 능력을 정확하게 파악하고 자신의 주변 세포에서 미세 아교 세포를 분화하는 연구자의 후속 능력에 의존한다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 이것은, 예컨대 동종 렉틴-B4 같이, 소교 특정 셀 머신을 사용하여 달성 될 수있다.도 2에서 설명한 바와 같이, 성상 세포 및 신경 세포의 밀도 및 형태로 관측 변경은 각 주 치료 그룹에 대해 기록되지 않았다. 배양액 화합물 소교 특정 동작을 지원 단독 LME로 처리했을 때 중요한 신경 또는 성상 세포 형태의 유의 한 변화는 관찰되지 않았다.도 3a는 성상 세포 밀도 및 기본 설치류 성상 세포 배양 (12)로부터 형태에서 관측 변화를 도시하지 않지만 수행 오염 된 미세 아교 세포의 손실을 표시합니다. 그림 (b)에서와 같이, 변경없이 astrocy에테 밀도와 형태...

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토론

가장 중요한 단계는 CGC에서 미세 아교 세포의 성공적인 선택적 제거를 보장하기 위해 및 / 또는 혼합 된 문화가있다 : 1) 멸균 및 건강한 CGC 문화를 유지하는 단계; 2) 필터 LME 함유 배지를 살균하여 pH 7.4 용액을 복귀; 3) 유지 CGC 미디어를 유지하고 37 미디어 LME이 함유 열 충격을 방지하기 위해 C를 °; 4) 세포를 배양기 밖에 유지되는 시간을 줄이기 위해 빨리 작동.

이전에 우리의 실험실에서 최적화 된 농도 - 우리는 우리의 CGC 문화에서 미세 아교 세포를 고갈 25 mM의 LME을 사용했다. 그럼에도 불구하고, 일부 미세 아교 세포는 여전히 일부는 차별화 된, 비 증식 미세 아교 세포의 인구를 반영 할 수 믿고 LME 처리를, 다음 문화에 남아 있습니다. 실제로, Hamby et al. (2006)은 50 ~ 75 mM의 LME는 고밀도 성상 세포 단일 층 (13)에서 미세 아교 ...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 영국 Aims2Cure와 UCL Impact Award 박사 과정 학생의 지원을 받아 JMP에 수여되었으며, MRC Capacity Building 박사 과정 JMP에 대한 치매 박사 과정 학생의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
펜치 Sigma-AldrichF4142곡선 끝은 소뇌의 제거를 용이하게 합니다 
마이크로 해부 가위Sigma-AldrichS3146직선적이고 날카로운 점은 설치류 P4-7 해부를 용이하게 합니다 
L-류신 메틸 에스테르 하이드로클로라이드시그마-알드리치7517-19-3
EBSS 용액 Sigma-AldrichE7510-500 ml
Poly-D-lysineSigma-Aldrich27964-99-4사용 1일 전에 커버슬립을 코팅하십시오 
소 혈청 알부민 (BSA)Sigma-AldrichA9418
인산염 완충 식염수 (PBS)Sigma-AldrichP4417
DNaseSigma-AldrichD5025
대두 트립신 억제제 Sigma-AldrichT6414
마우스 anti-ED1 항체 앱캠ab31630

참고문헌

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  14. Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades. J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).
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