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방법 논문

마우스와 위식도 역류의 외과 모델

10.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53012

⸱

2015년 8월 25일

 ,  , 
1Department of Thoracic Surgery, Ningxia Medical University General Hospital, 2Cancer Research Program, North Carolina Central University, 3Department of Thoracic & Cardiovascular Surgery, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, 4Department of Medicine, Center for Esophageal Disease and Swallowing, Division of Gastroenterology and Hepatology, University of North Carolina at Chapel Hill

이 논문에서

요약

이 기사는 생쥐를 이용한 위식도 역류의 수술 절차를 보여줍니다. 이러한 모델은 위식도 역류 질환 및 잠재적으로 배럿 식도 및 식도암 연구의 메커니즘 및 치료법에 유용한 도구입니다.

초록

여러 가지 수술 절차가 동물에게 위식도 역류를 유도하는 것으로 보고되었습니다. 여기에서는 위 내용물, 십이지장 내용물 또는 혼합 내용물의 역류를 유도하기 위해 마우스를 사용한 세 가지 수술 모델을 보고합니다. 수술 절차와 일반 원칙은 상세히 설명되었습니다. 수술 경험이 있는 연구자라면 짧은 연습 기간 후에 이 기술을 잡을 수 있어야 합니다. 수술 후 대부분의 마우스는 생존할 수 있으며, 인간과 유사한 역류성 식도염이 발생할 수 있습니다. 그러나 마우스와 인간의 식도 사이에는 조직학적 차이가 있으며, 이는 이러한 수술 모델의 고유한 한계입니다. 배럿 식도 및 선암에 대한 연구에 사용하는 경우, 이러한 절차는 유전자 변형과 결합되어야 할 수도 있습니다.

서론

위식도 역류질환 (GERD)은 원위 식도의 위 또는 위십이지장 내용물에 장기간 노출되어 발생하는 만성 질환입니다1. 이러한 유해한 역류물에 장기간 노출되면 식도 상피 내의 고유 방어 기전이 손상되어 식도염2이 발생합니다. 바렛 식도는 만성 역류의 배경에서 발생하며, 식도 선암종의 위험이 증가한 전암 병변입니다3,4. 임상적으로 중요하지만, GERD, 바렛 식도 및 선암종의 메커니즘은 아직 잘 이해되지 않고 있습니다.

동물 모델은 인간 질병의 병인, 병리, 분자 메커니즘, 예방 및 치료에 대한 연구에 필수적입니다. 현재까지 다양한 GERD, 바렛 식도 및 선암종 동물 모델이 모델 동물을 사용하여 개발되었습니다5,6. 쥐 식도는 상피가 층상 편평 상피로 되어 있어 인간 식도와 조직학적으로 유사합니다. 쥐 식도는 각화와 점막하선의 부재 측면에서 인간 식도와 다르지만, 상대적으로 유지 비용이 낮고 정교한 유전자 변형이 가능하기 때문에 매력적인 모델 동물입니다. 쥐에서 GERD, 바렛 식도 및 선암종을 모델링하는 데는 두 가지 접근법이 일반적으로 사용됩니다: 역류 수술과 유전자 변형입니다. 역류 수술은 역류를 유도하는 가장 좋은 방법이고, 유전자 변형은 분자 변화를 모방합니다5,7. 역류 수술은 유전자 변형과 결합하여 질병 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 사용할 수 있습니다8.

여러 가지 수술 절차가 우리와 다른 연구자들에 의해 보고되었습니다6,9: (1) 위 역류: 십이지장 결찰, 십이지장 협착 및 앞배 결찰, Wendel 십이지장 성형술, 식도-위 문합; (2) 혼합 역류: 식도-위-십이지장 문합, 식도-십이지장 문합(또는 식도-장문합); (3) 십이지장 역류: 식도-위-십이지장 문합 및 위 절제술; (4) 화학 성분의 역류: 담즙 역류, 췌장 역류, 식도 관류; 그리고 (5) 식도 이식5. 최근에 자석을 사용한 식도-장문합을 통해 절개 역류를 생성하는 마이크로 수술 마우스 모델이 보고되었습니다10. 이러한 수술 모델은 in vitro 세포 배양 또는 유기형 배양 모델보다 장점이 있습니다. In vitro, 식도 세포는 높은 산도나 높은 농도의 담즙산을 함유한 배지를 견디지 못합니다. In vitro 실험에서 식도 상피 세포에 변화를 유도하는 데 일반적으로 사용되는 비결합 담즙산은 in vivo 십이지장 역류물에서 일반적으로 존재하지 않습니다. 따라서 그러한 in vitro 연구에서 도출된 결론은 주의해서 받아들여야 합니다.

마우스 식도의 수술은 크기가 작기 때문에 기술적 도전입니다. 수술 후 생존율이 낮아 통계적으로 확실한 결론을 도출하는 데 필요한 특정 샘플 크기의 실험을 할 수 없습니다. 과거에 우리는 장기 실험에서 마우스를 사용하여 위 역류, 혼합 역류, 십이지장 역류의 수술 모델을 성공적으로 개발하고 특성화했습니다9,11,12. 우리는 또한 다른 몇몇 그룹에 마우스 수술에 대한 상담을 제공했습니다. 여기에서는 이러한 모델을 연구실에서 확립하는 데 도움을 주기 위해 마우스에서 세 가지 수술 절차를 설명합니다.

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프로토콜

모든 동물 실험 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 마우스 준비

  1. 을 통해 마우스를 사용합니다 ~ 체중 20g 또는 수술 연령 6 ~ 위의 주.
  2. 수술 전, 쥐에게 실험 차우와 물 광고 무제한을 제공하고 12시 12분 시간의 명암주기를 유지한다.
  3. 머리 깎기와 수술 영역을 면도. 80 밀리그램 / kg 케타민, 12 밀리그램 / kg 자일 라진의 복강 내 주사하여 마우스를 마취. 이 용량은 몇 분 안에 잠에 마우스를두고 다음과 같은 외과 적 치료에 대한 충분한 마취를 제공합니다.
  4. 발바닥이 끼 때 각막 반사와 사지 수축의 부재에 따라 적절한 마취를 확인합니다. 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 윤활 적용합니다.
  5. betadine 용액으로 피부를 소독.

2. 위 역류 모델 (그림 1B)

  1. 위 확인항문을 가리키는 검상 돌기에서 시작 ~ 2cm의 중간 선 절개.
  2. 중간 선을 통해 복강을 엽니 다. 가위와 노출을 향상시키기 위해 칼 모양을 제거합니다.
  3. 별도의 간 및 위장 사이의 결합 조직을 잘라. 결찰 및 주문 안저까지 완전 무료로 비장과 안저의 혈관 번들을 잘라.
  4. 왼쪽으로 약간 안저를 켜고 분야에서 위식도 접합부의 왼쪽에 노출됩니다. 상피를 노출 예리한 가위를 사용하여 식도 따라 근육에 길이 5mm 절개를.
  5. 같은 방향 (절개 1, 그림 1B)를 따라 상피를 오픈. (절개 2, 3, 4, 그림 1B) 날카로운 운영 가위 forestomach의 대부분을 차단하기 위해 forestomach에 세 개의 절개를합니다. 위가 비어 있지 않은 경우,주의 깊게 위 내용물을 제거합니다.
  6. 8-0 prolene의의 수 투어를 배치재 정확한 점막에 지점을 통해 (forestomach에) (식도에) 및 포인트 '(테이퍼 포인트 바늘) 반대 점막합니다. 각각 점 B와 점 B ', 그리고 포인트의 다른 쌍을 통해 마찬가지로 장소 봉합. 균등 공간이 봉합 서로 3-4mm.
  7. 혈액과 위의 내용을 정리하는 생리 식염수로 복강을 세척 할 것. 실크 봉합사와 복부 벽과 금속 클립으로 피부를 닫습니다.

3. 혼합 환류 모델 (그림 1C)

  1. 팔로우는 위식도 접합부를 노출 2.4 2.1 단계를 반복합니다.
  2. 부드럽게 식도 뒤에 혈관에서 식도의 등 쪽을 분리합니다. 식도과 혈관 사이의 작은면 팁을 전달합니다.
    주 :면이 부분적으로 그 크기를 줄이기 위해 선단으로부터 제거 될 수있다. 이면 팁 식도를 해제하고 혈관을 보호 두 가지 목적.
  3. 두 5mm 길이 INC 확인위식도 접합부와 날카로운 운영 가위로 유문에 인접한 십이지장의 기단부에 isions 각. 십이지장에 절개를 들어, 혈관을 피하고 항 장간막 테두리에 배치했다.
  4. 중단 8-0 prolene의 봉합과 반대 점막 정확한 점막에 절개를 문합. 일반적으로 등쪽에 3-4 봉합과 전면에 2-3 봉합을 배치합니다.
  5. 면 팁을 제거합니다. 생리 식염수와 복강을 세척하고 복벽과 피부를 닫습니다.

4. 십이지장 역류 모델 (그림 1D)

  1. 혼합 역류를 생성하기 위해 3.4에 3.1 단계를 따르십시오.
  2. 조심스럽게 뒷면을 노출 위장을 들어 올립니다. 간 로브는 간, 위의 배면 사이의 결합 조직에 의해 잡힐 수있다. 결합 조직을 조심스럽게 잘라 적절히 간을 보호하고, 식도의 등쪽에 혈관을 노출.
  3. 결찰 및혈관을 절단. 결찰 및 위식도 접합부에서 식도를 잘라.
  4. 유문에 십이지장을 결찰. 결찰 및 mesenterium를 잘라. 전체 위장을 제거합니다.
  5. 생리 식염수로 복강을 세척 할 것. 복벽과 피부를 닫습니다.

5. 후 수술 적 치료

  1. 수술 후 가열 패드와 체온을 유지한다. 만 흉골 드러 누움을 회복 한 후, 다시 다른 동물과 마우스를 놓습니다.
  2. 감염을 예방하고 통증을 완화하기 위해 항생제와 진통제를 준다. Baytril를 주입 (10 ㎎ / ㎏, IP, QD, 3 일간) 감염을 방지하고, 부 프레 노르 핀 염산염 (0.05 ㎎ / ㎏, SC, 입찰. 이틀 동안) 진통제로. 금식은 수술 후 필요는 없습니다.
    액체 또는 부드러운식이 요법을들 수있다.
  3. 마우스는 다음과 같은 징후를 보여 매일 basis.If에 일반 건강 상태 (극적인 체중 감소> 15 %, 응용 프로그램의 부족을 평가etite, 발성, 쥐를 안락사, 입, 코, 눈, 구부리고 제스처, 활동, 비정상적인 정리 활동)에서 배출.

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결과

대부분의 마우스는 (> 95 %)이 수술을 견딜 수. 수술 전후 기간 동안 사망의 주요 원인은 마취제의 과다, 출혈 및 알 수없는 이유를들 수있다.

수술 후 4 주> 십이지장 역류과 위 역류 또는 혼합 역류> 80 % 마우스와 90 %의 마우스는 살아남을 수 있습니다. 이 기간 동안, 마우스는 주로 식도 협착과 먹을 수없는 사망. 이 마우스는 심한 스트레스 (구부리고 자세, 활동, 구토, 침몰 한 눈, 발성 등)의 흔적을 보여 안락사 될 필요가있다. 일반적으로 항생제 투여와 의료 죽어에서이 마우스를 저장할 수 없습니다. 마우스는 일반적으로 수술 후 그램의 부부 십이지장 역류와 특히 자신의 체중을 잃게됩니다. 그럼에도 불구하고 체중은 회복 이후에 증가한다.

마흔 주 수술 후, 십이지장 역류와 위 및 혼합 역류와> 70 % 마우스와> 80 % 마우스는 살아남을 수 있습니다. 지속이 기간...

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토론

다양한 수술 모델은 설치류에서 위, 십이지장 및 혼합 역류을 모방하기 위해 설립되었다. 여기에 설명이 세 가지 절차는 수술 후 생존의 합리적인 가격과 장기적인 실험에 적합하다. 수술 경험이있는 연구원은 연습의 짧은 기간 후에 기술을 파악 할 수 있어야한다.

출혈은 수술, 간, 위, 및 혈관의 부주의 한 손상 사이의 결합 조직의 분리시 간 열상 전 마취제의 복강 내 주사에 기인 할 수있다. 이것은 가능한 한 피해야한다. 배터리 구동 미니 소작 적절한 경우 지혈하는데 사용될 수있다. 기관 및 조직이 조작 될 때 과도한 극력 피해야 연신. 핀셋의 끝은면으로 포장 될 수있다, 또는면 팁 핀셋을 대체하기 위해 젓가락처럼 사용할 수있다. 마우스 식도는 두 개의 층 또는 두 개의 & #이8220; 관 ", 외부 붉은"근육 관 "과 내부 희끄무레"상피 관 ". 절개는 식도에 이루어질 때, 양 층은 절개 할 필요가있다. 봉합은 균등하게 반대...

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공개 사항

저자 중 한 명(XC)은 위식도 역류병과 관련된 기초 연구를 지원하는 Takeda Pharmaceutical Company Ltd로부터 자금을 받았습니다. 이 기사에서 사용된 시약이나 기기 중 이 회사에서 생산한 것은 없습니다.

감사의 글

우리는 중국 국가자연과학기금(NO. 81400590), 미국 국립보건원(U54 CA156735) 및 다케다 제약 주식회사(MA-NC-D-156)의 연구 보조금으로 지원을 받고 있습니다.

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재료

```html
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Dumont #1 Forceps Dumostar Tip Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Micro Clip Applying Forceps 5.5"Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide BladesRoboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCutRoboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
4-0 Silk Black Braid 100 Yard SpoolRoboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Halsey Needle Holder 5" SmoothRoboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock.6 mmRoboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Reflex 9 mm Wound Clip ApplierRoboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0Ethicon US, LLC
Ringer's solutionHenry Schein, Inc.
ketamineHenry Schein, Inc.
xylazineHenry Schein, Inc.
```

참고문헌

  1. Kandulski, A., Malfertheiner, P. Gastroesophageal reflux disease--from reflux episodes to mucosal inflammation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (1), 15-22 (2012).
  2. Orlando, R. C. The integrity of the esophageal mucosa. Balance between offensive and defensive mechanisms. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 24 (6), 873-882 (2010).
  3. Stairs, D. B., Kong, J., Lynch, J. P. Cdx genes, inflammation, and the pathogenesis of intestinal metaplasia. Prog Mol Biol Transl Sci. 96, 231-270 (2010).
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