진동 압 관류 장치에서 쥐 간을의 탈세 포화 절차

요약

당사의 독점 장치를 사용하여 간 채취, 삽관 및 관류를 위한 제시된 기술은 쥐 간에서 탈세포화 및 재세포화 실험을 개선하기 위한 정교한 관류 설정을 가능하게 합니다.

초록

실질 기관의 탈세포화와 재세포화는 체외에서 기능적 기관의 생성을 가능하게 할 수 있으며, 설치류 간 탈세포화를 위한 여러 프로토콜이 이미 발표되었습니다. 우리는 문맥 및/또는 간 동맥을 통해 선택적 관류를 가능하게 하는 독점적인 관류 장치를 구축하여 탈세포화 과정을 개선하는 것을 목표로 했습니다. 또한, 우리는 탈세포화의 균질성을 개선하기 위해 진동하는 주변 압력 조건에서 관류를 수행하려고 했습니다. 관류 탈세포화의 균질성은 현재까지 과소평가된 요인이었습니다. 탈세포화(decellularization) 과정에서 관류가 잘 되지 않는 기관 내 영역에는 여전히 세포가 포함되어 있을 수 있는 반면, 관류가 잘 되는 영역의 세포외 기질(ECM)은 이미 알칼리성 세제의 영향을 받았을 수 있습니다. 진동 압력 변화는 호흡 중에 발생하는 복강 내 압력 변화를 모방하여 간 내부의 미세 관류를 최적화할 수 있습니다. 여기에 제시된 연구에서 탈세포화된 쥐 간 매트릭스는 조직학적 염색, DNA 함량 분석 및 부식 주조를 통해 분석되었습니다. 간동맥을 통한 관류는 문맥 관류보다 더 균질한 결과를 보여주었습니다. 진동 압력 조건의 적용은 관류 탈세포화의 효과를 향상시켰습니다. 간 동맥을 통해 관류된 간과 진동하는 압력 조건에서 간이 가장 좋은 결과를 보였습니다. 당사의 독점 장치를 사용하여 간 채취, 캐뉼레이션 및 관류를 위해 제시된 기술은 쥐 간에서 탈세포화 및 재세포화 실험을 개선하기 위한 정교한 관류 설정을 가능하게 합니다.

서론

탈세 포화하고 recellularization 시험관에 ¹ 작용 성, 이식 가능한 장기의 생성을 가능하게 할 수있다. 제거 세포와 항원 물질에 의해 (예., DNA는 알파 - 갈 에피토프)에서 기관은 이하 비 - 면역 세포 외 기질 (ECM)을 얻을 수있다. 이 행렬은 기관의 입체 microanatomy을 보존하고 다른 ^가능성이 이종 기원의 세포 다시 채우기위한 이상적인 biomatrix로서 역할을 할 수있다. 따라서, 탈세 포화 된 쥐 간 매트릭스는 인간 간 세포 증식을 할 수있다. 이 인간화 마이크로 간 질환 (예., 선천성 대사 질환, 바이러스 성 질환 또는 악성 종양) 또는 전임상 제약 테스트 ^3에 대한 연구를위한 생체 모델이 될 수 있습니다.

쥐의 간 관류 탈세 포화에 대한 몇 가지 다른 프로토콜은 이미 ^4-13 발표되었다. 모든 프로토콜에서, decellular화는 유관 간문맥 통해 알칼리 이온 성 또는 비이 온성 세제의 관류에 의해 달성 하였다. 우리가 아는 한, 우리는 문맥 및 / 또는 쥐 간 동맥 ^(14)를 통해 선택적 관류에 의해 쥐의 간 탈세 포화를보고 첫 번째 그룹이었다. 간에서 서로 다른 혈관 시스템의 선택적 관류 활성화 셀룰러 다시 채우기에 중요한 역할을 할 수 있고, 또한, 더 나은 결과 탈세 포화를 가능하게하고있다.

여기에서 설명 된 연구에서, 간은 진동 압력 조건 하에서 관류있게 주문품 독점 관류 장치로 관류 하였다. 이러한 압력 조건은 간 생리적 호흡기 의존 관류 모방 : 시츄, 간은 호흡 운동시 간 혈류에 직접적인 영향을 다이어프램의 접합부 아래에 건다. 영감은 특히 최적화, 다이어프램의 저하 및 간 압박에 이르게간세포 정맥 유출 반면 만료 간 상승 및 포털 정맥 유입 ^15을 최적화하기 복강 내 압력의 저하로 연결.

우리의 목표는 진동 압력 조건은 복강 내 조건 생체를 모방하여 쥐의 간 관류 탈세 포화의 동질성에 영향이 있는지 여부를 알아보고자 하였다. 탈세 포화 과정의 균질성 관류 탈세 포화의 과소 평가 요소 일 수있다. 알려진 모든 에이전트는 ECM에 간 탈세 포화 원인 변경에 사용됩니다. 다른 영역이 이미 완전히 탈세 포화되는 반면 저조한 관류 영역의 세포는 ECM 내에 남아있다. 남아있는 세포를 용해, 관류 시간 또는 압력은 잘 관류 부위에 더 많은 변경을 일으키는 상승되어야한다. 따라서, 탈세 포화에 대한 세제는 기관 내에서 균일하게 분산되어야한다.

프로토콜

동물 실험 의학 (FEM, 샤리 테, 베를린, 독일)의 시설에 보관하고, 모든 실험 프로토콜을 검토하고, 국가 보건 및 지역 담당 사무소 (LAGeSo, 베를린, 독일의 승인을 하였다. 등록 번호 O 0365 / 11).

1. 간 수확

1. 수술 전 준비
   1. 고정을 위해 코르크 판을 사용합니다. 접시에 의료 드레이프를 넣어. 네 바늘을 사용하여, 수술 흡입 마취의 코르크 판에 흡입 마스크를 고정한다.
2. 포털 정맥 정맥의 사전 약속
   1. 세 방향 꼭지에 말초 정맥 카테터 (G 20)을 연결합니다. 정맥 카테터는 약의 길이, 비스듬히 절단한다. 1.5 cm.
   2. 드 에어 링거 용액으로 가득 10 ML의 주사기를 사용하여 시스템. 그것은 신중하게 해제 공기 가스 색전증 부정적인 관류 탈세 포화에 영향을 미칠 수 있기 때문에 매우 중요하다.
3. 사전 약속동맥 정맥의
   1. 나비 캐 뉼러를 사용하여 5 mm의 길이로 절단 바늘. 5mm 바늘과 superglue로 수정, 5cm 튜브 (외경 0.96 mm ID 0.58 mm)를 장착한다. 더 큰 튜브에와 superglue로 수정, 2cm 길이의 튜브 (외경 0.61 mm ID 0.28 mm)를 삽입합니다.
   2. 교대로이 공사를 통해 다른 튜브를 미끄러 superglue로 고정합니다. 드 에어 링거 용액으로 채워진 5 ML의 주사기와 동맥 정맥.
4. 마취와 진통
   1. 1.5 L / min의 유량으로 산소를 3.5 %의 이소 플루 란으로 마취 유도 챔버에서 래트 마취를 유도한다.
   2. 운전시 안전 진통을 보장하기 위해, 복강 metamizol (100 ㎎ / ㎏ 신체 질량)과 저용량 케타민 / 메데 토미 (kg의 신체 질량 당 10 밀리그램 / 0.1 mg)을 주입.
   3. 수술 마취 이후의 유지 보수를 위해 흡입 마스크를 통해 1 L / 분 산소 1.5 % 이소 플루 란를 제공합니다.
5. 수술 전 약정
   1. 전기 전단 기계와 자유주의로 복부를 면도. 소독 용 70 % 에탄올로 복부에 면도​​ 절개 사이트를 적셔.
   2. , 준비된 접시에 앙와위에서 동물을 배치 흡입 마스크에 머리를 삽입하고 의료 테이프와 핀 사지를 고정합니다. 거즈 압축과 초과 에탄올과 모피를 제거합니다.
6. 마취 평가
   1. 호흡을 보면서 마취 깊이를 평가합니다. 마취가 (40 ~ 60 호흡 / 분)만큼 깊은 것 같다 때, 진통 두 뒷다리의 발가락 사이의 피부를 꼬집어하는 수술 집게를 사용하여 발가락 핀치 반사를 트리거하기 위해 시도하여 충분한 지 여부를 확인합니다.
7. 복부 접근
   1. 방광 위 꼬리 복부 벽에 중간 절개를합니다. V 자형 방식으로 양측 늑골 아치에이 시점에서 잘라. 다이어프램으로 잘라 않도록주의하십시오. 가슴 위에 잘라 복부 벽을 당깁니다.
   , overholt 클램프와 칼 모양의 수정 두개쪽으로 당겨과 고무 밴드로 고정합니다. 장을 대피 젖은 면봉을 사용합니다. 젖은 거즈 붕대에 장을 감싸. 또한, 젖은 붕대 모든 복부 마진을 커버합니다.
8. 간 준비
   1. 낫 모양의 인대를 해부하다. 두개쪽으로 다이어프램의 돔 아래 중간과 왼쪽 간 로브를 개최 젖은 거즈 붕대를 사용합니다. hepatoduodenal 인대와 상부 대망 간 로브 노출됩니다.
   2. 로브가 이동 될 때까지 조심스럽게 상단 대망 로브에 부착 된 인대를 해부하는 두 microforceps 봄 가위를 사용합니다. 대신에 중간과 왼쪽 엽을 잡고, 거즈 압축에서 젖은 면봉을 사용하여 로브를 이동합니다.
   3. 위 대망 간 엽의 동원 후, 왼쪽으로 배를 이동합니다. 클램프와 위장을 수정하고 microforceps 및 스프링 가위로 작은 대망을 해부하다.
   4. 낮은 omenta를 동원L 간 엽이 이동하고 이후에 그 구멍에 다시 로브를 이동시킬 때까지. 십이지장을 유지하기 위해 박하우스 클램프를 사용합니다. 스트레칭과 hepatoduodenal 인대를 노출 왼쪽으로 십이지장을 이동합니다. 뻗어 hepatoduodenal 인대의 담관을 외접.
   5. 지방 및 췌장 조직에서 담관을 해부하다. 담관에게 담관 분기에서 1.5 cm를 잘라. 주위의 지방 조직에서 문맥을 해부. 십이지장 정맥을 노출.
   6. 실크 6-0로 두 번 십이지장 정맥을 결찰하고 2 합자 사이의 정맥을 나눕니다. 모든 동맥 라미가 공개 될 때까지 주변 조직에서 복강 트렁크 및 공통 간 동맥을 해부하다.
   7. 주변 조직으로부터 십이지장 동맥 해방. 서로 멀리 떨어져있는 관계로, 실크 6-0로 두 번 십이지장 동맥을 묶어. 2 합자 사이의 십이지장 동맥을 해부하다.
   8. 비장 동맥을 해방주변 조직으로부터. 서로 멀리 떨어져있는 관계로, 실크 6-0로 두 번 비장 동맥을 묶어. 2 합자 사이의 비장 동맥을 해부하다.
   9. 주변 조직으로부터 왼쪽 위 동맥 해방. 서로 멀리 떨어져있는 관계로, 실크 6-0로 두 번 왼쪽 위 동맥을 묶어. 2 합자 사이의 동맥을 해부하다.
   10. 오른쪽 신장과 오른쪽 측면 간 엽 사이의 열등한 대정맥 정맥을 외접. 복막 공간에서 정맥을 해부하다. 복강 트렁크에 따라 대동맥을 노출.
   11. 복막 지방 조직을 해부하다. 하대 정맥에 1 ml의 생리 식염수 1,000 IE의 헤파린을 주입한다. 캐 뉼러를 후퇴와 화장 솜에 절개를 닫습니다. 헤파린의 전신 효과를 1-2 분을 기다립니다.
   12. 집게로 대동맥을 외접. 대동맥을 해부하고 쥐에게서 피를 뽑다. 또한, 신장에서 원심 하대 정맥을 해부하다.
9. 포털 정맥로 (사용 섹션 1.2에서 제조 된 정맥)
   1. 말단 포털 정맥에 물고기 입 절개를합니다. 집게로 절개를 열고 포털 정맥을 cannulate. 간 탈색 될 때까지 20 ㎖ 링거 용액으로 간을 세척 및 합자 (실크 6-0)와 캐 뉼러를 해결.
10. 동맥 캐 뉼러 (사용 섹션 1.3에서 제조 된 정맥)
    1. 복강 트렁크 위의 대동맥을 해부하다. 복막 공간에서 대동맥 세그먼트를 해방. 대동맥 패치를 생성하기 위해 길이 방향으로 대동맥 세그먼트를 잘라. 정적 홀더에 자체 내장 캐뉼라를 삽입합니다.
    2. 캐 뉼러를 통해 대동맥 패치를 미끄러 2 집게를 사용합니다. 정맥을 통해 실크 6-0로 간 동맥을 결찰하고 지대치에 패치를 수정합니다.
11. 간 외식
    1. 다이어프램을 열고 원형 절개를 주변 구조에서 간을 해부하다.
12. 저장
    1. 스토사용할 때까지 350 ml의 링거 용액으로 가득 멸균 500ml의 탱크에 간 재.

2. 세제 솔루션

1. 10 % 트리톤 X-100 원액
   1. 900 ml의 아쿠아 DEST와 1,000 ml의 병을 채 웁니다. 100 ml의 트리톤 X-100 (99,9 %)를 추가합니다. 트리톤 X-100을 용해 교반기를 사용합니다. 아쿠아 DEST와 병을 채 웁니다. 1000 ml의 총 부피에 도달 할 때까지.
2. 1 % 트리톤 X-100
   1. 1000 ㎖의 병에 스톡 용액 100 ㎖ (10 %)를 첨가. 900 ml의 아쿠아 DEST를 추가합니다. 두 번 병을 흔들어. 멸균 필터를 통해 1 % 트리톤 X-100 용액 필터.
3. 10 % SDS 원액
   1. 900 ml의 아쿠아 DEST와 1,000 ml의 병을 채 웁니다. 과 66.99 g을 SDS (99.9 %, 밀도 0.67)를 추가합니다. SDS를 용해 교반기를 사용합니다. 아쿠아 DEST와 병을 채 웁니다. 1000 ml의 총 부피에 도달 할 때까지.
4. 1 % SDS
   1. 1000 ml의 봇에 스톡 용액 100 ㎖ (10 %)을 추가TLE. 900 ml의 아쿠아 DEST를 추가합니다. 두 번 병을 흔들어. 멸균 필터를 통해 1 % SDS 용액을 필터.

3. 탈세 포화

1. 관류 장치의 설정

그림 1 :. 진동 압력 조건에서 선택적 동맥과 네 쥐 간을 포털 정맥 관류에 대한 관류 장치의 제도 (. Struecker 등에서 수정 ¹⁴⁾

1. 삼방 콕 및 충전 레벨을 조절하고 500 mL의 0.9 % NaCl로 반응기를 채우기 위해 Heidelberger 확장 드레인에 링크.
   

그림 2. (4) 포털 정맥 액세스 통해 버블 트랩 (5) (2) 또는 동맥 AC 통해 선단 관류 셋업의 반응식 관류 챔버를 연결 (1,400cm ³⁾ (1)운 (3). 기포 트랩 (5)의 말단부에서 폐색 (4) 및 배출구 (6)를 구비한다. Heidelberger 확장 (7)에 버블 트랩 (5)를 연결합니다. 펌프 세그먼트 (8)에 Heidelberger 확장을 연결합니다. 또한, 다른 Heidelberger 확장 (9)에 펌프 세그먼트 (8)를 연결합니다. 세제 (10)의 병에 마지막 Heidelberger 확장 (9)를 삽입합니다. (관류 또는 다수의 경우에 압력 유통로) 관류 챔버에 마스크 (11)를 연결한다. 반응기 유체를 배출, 폐기물 용기 (12)에 대한 유출을 연결한다.

1. 펌프로 펌프 세그먼트를 삽입합니다. PBS로주기를 채우기 위해 펌프를 시작, 버블 트랩의 선단을 닫고 환기를 엽니 다. 거품의 바닥 안전하게 PBS (2-3 CM)으로 피복되는 경우, 벤트를 닫고 버블 트랩의 말단부를 연다.
2. 간 설치
   1. 관련 반응기 액세스 문맥 캐 뉼러의 삼방 콕 링크. C동맥 액세스 동맥 정맥 connect를. 공기가 시스템에 입력하지 않도록주의하십시오.
3. 진동 압력 조건의 적용
   1. 15 BPM의 주파수 및 26 밀리바 (분. 4 밀리바, 최대. 30 밀리바)의 진폭 호흡기를 사용합니다. 압력 분포 챔버로 호흡기를 연결하고 반응기 챔버를 연결합니다. 압력 응용 프로그램을 시작합니다.
4. 탈세 포화 프로토콜
   1. / 분 5 ㎖의 유속으로 관류 단계를 수행한다. 90 분 동안 1 % 트리톤 X-100 간 관류와 탈세 포화를 시작합니다. 관류 챔버 내부 상수 및 관류 된 간 상기 오일 레벨을 유지하기 위해 관류 장치의 유출을 통해 폐기 유출 물을 허용. 90 분 후, 1 % SDS에 세제를 변경합니다.
      
      

그림 3 : 모든 실험 그룹의 관류 프로토콜.

결과

균질성 따라서 다른 탈세 포화 프로토콜의 효과를 육안 관찰, 조직 학적 분석, 탈세 포화 간 매트릭스 내의 나머지 DNA 함량 분석에 의해 평가 하였다. 또한, 부식 주조 탈세 포화 후 간 손상의 microanatomy을 시각화 하였다.

Macroscopy

탈세 포화 동안, 간 세포는 콘텐츠의 제거를 나타내는, 루슨트된다. 문맥을 통해 관류 된 간을 탈세 포화 동안 및 (흰색 화살표) 후에 육안 가시 나머지 세포, 불균일 해명 (따라서 탈세 포화)를 보였다. 간동맥을 통해 관류 간은보다 균일 한 탈세 포화 코스와 눈에 보이는 남아있는 세포를 보였다. 간은 진동 압력 조건의 적용을 관류 한 경우, 나머지 세포는 무관 관류 경로 보이지 않았다.

그림 ...

토론

쥐의 간 수확 및 탈세 포화에 대한 발표 기술은 쉽게 재현 할 수 있지만, 고려해야 할 중요한 특정 단계가 있습니다 :

이 혈액 응고를 활성화하고 간 내 혈전 형성으로 이어질 수 있기 때문에 간 수확을 준비하는 동안, 그것은 심한 출혈을 방지하는 것이 중요하다. 우리의 의견으로, 그 문맥을 통해 관류 동안 간동맥을 통해 혈액의 유입을 방지하기 위해 포털 정맥 삽관 직전 복부 대동맥을 절개하는 것이 바람직하다. 간이 삽관 명확 관류되면, 혈전 형성이 더 이상 문제가 없다.

관류 원형으로 가스 기포의 유입 가스 색전증을 방지하기 위해 회피되어야하기 때문에 관류 장치 간 교통 수확 후 관류 장치 간 연결의 특히 중요한 공정이다. 또한, 삼방 밸브를 미리 기입하는 것이 유용하다 IPBS를 관류 시스템에 밸브를 연결하기 전에 직접 주사기 및 얇은 캐뉼라를 사용하여, 캐 뉼러 간 접속 s는.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
자체 제작 동맥 캐뉼라
Portex 비멸균 폴리에틸렌 튜빙	SIMS Portex	REF 800/110/100	0.28 mm ID 0.61 mm OD&
nbsp; Portex 비 멸균 폴리에틸렌 튜브	SIMS Portex	REF 800/110/200	0.58 mm ID 0.96 mm OD
Venodrop Safe butterfly catheter	Fresenius Kabi	3275851	21 G
포털 정맥 캐뉼라
주변 정맥 카테터	BD	393224	BD Venflon Pro 20G
3 방향 스톱콕	스미스 의료	888-101RE
면 스틱	Hecht-Assistent	4302
면 패드	Shaoxing Zhengde 외과 드레싱	13H118-03
거즈 붕대	후베이 Haige  의료 기기	14388
Ringer Solution	Fresenius Kabi	13 HKP022	1000 ml
10 ml 주사기	브라운	4606108V	10 ml/ 루어 솔로
5 ml 주사기	브라운	4606061V	5 ml /루어 솔로
봉합사 (실크 6/0)	Resorba	H1F	LOT 105001.81
의료용 드레이프	Shaoxing Zhengde 외과 드레싱	D0613011
surgical 악기
바늘 홀더	Geuder	17570
마이크로 집게	Inox-Electronic	91150-20
마이크로 가위	Martin	11-740-11
마이크로 집게	S& 티
클램프	Aesculap	BH111R
가위	F S T	14501-14
수술용 겸자	Aesculap	BD 557
탈세포화
호흡기	Resmed	14.24.11.0004	SmartAIR ST
관류 장치	Charite, 의료 공학 연구소	맞춤형 장치	탈세포화 장치
연동 펌프 ismatec reglo ICC	IDEX	ISM4408	4채널
하이델베르거 연장 75cm	Fresenius Kabi	2873	75 cm
MS/CA 펌프세그먼트	IDEX	IS 3510	MS/CA/클릭앤고/POM-C
CA 2-스토퍼 튜브	Pharmed	BPT NSF-51
버블 트랩		맞춤 제작 아이템
Luer Lock 호스 커넥터	Neolab	No. 02-1887
세제
SDS 펠릿	Carl Roth	CN30.4	2.5kg
트리톤 X-100	칼 로스	3051.1	10
PBS	Gibco	14190-094	DPBS
staining
Eosin 1%	Morphisto	10177
Mayer hematoxylin	AppliChem	A4840
gomori staining	Morphisto	11104
AlcainBlue-PAS staining	Morphisto	11388
Direct Red 80	시그마 알드리치	365548