쥐 뇌 미세 주입은 분자 기판 동기를 행동을 연구하기 위해

요약

설치류는 행동과 복잡한 정신 장애의 분자 기질을 조사하기에 적합한 모델입니다. 깨어 있는 설치류의 뇌 미세주입은 질병 기질을 밝히는 데 사용할 수 있습니다. 효율적이고 사용자 정의 가능한 뇌 미세주입 방법과 동기 부여를 정량화하는 조작적 패러다임의 실행이 제시됩니다.

초록

뇌 미세주입은 동기 부여와 같은 복잡한 행동의 분자 기질을 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 목적을 위해 설치류는 적절한 모델이 될 수 있는데, 부분적으로는 행동적으로 관련된 자극에 대한 반응과 자극-행동 결과를 파싱하는 회로가 인간과 설치류 간에 놀라울 정도로 유사하기 때문입니다. 복잡한 거동의 분자 기질을 연구할 때 특정 시스템을 수정, 증강 또는 침묵시키는 시약의 미세 주입은 매우 유용한 기술입니다. 그러나 결과 해석을 돕기 위해 미세주입 부위를 정확하게 타겟팅하는 것이 중요합니다. 최소한의 비용으로 정확한 미세주입과 무제한의 맞춤화가 가능한 수술 도구 및 미세주사 바늘의 제조 방법을 제시합니다. 중요한 것은 이 기술이 필요한 수술 절차를 다루는 다른 JoVE 기사와 함께 수행될 경우 깨어 있는 설치류에서 성공적으로 완료될 수 있다는 것입니다. 또한 동기를 측정하는 데 적합한 많은 행동 패러다임이 있습니다. 점진적 비율(progressive ratio)은 (종종 기하급수적으로) 증가하는 작업 요구 사항에도 불구하고 반응을 유지하기 위해 강화제의 효능을 정량화하는 일반적으로 사용되는 방법입니다. 이 분석은 강화 크기 및 약리학적 조작에 민감하여 효능 및/또는 동기를 강화할 수 있습니다. 또한 점진적 비율 강화 일정을 수용하기 위해 조작 소프트웨어를 프로그래밍하는 간단한 접근 방식을 제시합니다.

서론

설치류와 인간은 행동적으로 관련된 자극^1-3에 매우 유사한 방식으로 반응합니다. 이것은 설치류가 행동과 복잡한 정신 질환의 분자 기질을 설명하기에 적절한 주제임을 시사한다⁴. 동기 부여와 같은 복잡한 행동 과정의 분자 기질을 이해하려면 종종 뇌 미세 주입이 필요합니다. 뇌 미세주입 기술과 1차 동기 부여 분석이 모두 여기에 제시됩니다. 쥐가 피험자로 사용되지만 이러한 절차는 잘 다루어진 쥐에 쉽게 적용할 수 있습니다. 본 명세서에는 필요한 캐뉼러, 폐쇄기(dummy cannulae 또는 stylets) 및 마이크로인젝터의 제조를 위한 절차가 포함되어 있습니다. 제시된 방법은 조립식 도구보다 훨씬 더 유연하고 비용 효율적입니다. 이러한 유연성은 조건을 최적화할 때 유용하다는 것이 입증되었습니다. 중요한 것은 미세주입 절차를 사용하여 수많은 가설을 테스트할 수 있기 때문입니다. 여기에 제시된 기술은 광범위하게 적용할 수 있어야 합니다. 예를 들어, 수용체 리간드는 신경 화학을 이해하기 위해 미세 주입 될 수 있습니다^3,5,6; 세포 투과성 펩타이드 및 소분자는 세포 내 신호 전달 경로를 이해하기 위해 미세 주입될 수 있습니다^7-10; 독소, 이온 채널 차단제 또는 길항제 칵테일을 미세 주입하여 회로^1,11,12를 이해할 수 있습니다.

여기에 제시된 일반 프로토콜은 사용자가 특정 요구에 맞게 쉽게 조정할 수 있지만, 가벼운 손 제지 하에서만 깨어 있는 설치류에서 미세 주입이 발생하기 때문에 이 절차는 특히 행동 분석에 적합합니다. 마취나 특별한 구속이 필요하지 않습니다. 이것은 뇌 자체에 통증 감각이 없기 때문에 가능하다. 그러나 마취를 사용하지 않는 경우 이전에 입체적으로 이식된 캐뉼러를 통해 미세 주입이 이루어져야 합니다. 이는 통각(유해) 수용기(유해수용기)가 두피에 존재하기 때문이며, 뇌를 둘러싼 막인 수막(meninges)¹³과 두개골을 덮고 있는 막인 골막(periosteum)¹⁴에 존재하기 때문입니다. 마취 하에서 미세 주입이 때때로 바람직하다는 점에 유의해야 합니다. 한 가지 예는 바이러스를 주입하는 경우이며, 스테인리스 스틸 바늘¹⁵ 또는 유리 피펫을 통해 바이러스를 직접 주입할 수 있는데, 이는 조직 손상을 줄이고 형질도입 효율을 향상시킬 수 있기 때문입니다. ^16,17 아래에 설명된 마이크로인젝터는 이러한 목적으로 수정될 수 있으며, 이를 수행하는 방법에 대한 제안은 토론에서 찾을 수 있습니다. 다른 JoVE 논문에서 정위 유축성 뇌 캐뉼라 이식을 입증했기 때문에^18-20 이러한 절차는 여기에서 다루지 않습니다.

우리는 동기를 정량화하는 분석법과 함께 이러한 미세주입 절차를 제시합니다. 동기 부여 된 행동에 대한 여러 설치류 모델이 현재 활주로 상자 및 장벽 확장과 같이 사용 중입니다. 여기에서는 조작적 반응이 강화자에 의해 유지되는 동기를 정량화하기 위해 강화의 조작적 점진적 비율 일정을 사용하는 방법을 설명합니다. 누진적 비율에 대한 반응은 강화자 크기에 반응합니다. ^21,22 따라서, 이 분석법은 동기 부여 및/또는 효능 강화를 위한 대용물로 일상적으로 사용됩니다. ^21,23-30 몇 가지 훌륭한 리뷰에서 이 주제를 자세히 다루었기 때문에,^21,24 우리는 주로 실용적인 관심사에 초점을 맞출 것입니다.

프로토콜

동물 과목을 포함하는 절차는 버지니아 커먼 웰스 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드를 준수하고있다.

이전 수술과 미세 주입에 이물질 1. 준비

1. 재료 준비를 위해 설정 :
   1. 26 G 정맥 튜브, 33 G의 폐색 전선, 33 G 미세 주사 바늘 튜브, 마이크로 인젝터 플라스틱 튜브 (PE20 또는 동급), 두 매체 무게 직선 지혈제, 실험실 테이프, 눈금자, 영구 마커, 70 % 에탄올을 확보 (v / v)로, 저장 작은 튜브 (예를 들어, 20 mL 유리 섬광), 슈퍼 접착제, 보트의 무게, 및 회전 도구가 아닌 무거운 의무 차단 디스크를 장착.
      참고 :이 도구를 끌어 올리고으로 끈이나 테이프를 사용 피펫 팁 상자에 회전 도구를 보안이 도움이됩니다. 보안경을 착용하면 회전 공구를 사용할 때 부상을 방지하는 것이 중요하다.
   2. 조각을 연결합니다벤치에 실험실 또는 오토 클레이브 테이프.
2. 캐 뉼러의 준비 :
   참고 : 두 개 이상의 캐 뉼러는 양자 주입 쥐 당이 필요합니다. 하나의 추가의 캐 뉼러는 이후 단계에 사용한다.
   1. 마킹 및 절단의 과정에서 굽힘을 방지하기 위해 충분한 길이의 캐 뉼러 튜브의 섹션을 획득.
   2. 뾰족한 펜을 사용하여 단계 1.1.2에서 테이프에 15mm 기준 라인을 그립니다. 이 날카로운 영구 마커를 사용하여 튜브에 순차적 15mm 부분의 마킹을위한 가이드 역할을합니다.
   3. 튜빙 노치 위하여 회전 공구의 느린 회전 컷오프 디스크에 표시된 지점에, 캐 뉼러 튜브를 터치. 캐 뉼러를 회전 180˚와 튜브의 반대쪽을 노치. 이 폐색으로 이어질 수 있기 때문에, 완전히 튜브를 절단하지 마십시오.
   4. 급격 ~ 15mm 섹션으로 휴식하기 위하여 튜브를 구부리.
   5. 컷 - 오프에 수직 캐 뉼러의 각 잘라 끝을 잡고엄지와 집게 손가락 사이에 디스크. 차단 디스크 (즉, 에지가 아닌)의 큰 기대 표면에 팁을 만지면 서 정맥 튜브를 돌립니다. 이 둔화 팁을 생성합니다. 참고 : 그 오프 사이트 주사를 얻을 수에 대한, 캐 뉼러를 구부리지 마십시오.
   6. 림 (26) G 경 바늘 (갈색​​ 허브)와 캐 뉼러의 양쪽 끝이 모두 버가 제거되었는지 확인하고 정맥은 장애물이다.
   7. ~ 컷 정맥을 통해 35mm 더 내부에 장애물이 없는지 확인하기 위해 밀폐 와이어 컷의 샘플을 전달합니다.
   8. 개별적으로 언 클램프 지혈제를 사용하여 각 캐 뉼러를 선택하고 길이가 정확히 14mm가 있는지 확인하기 위해 통치자와 각 완료 정맥을 측정한다.
3. obturators의 준비 :
   1. 하나의 정맥 매체 무게, 바로 지혈과 약 절반 길이를 클램프. 벤치에 잠긴 지혈을 놓습니다. 정맥은 벤치에 수직이어야한다.
      참고 :이 정맥을그것은 가능성이 구부러로, 잠겨 지혈에 의해 개최되는 후 수술에 사용할 수 없습니다.
   2. 이 벤치에 도달 할 때까지 캐 뉼러로 밀폐 선의 한쪽 피드. 버어 벤치 도달을 방지되지 않도록 뉼러에 와이어 반송]. 즉, 캐 뉼러의 바닥에 도달. 막힘 및 추가 조직의 흉터를 방지 할 적절한 밀폐 길이.
   3. 벤드 밀폐 및 벤치 사이의 접촉을 유지하면서 ~ 30˚ 각도가 될 때까지 손가락으로 곤란에 의한 와이어. 굴곡의 각도는 헤드 캡과 평평하게 놓 및 과잉 어렵게 쥐 제거 할 만들기, 앞으로 향하도록 있는지 확인하십시오.
   4. 캐 뉼러에서 와이어를 제거하고 작은 대각선 절단기 (절단기)와 벤드 ~ 2.5 mm로의 잉여 부분을 잘라.
      참고 : 각 이식 캐 뉼러가 밀폐를 필요로 적어도 두 obturators는, 양자 주입 쥐 당이 필요합니다. 만들기밀폐 통해 추가 ~ 35˚ 굽힘 도중에 또한 동물에 의해 제거를 방지하는데 도움이된다. 캐 뉼러 및 사용까지 70 % 에탄올 (v / v)로 포함하는 별도의 유리 병에 obturators (예., 20 mL 유리 섬광), 그러나 적어도 O / N을 모두 저장합니다.
4. 준비 및 microinjectors의 테스트 :
   1. ~ 1m 길이 마이크로 인젝터 바늘 튜브의 조각을 얻습니다.
   2. 수직으로 고정 직선 지혈제와 마이크로 인젝터 튜브의 한쪽 끝을 잡고.
   3. 지혈 한 번 이상 주위에 단단히 코일에 튜브에 긴장을 유지하면서 지혈을 트위스트.
   4. 마이크로 인젝터 튜브의 반대, 느슨한 끝에서 32mm를 측정하고 두 번째 직선, 보통 무게 지혈제와 수직이 점을 파악하고 고정합니다. 32mm의 측 지혈제와 마이크로 인젝터 튜브가 느슨한 단부보다는 감긴 와이어 지혈에 가장 가까운 측에 가까운 표시 파악.
   5. 벤튜브에 긴장을 유지하면서 D 튜브는 앞뒤가 중단 될 때까지.
      참고 : 하나의 날카로운 상하 굴곡이 미세 주입이 원하는 뇌 부위에서 발생하는지 확인하는 것이 바람직하다 무딘 휴식을 생성합니다.
   6. 양쪽 끝이 직선과 내경이 방해받지입니다 있는지 확인하기 위해 마이크로 인젝터 튜브를 검사합니다.
   7. 마이크로 인젝터 칼라를 제조하는 데 사용되는 캐 뉼러 튜브를 획득.
   8. 측정하고 영구 마커 및 테이프 (단계 1.1.2)에 그려진 5mm 참조 행을 사용하여 정맥 튜브의 연속 5mm 섹션을 표시합니다.
      참고 : 각 마이크로 인젝터 한 칼라가 필요합니다. 목걸이는 마이크로 인젝터 와이어에 부착 단순히 짧은 캐 뉼러 있습니다.
   9. 튜브를 노치하기 위해 회전 공구의 느린 회전 컷 - 오프 디스크에 표시된 지점에, 정맥 튜브를 터치합니다. 캐 뉼러를 회전 180˚와 튜브의 반대쪽을 노치. 완전히 절단 튜브를 폐색 할 수 있습니다.
   10. 날카롭게~ 5mm의 섹션으로 그것을 깰하기 위해 벤드 마이크로 인젝터 칼라 튜브.
   11. 버의 대부분이 제거 된 것을 확인하기 위해 경 사진 26 G 바늘 (브라운 허브)와 칼라의 양단부의 내경을 연. 일부 작은 버 마이크로 인젝터 와이어를 잡아 따라서 접착에 도움이됩니다.
   12. ~ 각 마이크로 인젝터 튜브에 끝에서 2cm를 한 칼라를 밀어 넣습니다.
   13. 작은 무게 보트의 모서리에 슈퍼 접착제의 작은 풀을 만듭니다.
   14. 마이크로 인젝터 튜브 슈퍼 접착제의 적은 양을 적용 ~ 25mm로 절단 스크랩 캐 뉼러 튜브를 사용하여 일단 부에서 ~ 5mm. 이 마이크로 인젝션 튜브의 단부로부터 ~ 1mm가되도록 다음에,이 슈퍼 아교 비드 위에 칼라를 밀어. 접착제와 칼라의 양단을 커버.
       주 : 마이크로 인젝터 주위에 밀봉에서 플라스틱 튜브를 차단하므로, 칼라에 슈퍼 접착제의 큰 축적을 피하십시오. 이것이 것 같이, 마이크로 인젝터 튜브의 오픈 엔드에 슈퍼 접착제를 입지 않도록 중요하지만무효 (비 주사) 볼륨을 최소화하기 위해 가능한 불가능한 마이크로 인젝터는, 상기 단부에 가까운 칼라 슬라이드하는 것도 중요하다.
   15. 최대 칼라면 다른 작은 무게 보트의 외부에 완성 된 마이크로 인젝터를 린 24 시간 동안 건조 할 수 있습니다.
   16. 마이크로 인젝터 플라스틱 튜브 ~ 8cm 조각을 얻습니다 (PE20 또는 동급), 1 멸균 물이 가득 ML의 주사기, 26 G 경 바늘 (갈색​​ 허브).
   17. 튜브에 구멍 않도록하면서, 주사기와 바늘에 절단 된 튜브를 슬라이드에 26 G (갈색 허브)에 바늘을 연결합니다.
   18. 건조, 완전한 마이크로 인젝터의 칼라 끝을 통해 플라스틱 튜브를 밀어 넣습니다.
   19. 개통을 테스트 할 수있는 물이 채워진 주사기 플런저를 짠다.
       참고 : 물이 아주 멀리 똑바로 마이크로 인젝터 팁에서 분사해야합니다. 스트림이 직선이 아닌 경우, 주입 위치는 정확하지 않을 것이다. 옆으로 또는 확산 스프레이의 소스는 가난한 휴식 (단계 1.4.5)입니다. 마이크로 인젝터해야 없음스프레이 옆쪽 또는 미만성 경우 t가 사용될. 이 마이크로 인젝터 또는 바늘을 막히게 할 수 식염수로는 사용되지 않아야한다.
   20. 마이크로 인젝터에서 물을 제거하기 위해 다시 주사기를 당깁니다. 예를 들어, 20 ㎖ 유리 섬광 유리 병, 건조하고 밀폐 된 유리 병에 보관하십시오.
       참고 : Microinjectors 대부분의 슈퍼 접착제와 제조, ^{31 일} 이후 멸균 할 수 있지만, 이것은 경험적으로 결정되어야한다. 대안 멸균 기술은 에틸렌 옥사이드 및 감마선 조사를 포함한다.

2. 준비 및 공연 Microinjections

1. 완료 microinjectors를 확보, 마이크로 인젝터 플라스틱 튜브 (PE20 또는 동등), 미세 주입 펌프, 작은 두 개의 무게 보트, 멸균, 70 % 에탄올 (v / v)로, 아세톤, 무딘 바늘 (25 G)와 두 기밀 1 μL 유리 주사기, 목화 나무 애플리케이터, 예비 obturators, 1 ML의 주사기를 밀고, 26 G (갈색 허브) 바늘, 작은 곡선 집게 (스타일 # 7 권장), 및 실험실 승IPE들.
2. 주사 microinjectors 준비 :
   1. 둘 사이의 각도가 95˚ ~되도록 벤드 15mm 칼라 대향 단부로부터 마이크로 인젝터를 완성 하였다.
      참고 : 정확한 벤드 위치가 정확 주입 위치에 대한 필수적입니다. # 7 집게를 사용 (또는 유사) 마이크로 인젝터를 잡아 위쪽 굽힘 유용합니다. 항상 microinjections를 수행하기 전에 길이를 다시 측정한다.
   2. 마이크로 인젝터 칼라에 플라스틱 튜브 (PE20)에 ~ 70cm 슬라이드를 잘라.
      참고 : 두 개의 서로 다른 솔루션을 주입 특히, 주사를 완료 할 때 마이크로 인젝터 느슨한 끝을 모두 근처에 하나의 플라스틱 튜브에 테이프 탭을 추가하면 유용합니다. 그들이 주입하는 동안 복잡 해짐에 따라 탭은 모두 튜브를 사용하지 않는 것이 좋습니다.
3. microinjections을 위해 펌프를 준비 :
   1. 펌프의 전원을 켭니다.
   2. 미세 주사 바늘의 직경, 원하는 주입 속도를 설정하고 주입량을 대상으로.
      참고 : 주입 쥐E 및 주입 부피는 실험 요구에 의존한다. 이것은 토론에 자세히 설명되어 있습니다. 일부 펌프는 주사기 테이블이 사전로드되어. 그렇지 않은 경우, 주사기 테이블 제조 웹 사이트 (들)에서 찾을 수있다.
   3. 정확한 볼륨이 자동으로 전달 될 수 있도록 '볼륨'에 펌프 모드를 설정합니다. '펌프'모드가 대신 선택되면, 실험자 수동 펌프를 정지한다.
   4. 주사기 주입 볼륨 플러스 추가로 0.2 μL에 기입 할 수 있도록 펌프 역전을 조정합니다.
4. 주입을위한 미세 주입 주사기 및 마이크로 인젝터 준비 :
   1. 미세 주입 펌프의 랙에 각 기밀 미세 주입 주사기를 잠급니다.
   2. 보트의 무게를 가볍게 내부 배선에 기름칠을하는 플런저를 펄럭 작은에 포함 된 멸균 수로 기밀 주사기의 끝을 놓습니다. 균등 물을 채우기 위해 펌프에 역전에 플런저를 잡아 당깁니다.
   3. 공동은 PE20 튜브 슬라이드멸균 수로 가득 1 ML의 주사기에 부착 된 26 G (갈색 허브) 바늘 상 (단계 2.2) 마이크로 인젝터에 nnected. 마이크로 인젝터를 통해 멸균 스프레이, 스프레이 패턴과 거리를 검사합니다.
      참고 : 물이 아주 멀리 똑바로 마이크로 인젝터 팁에서 분사해야합니다. 스트림이 직선이 아닌 경우, 주입 위치는 정확하지 않을 것이다.
   4. 멸균 필드에 멸균 마이크로 인젝터를 놓습니다.
   5. 또한 바늘에 의해 손상 영역 아래의 튜브를 절단하는 동안 밖으로 떨어지는 물을 방지를 위해 세워 마이크로 인젝터 튜브를 유지, 바늘의 오프 튜브를 밀어 넣습니다.
   6. 바늘 상 (즉,이 마이크로 인젝터에 접속되어있다)의 바늘 끝에 방울을 생성하고, 물이 채워진 PE20 튜브를 밀어 약간 앞으로 마이크로 인젝션 주사기 플런저를 밀어.
      참고 :이은에 형성 할 수 막힘을 제거 할 수 적절한 배압을 허용하는 액체에 액체 연결을 만듭니다마이크로 인젝터의 팁.
   7. 샘플 로딩을 준비하고 흔적 에탄올은 마이크로 인젝터에 남아 있지 않도록 완전히 앞으로 플런저를 밀어 넣습니다.
   8. 깨끗한 실험실에 마이크로 인젝터의 끝 부분에 형성된 여러 번 닦아 한 물 방울을 터치하여 누수에 대한 설정을 확인합니다.
5. 참고 : 실험실에 접촉 할 때 와이프, 하나의 젖은 자리를 형성해야한다. 자세한 상품이있는 경우, 시스템의 누설이있다.
6. 슈퍼 접착제 응용 프로그램 (단계 1.4.14)를 제어하여 날카로운 가위 또는 면도날 PE20 튜브는 모든 연결에서 제거되는 임의의 시간에 PE20 튜브를 트리밍하여 누수를 피하십시오. 또한, 반복 누수를 해결하기 위해 2.4.8을 통해 2.4.3 단계를 반복합니다.
7. 0.2 μL 다시 주사기 플런저를 잡아 당겨; PE20 튜브 / 마이크로 인젝터의 멸균과 솔루션 사이의 거품을 생성하는 주입한다.
8. 주 :이 버블 테이트의 희석 물의 오염을 방지하고, 허용주입 처리의 모니터링 그것은 주입 동안 이동하기 때문이다. 하나의 고체 거품이 생성되어야한다. 이 깨진 경우, 누수가 존재 또는 마이크로 인젝터 팁이 가려 짐; 그 단계 2.4.8 (첨부 참고)를 표시하는 반복해야합니다.
9. 시약에 마이크로 인젝터 주입 할 수 놓고 천천히 역전에 주사기 플런저를 잡아 당깁니다.
10. 주입을 위해 동물을 준비 :
11. 실험자의 가슴에 대한 쥐의 가슴을 잡고. 70 % 에탄올에 적신면 주걱으로 캐 뉼러 주위를 청소 (V / V).
12. 참고 : 적절한 처리와 함께, 마우스가 부드럽게 잔 모양의 손에 억제 할 수있다. 그렇지 않으면, scruffing이 필요할 수 있습니다.
13. 70 % 에탄올로 무게 배에 작은 집게와 장소를 사용 obturators 제거 (v / v)로.
14. 주사를 수행 :
15. 정맥로 채워진 마이크로 인젝터 (단계 2.4.10)을 놓습니다. 미세 주입 펌프 및 모니터 거품 운동 눌러 시작.
16. 주 : MAY는 microinjectors이 들지 않도록 가벼운 압력을 적용하는 것이 필요합니다. 거품 (단계 2.4.9에서 형성)을 균일하게 발전 마이크로 인젝터에 입력 완전히한다.
17. 캐 뉼러로부터​​ 제거하고 microinjectors 주입이 완료되고 포스트 분사 확산 기간이 지나면 교체 obturators.
18. 참고 : 일반적인 포스트 분사 확산 시간은 2입니다 - 약리 시약 4 분, 2 - 바이러스에 대한 10 분. 포스트 주입 기간 동안의 마이크로 인젝터두면 캐 뉼러까지 다시 환류보다는 조직으로 확산 인젝을 방지 할 수 있습니다. 에탄올 가득한 무게 보트의 측면에 배치 obturators는 에탄올 정맥에 다시 삽입하기 전에 배출 허용합니다.

3. 주입 후 정리

1. 멸균, 70 % EtOH로, 아세톤 : 하나의 작은 각의 병을 얻습니다.
2. 마이크로 인젝터 및 미세 주입 주사기 청소 :
   1. 유리 주사기를 제거유리 주사기에서 펌프 주사기 랙 및 미세 주입 튜브에서의.
   2. 유리 주사기에서 분리 마이크로 인젝터 튜브와 26 G 바늘 (갈색​​ 허브)를 통해 마이크로 인젝터 튜브에 멸균 물이 가득 한 ML의 주사기를 연결합니다. ~ 0.3 ml의 추방 앞으로 1 ML의 주사기의 플런저를 밀어 넣습니다. 다음에 마이크로 인젝터의 끝을 터치 실험실 닦아 다시 마이크로 인젝터를 통해 공기를 빼냅니다.
      주 : 신중한 것으로 간주되는 경우에는 마이크로 인젝터 튜빙 유사한 실험을 위해 재사용 될 수있다.
   3. 멸균 물에 유리 주사기 바늘을 삽입하고 완전히 다시 플런저를 그립니다. 다음, 플러시 완전히 앞으로 플런저를 밀어 넣습니다. 실험실 유리 주사기의 끝 부분을 터치에는 액체가 남아 있지 않도록 닦아주십시오.
   4. 멸균 수, 공기, 70 %의 EtOH, 아세톤의 순서로 단계를 반복 3.2.3 : 멸균 수, 멸균 수, 공기, 공기, 70 %의 EtOH, 70 % EtOH로, 공기, 공기, 아세톤, 아세톤, 공기, 공기. 이러한 청소 단계를 모두 수행하면 미세 주입 주사기를 유지하는 데 도움이됩니다.
   5. 포장에 마이크로 인젝터 주사기 (들)을 놓고 0.05 μL로 다시 플런저를 잡아 당깁니다.
      참고 :이 중요하다, 그것은 어떤 소금 보증금은 저장 후 형성해​​야 발생할 수 있습니다 붙어 플런저을 제거하기 위해 밀거나 당겨 할 플런저를 할 수있다.

동기 부여의 분석 4. 프로그래밍

1. 관리자 자격 증명을 사용하여 그래픽 상태로 로그인합니다.
2. 선택하거나 관련 데이터베이스를 만듭니다.
3. 진보적 인 비율 강화 계획을 만들기 :
   1. 선택 목록> 데이터베이스 레벨 목록> 이벤트 전환 매개 변수를 나열합니다.
   2. 선택 '추가'. 해당 목록 번호 (L 번호) 및 설명을 입력합니다.
   3. '이벤트 추가'를 선택합니다.
   4. 첫 번째 보강 일정 값을 입력하고 '추가'를 선택합니다. 반복합니다.
      주 : 값 프로그레시브 일정 비율 = 5E ^{(j *의 (보강제)는 + 1를 취득) -5-} 식을 사용하여 결정될 수있다 ^(7).적절하게 가설을 테스트하기 위해이 식을 조정하기 위해, j 값은 경험적으로 결정되어야하거나 문헌에서 얻은.
   5. '선택 주문 상자 내에서'순서 '를 선택합니다.
   6. '완료'상자에서 '____에 = 값을 보관 유지'를 선택합니다. 지금까지 응답이 예상을 초과 텍스트 상자에 보강 일정 값을 입력합니다. 목록이 소진 된 후에이 이후의 모든 항목에 대해 필요한 노력을 할 것이다.
4. 실험 프로토콜을 만들기 :
   참고 : 그래픽 상태가 종료 중 시간 또는 성능 기준에 기반으로하는 일련의 상태를 통해 피사체를 이동합니다. 적절하게 검사에서 가설을 테스트하기 위해 '$'로 아래에 표시된 모든 이산과 문맥 단서 및 매개 변수를 설정합니다.
   1. 실험 프로토콜 만들기> 파일을 선택합니다.
   2. 해당 텍스트 상자에 원하는 프로토콜 번호 및 설명을 입력합니다.
   '국가 만들기'를 선택합니다.
5. 과 'FIN - 완제품 상태'- '준비 상태 RDY'모두에 대한 모든 자극을 설정합니다.
6. '새로운 국가'를 선택하고 'S2 이름 - 홍보 응답을.
7. '새로운 국가'를 선택하고 이름을 'S3 -. 홍보 보강제 및 큐'
8. '새로운 국가'를 선택하고 이름을 'S4 - 시간 초과'.
9. 하이라이트 'S1'하고 이름을 'S1 -. 요법 이니'
   1. 추가 선택 '시간 이동을.'
   2. . 분 예를 들어, 적절한 시간 ($) 및 단위 ($)를 입력하고 S 드롭 다운 상자에서 'S2'를 선택합니다. 데이터베이스를 처음에 만들 때 시간 단위 '단위'가 결정되었다.
      참고 : 생성 된 시간 전환 [$ 후 분 (S2)에, = 100 % P GO] 유사 읽어야 그림 1은 한 번 생성 된이 이벤트의 예입니다.

현재 상태가 2 (S2)를 상태로 ​​종료해야 할 때 그림 1. 대표 프로그래밍 예 # 1. 시간 구분 된 상태가 도시되어있다이 경우는있는 분 여기에 표시된 $의 사용자 정의 값은 나타냅니다.

9. 하이라이트 '(S2) - 홍보 응답.
   1. 선택 추가 '이벤트 이동에.'
   2. L $ (예를 들어, L1)로 첫 번째 텍스트 상자에 단계 4.3에서 만든 진보적 인 비율이 일정을 포함하는 목록의 이름을 입력, 해당 operandum을 선택 (예., 레버 또는 코 포크) 처음부터이 '드롭 다운 상자, 선택 S에 이르기까지 S3는 '드롭 다운 상자.
      참고 : 생성 된 이벤트가 유사한 판독 할 수있다 [1 L $ IF - (S3)에게, 활성 GO P = 100 %]. 식별자 (1) - 활성은 데이터베이스 생성시 지정되었다. 여기에, 1 - 액티브스위치 하나에 연결 operandum를 참조한다.
   3. '시간 이동을 추가합니다.'를 선택
   4. 드롭 다운 상자, 'R'확인란을 적절한 시간 및 단위 ($)를 입력하고 s의에서 'FIN'를 선택합니다.
      참고 : 생성 된 시간 이벤트가 유사한 읽을 수 있습니다 [$ 분 FIN TO, P는 = 100 % 가십시오 R (확인)]. 이것은 세트 임계 후 그 operandum에 활동이없는 경우 세션이 끝날되도록 것이다. 동물이 설정 한 시간 동안 보강제 쌍이 operandum에 응답 보류 후 즉, 세션 타임 아웃된다.
   5. 선택 추가 '이벤트 이동에.'
   6. , 'R'확인란을 첫 번째 텍스트 상자에 1을 입력 한 첫 번째 드롭 다운 상자에서 적절한 operandum의 방출을 선택하고 S 드롭 다운 상자에서 'S2'를 선택합니다.
      참고 : 생성 된 이벤트가 유사한 읽을 수 있습니다 [R (S2)에, $ [1] 활성 GO P = 100 % 후 (확인)]. 이 단계는 그 operandum의 해제시 보장상태가 따라서 세션 시간 초과 임계 값 (4.4.9.4)을 재설정, 다시 입력된다 (위 괄호로 표시). 리스트에 포함되어있는 누진 비율 (스텝 4.4.9.2) 또는 아웃 세션 시간 (단계 4.4.9.4)를 완료하면이 시점에서, 상태는 종료 할 것이다. 따라서 operandum 활성화 될 때마다, 그것은 비 진보적으로 센다. . 그리고, operandum가 비활성화 될 때마다이, 예를 들어, 레버가 해제 또는 코 포크가 종료되고, 세션 시간 초과 임계 값 (단계 4.4.9.4)입니다 리셋 그림 2는 'S2 프로그래밍 모든 전환을 나타냅니다 - 응답 홍보.. '

도 2 주제 프로그래밍 예 # 2. 여기에서, 상태는 두 가지 기준 중 하나에 종료된다. L $으로 단계 4.3에서 만든 진보적 인 비율 일정입니다. 일정 COMPLET시이온은, 상태가 3 (S3)를 상태로 종료됩니다. 이 기준은 일정이 상태로 각각의 재진입에 다시 시작하는 것보다 발전 할 수있는 R을 가지고 있지 않습니다. 상태는 '$'분 종료는 FIN을 진술 할 수있다. 이 응답에는이 창 내에서 발생하는 경우 세션이 종료되지 않습니다 후 소정의 시간 제한 임계 값이다. 이것은 토론에서 더 설명된다. 마지막으로, 세션 시간 제한 임계 값은 모든 operandum 자료에 리셋됩니다. 따라서, '[1]'의 방출 operandum를 나타내는 '1'.

9. 하이라이트 '(S3) - 홍보 보강제 및 큐.'
   1. 선택 '추가 시간 이동으로'
   2. S 드롭 다운 상자에서 'S4'를 보강재 ($)를 제공하고, 선택하는 적절한 시간과 단위를 입력합니다.
      참고 : 생성 된 시간 이벤트가 [S4에게, $ 초는 P로 이동 한 후 = 100 %] 유사 읽을 수 있습니다.
10. 하이라이트 '(S4) - 타임 아웃.'
    '시간 이동을'추가를 선택
11. 비활성 상태 ($) 다음 보강제 전달에 남아 및 S 드롭 다운 상자에서 'S2'를 선택하는 적절한 시간과 단위를 입력합니다.
    참고 : 생성 된 시간 이벤트가 [(S2)에, $ 초는 P로 이동 한 후 = 100 %] 유사 읽을 수 있습니다. 주 '(S4) - 제한 시간은'모든 설계에 필요하지 않을 수 있습니다.

선택 해결 상태.
참고 :이 프로토콜은 현재 실행 준비가되어 있습니다.

결과

여기에서 우리는 상기 절차를 얻을 수있다 결과의 예를 도시한다. 표시된 첫 번째는 바이러스 벡터 (그림 3)에 의해 형질 전환 된 전형적인 지역이다. 일반적으로 ³ ~ 1mm의 형질 볼륨 선조체 조직을 얻을 수있다. 형질 영역의 부피 카발리의 방법을 사용하여 직렬 섹션에 걸쳐 정량화 될 수있다 ^(32)이 중요한 것은, 형질 볼륨은 형질되는 조직의 형태와 같은 많은 요인에 의존한다.; 바이러스 혈청 형; 프로모터; 속도 및 주입 부피; 주입 된 입자의 수​​; 인젝 산도; 및 만니톨과 같은 삼투압 시약, 여부, 사용되었다. ^{33, 34 일반적으로,} 우리는 10 분에 걸쳐 10 ~ ¹² 입자 / ㎖, 1 μL /면을 microinject 및 obturators 교체 7 분 추가 이전 할 수 있습니다. 또한, pH가 테이트 8. 다음 주위 통상, 우리는 동기가 어느 유전자의 발현에 의해 조작 될 수 있음을 보여준다 (도 4)또는 약리 시약 미세 주입 (그림 5).

그림 4에서 우리는 독점적으로 디자이너 마약 (DREADDs)에 의해 활성화 디자이너 수용체를 표명했다. DREADD 수용체 코딩 영역은 내부 리보솜 항목 사이트 및 mCitrine 카세트으로 이어졌습니다. mCitrine는 형질 감염된 세포의 편리를 육안으로 확인 할 수 있습니다. DREADD는 이종삼 G- 단백질 Gαq에 커플 링시켰다. 성상 세포, ^28,35 및 DREADD 자체를 자극 할 수 Gαq 결합 DREADD의 활성화는 클로자핀-N-산화물 (CNO, 3 ㎎ / ㎏, IP)의 전신 투여에 의해 활성화 될 수있다. ^14,22,36 쥐에 훈련을받은 레버는 3 레버 프레스 60 연속 일 동안 매일 1 시간 세션 동안 마실 1 기회를 얻었다 에탄올 보강에 대한 반응한다. 다음, 쥐 금욕을 강요하고, 핵 핵심 성상 세포를 중격 의지에 Gαq 결합 DREADDs 표현했다. 삼주의 절제, 자기 ADMI에 의욕 후 nister 에탄올 브레이크 포인트에 의해 측정 하였다. 핵 ^21,27-30 활성화 CNO 전신 투여를 통해, 절제는 차량에 비해 후 에탄올자가 투여를 재개 쥐의 의욕을 감소 코어 성상 중격 의지. 중요한 것은, CNO 대신 DREADD의 녹색 형광 단백질을 발현시켰다 동등 훈련 코호트에 영향을 미치지 않았다.

마이크로 인젝션 된 바이러스에 의해 형질도 3 대표 복측 선조체 지역.이 이미지는 핵의 영역은 위의 방법에 따라 형질 감염시켰다 아스트로 중격 의지를 나타낸다. 데이터는 저작권 소유자의 허가를 불 등. ^13에서 재 인쇄되어 있습니다. 그 세부 사항은 첨부 된 간행물 및 보충 자료에서 발견 될 수있다."빈>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

자기 관리] 에탄올에 쥐 그림 4. 동기 부여는 핵 핵심 성상 세포를 중격 의지에. 표현을 통해-바이러스가 표현 할 일주를 허용 한 후 바이러스가 미세 주입하고, 동기는 브레이크 포인트를 통해 측정 한 형질 전환 유전자를 활성화하여 감소 하였다. 유전자는 전용 디자이너 마약 (DREADDs)에 의해 디자이너 수용체 활성화 된 표현. 일원 분산 분석 (F (2,30) = 3.29, P = 0.04)은 Scheffe 사후에 의해 밝혀 다음에 그 클로자핀-N-산화물의 전신 투여에 의한 DREADD의 활성화 (CNO, 3 ㎎ / ㎏, IP ) 크게 대신 DR의) CNO는 녹색 형광 단백질 (GFP를 표현했다 동등하게 교육을받은 집단에 영향을 미치지 아니합니다 차량에 비해 절제 후자가 관리] 에탄올에 쥐의 의욕을 감소EADD. 데이터는 저작권 소유자의 허가를 불 등. ^13에서 재 인쇄되어 있습니다. 그 세부 사항은 첨부 된 간행물 및 보충 자료에서 발견 될 수있다.

그림 간극 결합 차단제 5. 미세 주입은 절제 후 에탄올을-관리 자체에 쥐의 의욕을 증가 두 간극 결합 차단제는 에탄올 관리 자체에 쥐 (브레이크 포인트를 통해 측정) 동기 부여에 미치는 영향을 평가 하였다 :. 메플로퀸 및 18 α - 글리시 레틴 산 (18-α)를. 두 일원 분산 분석은 핵으로 갭 접합 차단제의 미세 주사가 핵심이 절제 후 에탄올을-관리 자체에 쥐의 의욕을 증가 중격 의지 것으로 나타났다 (F (3,40) = 5.56, P = 0.003). 데이터는 저작권 소유자의 허가를 불 등. ^13에서 재 인쇄되어 있습니다. 자세한 사항은이 책에서 찾을 수 있으며첨부 된 보충 자료.

토론

여기에 제시된 방법은 마이크로 인젝션 캐뉼라 및 동기 동작의 분자 기판을 밝히는데 도움이 될 microinjectors를 제조하는 효율적인 수단이다. 이 방법은 몇 가지 장점을 제공한다. 첫째, 자신의 임플란트와 microinjectors을 제조하여, 새로운 실험 매개 변수를 신속하게 최적화 할 수있다, 즉, 하나가 도착하기를 맞춤 제작 한 부품을 기다릴 필요가 없습니다. 둘째, 정맥의 작은 직경으로 인해, 더 캐뉼라를 동시에 주입 할 수있다. 이것은 생존을 향상시킬 수 있습니다 필요한 수술 시간을 단축하고, 또한 동물 당 여러 개의 임플란트를 할 수 있습니다. 고정비 패러다임 빠르게 단순히 원하는 보강 일정 포함 된 이벤트 전이 파라미터리스트를 적용하여 프로그레시브 비율 패러다임으로 전환 될 수 있기 때문에, 셋째, 조건화 챔버를 제어하는​​데 사용되는 소프트웨어를 용이 프로그레시브 비 스케줄을 수용한다.

되려고광범위하게 유용한, 일반적인 미세 주입 절차는 현재 거의 모든 시약의 미세 주입을위한 광범위하게 적용해야한다고 제시했다. 따라서, 우리는이 기술은 약간의 수정과 향후 유사한 높은 유틸리티로 계속 될 것으로 예상하고있다. 단지 약간의 변수를 변경함으로써, 이러한 접근 방법은 시약의 다양한 개수에 적용될 수있다. 가장 일반적으로 조작 할 것이다 매개 변수는 마이크로 인젝터는 정맥 돌출 길이, 사출의 볼륨 및 주입 속도를 포함한다. 예를 들어, 하나의 주사기는 일반적으로 만성 임플란트 주위 아교 흉터 형성을 방지하기 위해 캐뉼라 팁에서 더 돌출 할 수있다. 또한, 하나의 더 큰 부피를 주입해도된다. 그 사용에 비하여 (10 분의 추가 시간 확산 자주 7 - - 10 분 및 3) 선조체 바이러스 microinjections 들어, 1 μL의 부피는 통상적으로 사용되며,이 볼륨은 전형적으로 장기간에 걸쳐 주입하여약리 시약 D (일반적으로 0.3 - 3 분 플러스 1 - - 2 이상 0.5 μL 3 분의 추가 확산 시간). 사용자는 문헌을 참조 및 / 또는 경험적으로 자신의 요구에 가장 적합한 매개 변수를 결정해야한다. 주사 전에 마이크로 인젝터의 분사 패턴의 1) 캐 뉼러의 길이, 2) 마이크로 인젝터 길이, 3)의 품질, 및 4) 시스템 무결성에 관계없이,이 절차의 성공은 4 변수 결정적으로 의존한다. 미세 주입 위치가 마이크로 인젝터는 정맥에서 돌출 깊이에 의존하기 때문에 모두 캐 뉼러 (단계 1.2.8) 및 마이크로 인젝터 길이 (포스트 굽힘, 단계 2.2.1)를 모두 정확하게 모든 주제 사이에 알려진 균일 한 것을,이 필수적이다 . 이것은 쉽게 용이라도 그 최종 재 측정에 필요한 길이 아니다 구현 거부에 의해 제어 될 수있다. 이 가이드 뉼러 바로 아래에 발생하는 경우 또한, 주입 위치 만 예측 될 수있다. 따라서, 어떤 마이크로 인젝터를 미상 그테스트에 긴, 미세 스트림을 뿌리지 S (단계 2.4.6)을 거부해야합니다. 품질 주입은 또한 종래 주입 시스템의 무결성에 관한 것이다. 여러 관광 명소 랩 닦아에서 관찰 된 인젝터에서 모든 물을 분배 후 (전 시약과 충전에) 경우, 누수가 (단계 2.4.8에 대한 참고) 해결 될 필요가있다. PE20 튜브 내의 물에서 약물을 분리 버블 (단계 2.4.9)가없는 한, 하나의 기포 (마이크로 인젝터 시약을 충전 한 후) 인 경우, 또한, 후 분사가 부분적으로 막혀있다. 이 방해하거나 예방 주사를 전환 할 수 중 하나. 이 너무 쉽게 해결 될 수있다 (참고 단계 2.4.8에서).

하나는 세 가지 대안이있는 동물이 고정대에있는 동안 microinject하고자합니다. 첫째, 하나는 정위 매니퓰레이터 의해 단단히 유지되고 또한 PE20 튜브에 연결을 허용하도록 충분히 연장 될 수 있도록 마이크로 인젝터 칼라의 길이를 증가시킬 수있다. 둘째,에전자는 일시적으로 정맥을 이식하고 여기에 제시된 표준 마이크로 인젝터를 사용할 수 있습니다. 셋째, 하나 그린과 광택 유리 피펫 사용할 수 있습니다. ^{(16, 17)}

여기에 제시된 방법의 중요한 한계는 최상의 절차에 익숙 잘 처리 래트에서 수행된다는 점이다. 동일한 조사자 2 개월 이상 매일 랫트를 취급하기 때문에 결과 절에 설명 된 데이터에 사용되는 래트 특별한 처리 절차가 필요 없다. 이것은 최소 2 주 동안 외과 임플란트의 매일 관찰 및 조작을 포함했다. 그러나, 래트 급격히 응력에 의해 영향을받을 수 프리 펄스 억제 분석 이전에 사용되는 다양한 기술에 의해 순응된다. 이러한 특수 습관화 기술들이 앞서 상세히 좋게되어있다. ^(43)이 절차 이외에, 그것은 쥐 단축 microinjectors가 뒤 사용되는 마이크로 인젝션 절차에 순응하는 것이 바람직하다반지 '가짜'주사. 이러한 허위 주사 동안, 마이크로 인젝터가 조직 손상을 제한하기 위하여 조직으로 돌출하지 않는 것이 중요하다. 즉, 마이크로 인젝터가 더 이상 14mm 이상 절곡되어서는 안된다. 따라서, 본 기술의 구현에 필요한 최적의 철저한 습관화는 제한으로 간주 될 수있다.

여러 행동 패러다임 동기를 측정하기 위해 존재하지만, 일반적으로는 비 진보적 피사체 보강제를 수득 발휘 기꺼이 노력을 정량화하는데 사용된다. 누진 비율 패러다임은 종종 최종 완료된 비율 레버 프레스의 최대 수로서 정의되는 브레이크 포인트로 알려진 측정 값을 만들어 낸다.. 즉, 최대 그 보강재를 생성 응답 ²¹ 프로그레시브 비가 크기 보강제 민감하다. 예를 들어, 높은 코카인 (또는 수 크로스) 투여 량은 더 높은 브레이크 코카인 및 하부 (또는 수 크로스) 복용 breakp 낮은 수율을 생산OINT. ^{(21, 22) 따라서,} 브레이크 포인트는 동기 부여 및 / 또는 보강 효과에 대한 일상적으로 사용하는 프록시입니다. ^21,23-26 중단 점의 의도는 동물이 응답하지 않을 때 결정하기 때문에, 진보적 인 비율 패러다임의 중요한 매개 변수입니다 세션 길이. 세션 길이가 유한 한 브레이크 포인트는 거짓 값에 캡을 넣을 수 있으며, 이는 비정상적자가 투여 또는 증가 포스트 보강 일시의 속도를 감소 사전 치료에 의해 악화 될 수있다. .이 혼란은 접근 방법의 수에 의해 극복 될 수있다. 예를 들어, 세션 동물은 평균 간 투여 간격의 일부 복수로 응답을 원천 징수 한 경우 종료 ^(44)이 방법의 더 일반적으로 적용 변형이 응답 한 번 세션을 종료하는 것입니다 주제에 걸쳐 일정하게 유지된다 일부 경험적으로 결정된 값으로 원천 징수하고. 우리는 단계 4.4.9.11에이 방법을 적용 할 수있는 방법을 제공하고 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Cannula 튜빙	Amazon 공급/ 소형 부품	HTXX-26T-60	26 G, 하이포튜브 S/S 316-TW 26GA
Obturator	아마존 공급/ 소형 부품	GWXX-0080-30-05	33 게이지, 와이어 S/S 316LVM 0.008 IN
마이크로인젝터 와이어	MicroGroup	33RW 304	33 게이지
Super Glue	Loctite	3924AC	액체, 비젤, 오토클레이브 가능
마이크로 인젝터 플라스틱 튜빙	Becton Dickson 427406		PE20
중량 지혈	세계 정밀 기기	501241-G
룰러	피셔	09-016	150 mm
# 7 집게	스톨	52100-77	Dumont, Dumostar
로터리 툴	Dremmel	285	2 단
절단 디스크	McMaster Carr	3602	15/16" x 0.025"
마이크로인젝션 펌프	하버드 장치	PhD 2000
1 ul 유리 주사기	Hamilton	7001KH	바늘 스타일: 25s/2.75"/3
면 팁 애플리케이터	Fisher	23-400-101
랩 와이프	Kimwipes	34133
운영 소프트웨어	Coulbourn	그래픽: State
Operant Chambers,	Coulborun	Habitest