방법 논문

준비 및 개인의 특성과 다중 약물은 물리적으로 고분자 미셀을 포획로드

DOI:

10.3791/53047

⸱

2015년 8월 28일

 ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Pacific University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Oregon State University

이 논문에서

요약

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이 프로토콜의 목표는 양친매성 블록 공중합체로 구성된 미셀 약물 전달 시스템에서 물리적으로 갇힌 수용성이 낮은 약물의 준비 및 특성화를 설명하는 것입니다.

초록

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polyethyleneglycol- 블록 -polylactic 아세트산 (PLA B- PEG-) 같은 양친 성 블록 공중 합체는 수성 환경에서 친수성, 소수성 쉘에 의해 둘러싸인 코어를 형성하는 자신의 임계 미셀 농도는 상기 미셀로 자기 조립할 수있다. 미셀의 코어는 도세탁셀 (DTX)과 에베로 리무스 (EVR)과 같은 소수성, 수난 용성 약물을로드하는데 이용 될 수있다. 미셀 구조 및 약물 로딩 기능의 체계적인 특성화 수행 할 수 시험관 및 생체 내 연구에서 이전에 중요하다. 본원에 기술 된 프로토콜의 목적은 표준화 미셀 제품을 달성하기 위해 필요한 특성을 제공하는 단계이다. DTX와 EVR 각각 미셀의 제조는 각각 1.86 및 1.85 ㎎ / ㎖에 DTX 및 EVR의 용해도를 증가 용매 캐스팅을 통해 달성 될 수있다 ㎖ / 1.9 및 9.6 μg의 극한의 용해도를 갖는다. 평가 미셀의 의약품 안정성48 시간 동안 실온에서 uated은 약물의 97 % 이상이 솔루션에 유지하고 있음을 나타냅니다. 미셀의 크기는 동적 광 산란을 사용하여 평가하고 이러한 미셀의 크기는 50 나노 미터 이하이고, 중합체의 분자량에 의존하고 있음을 나타내었다. 미셀에서 약물 방출은 48 시간에 걸쳐 37 O C에서의 pH 7.4에서 싱크 조건에서 투석을 사용하여 평가 하였다. 커브 피팅 결과는 약물 방출이 확산이 구동되고있는 것을 나타내는 1 차 공정에 의해 구동되는 것을 나타낸다.

서론

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친수성과 소수성 도메인으로 이루어지는 반복 구조로 양친 성 블록 공중 합체는 자발적으로 알려진 고분자 미셀 삼차원 고분자 조립체를 형성하기 위해 자기 조립있다. 이러한 구조는 친수성 ​​껍질로 둘러싸인 내부 소수성 코어를 가지고있다. 소수성 코어의 물리적 포획함으로써 소수성 상호 작용을 통해 또는 중합체 백본에 화학적 결합에 의해 하나의 소수성 약물을 포함하는 기능을 갖는다. (1) 많은 장점은 약물 전달을위한 미셀을 형성하기 위해 이러한 블록 공중 합체를 사용하기 위해 존재한다. 이들은 중합체의 난 용성 약물의 혼입, 혼입 약물 약동학을 개선하고 생체 적합성 및 / 또는 생분해 성을 포함하는 그들에게 종래의 가용 화제에 안전한 대체한다. (2) 고분자 미셀을 사용하는 또 다른 이점은 15을 사이에, 그 콜로이드 성 입자 크기 인 PA에 대한 그들에게 매력적 150 nm의 3,renteral 배달. 따라서, 지난 20 년 동안 고분자 미셀은 특히 암 치료에 대한 난 용성 약물 가능한 약물 전달 시스템으로서 등장했다. 3,4

마지막으로 폴리에틸렌 옥사이드를 함유하는 삼 블록 공중 합체 중에 현재 임상 시험을 진행 암 치료. 임상 시험에서 미셀의 4 개의 다섯 고분자 미셀 조성물은 PEG 계 블록 공중 합체가되어있다. 미셀의 크기는 20 nm 내지 85 nm의 변화. PEG 기재 중합체를 사용하는 장점은 생체 적합성이고, 제 2 블록도에 따라 생분해 될 수있다. polyethyleneglycol- 블록 -polylactic 산 (-PLA PEG- B) 고분자 미셀에 기초하여 최근 새로운 약물 전달 시스템은 다수의 항암제의 동시 전달을 위해 개발되어왔다. PEG-B-PLA 미셀은 생체 적합성과 생분해 성을 모두 있습니다. 로드 미셀로 도시 한이 다제ynergistic 시험 관내 및 생체 내에서 상이한 2,5,6 암 모델 저항의 억제 및 방지하기 위해 화학 요법에서 여러 약물을 이용하고 독성을 저하 현재 패러다임에 맞게. 따라서, 준비하고 암과 다른 질병 상태에서 사용하기 위해 이러한 미셀 약물 전달 시스템의 특성에 많은 관심이있다.

연구에서 우리는 미셀 조제와 명소 질환 상태에서 그 특징을 평가하기 전에 될 수있는 단계적인 프로세스를 이하에 설명했다. 이 연구의 목적으로 두 저조한 수용성 항암제는, 도세탁셀 (DTX)과 에베로 리무스 (EVR)가 선택되었다. DTX와 EVR 모두 각각 ㎖ / 1.9 및 9.6 μg의에서 극한 물 용해도와 난 용성 화합물이다. 다른 분자량을 가진 7,8- 두 PEG- ㄴ -PLA 중합체 제형 중합체위한 빌딩 블록으로서이 프로토콜에 사용 된 미셀,-PLA 1800 (3800 다) 및 PEG 4000 B - - -PLA 2200 (6200 다) (B)이 폴리머는 PEG 2000입니다. PEG-B의 -PLA 미셀 따라서 DTX와 EVR 개별적으로 조합에 대한 nanocarrier 같은 독특한 플랫폼을 제공 할 수 있습니다. 필요한 시약 / 재료 및 장비 준비와 이러한 미셀은 표 1에 나열된 특성을 필요로했다.

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프로토콜

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용매 주조 방법으로 개인 및 다중 약물로드 미셀 1. 준비

  1. 이중 약물 미셀 1 mg의 각 (DDM)에서 DTX 1 mg의 또는 EVR 1 mg의 또는 두 약물을 달다.
  2. PEG 2000 년의 15 밀리그램을 달아 - -PLA 1800 또는 PEG 4000 브렉퍼스트 - B -PLA 2200 개인 또는 DDM 중 하나를 위해.
  3. 약물 / 마약과 5 ml의 둥근 바닥 플라스크에 아세토 니트릴과 장소의 0.5 ml의에서 폴리머를 용해.
  4. 회전 증발기를 사용하여 감압하에 약물 (들) -polymer 아세토 니트릴 용액을 증발시켜 얇은 약물 분산 폴리머 필름을 형성한다. 100 RPM, 40 O C의 수조 온도 및 3 분 이상 100 밀리바에 이어 환원 5 분 동안 260 밀리바의 진공 압력을 회전 증발기를 설정한다.
  5. O 50 ℃에서 탈 이온수 0.5ml를 가진 약물 - 고분자 필름을 재수 부드럽게 미셀을 형성하기 위해 플라스크를 흔들어.
  6. 결과 필터0.2 ㎛의 나일론 필터를 통해 미셀 용액을 보내고하는 1.5 mL의 원심 분리 튜브에 어떠한 미용 약물 또는 오염물을 제거한다.

역상 고성능 액체 크로마토 그래피 (RP-HPLC)를 사용하여 평가 마이셀에서 약로드 및 안정성 2.

  1. 1 ml / 분의 유속으로 이동 아세토 니트릴 / 물 상 (38분의 62)를 함유하는 0.1 % 인산 1 % 메탄올로 등용 모드에서 40 ° C로 평형화 C8 컬럼으로 RP-HPLC 분석을 수행하고 10 μL의 주입량.
  2. 이전의 초기 약물 부하를 결정하기 위해 RP-HPLC로 분석을 이동상 100 : 갓 준비 미셀 (섹션 1) (1)를 희석. RP-HPLC로 다시 평가하고 24 시간 이상 미셀 약물 (들)의 안정성을 결정하기 위해 이동상 100 희석 샘플 : 스토어 희석 ​​개인 미셀 48 시간 동안 실온 (25 O를 C)에서 DDM과 신선한 1을 준비합니다.
  3. 각각 227, 279 nm에서 DTX와 EVR 피크를 모니터각각 1.7과 5.7 분의 체류 시간에. 세중에서 모든 측정을 수행합니다. 평균 ± SD 약물 로딩 중 현재 데이터.

동적 광산란에 의한 미셀 입자 크기 3. 평가 (DLS)

  1. 1.5 ㎎ / ㎖의 최종 중합체 농도를 수득 1:20의 비율로 탈 이온수 (제 1 항에서 설명)을 새로 제조 된 미셀을 희석.
  2. 산란을 결정하기 위해 173 ℃에서 HE-Ne 레이저 (633 ㎚)의 강도를 측정한다. 2 분 전 평형 다음 25 ℃에서 모든 측정을 수행합니다.
  3. 세중에서 모든 측정을 수행합니다. 분포의 분산 지수 (PDI)와 함께 ± 표준 편차 평균 Z 평균 크기와 같은 현재 데이터.

개인 미셀 DDM 4. 평가에서의 생체 외 약물 방출

  1. 3 ㎖ 투석 카세트에 부 (1) 부하의 미셀의 2.5 ml에 설명 된대로 개별 미셀과 DDM 준비7,000g / 몰의 분자량 컷 오프 (MWCO).
    주 :이 MWCO는 카세트 밖으로 자유롭게 확산시켜 싱크 조건을 보장하기 위해, 비 결합 된 중합체 분자와 함께 유리 약물 (들)를 활성화하기 위해 선택되었다.
  2. (주 200 mM의 솔루션을 희석하여 제조) 10 mM의 pH 7.4의 인산염 완충액 2.5 L에 카세트를 놓고 싱크 조건을 보장하기 위해 버퍼마다 3 시간을 변경합니다. 실험 기간에 걸쳐 37 ℃에서 O 버퍼의 온도를 유지한다.
  3. 에서 0, 0.5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24, 48 시간, 카세트의 용액을 150 μL를 철회하고 신선한 완충액 150 μL로 교체한다.
  4. 약물 농도를 결정하는 섹션 2 년에 설립으로 RP-HPLC를 사용하여 샘​​플을 분석 할 수 있습니다. stastitical 소프트웨어를 사용하여 하나의 위상 지수 협회 간단한 확산 모델에 기초한 약물은 분리 된 데이터를 곡선 - 적합.
  5. E의 약물 방출의 50 %에 도달하는데 필요한 시간을 계산 (t 1/2)피팅 곡선을 기준으로 개별 미셀 또는 DDM에 ACH 약물. 네개에서 모든 측정을 수행합니다.

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결과

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개인 DTX 또는 EVR 미셀과 미셀이 성공적으로 PEG 4000 하나에서 공식화 -PLA b를 PEG-에서 DTX와 EVR DDM - B -PLA 2200 또는 PEG 2000 - B -PLA 1800 (그림 1).

DTX, EVR하고, DDM은 PEG 4000 유사한 안정성을 보여 주었다 - 48 시간 이상 -PLA 1800 B (그림 2) - -PLA 2200 또는 PEG 2000 나. -PLA 2200 B와 PEG - 2000 - -PLA 1800 1.86 및 1.87 mg을은 B / ...

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토론

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약물 전달을 위한 고분자 미셀의 사용은 다양한 질병 상태에 대한 소수성 약물을 전달할 수 있는 다양성과 능력으로 인해 계속 확대되고 있습니다. 따라서 세포 배양 또는 동물에 사용하기 전에 이러한 제형을 준비하고 특성화하는 데 필요한 기술은 약물과 폴리머 간의 최상의 조합을 결정하는 중요한 첫 번째 단계입니다. PEG-b-PLA는 약물 전달 목적을 위한 우수한 양친매성 블록 공중합체입니다. 그러나 친수성 및 소수성 절편의 블록 길이는 약물 캡슐화 및 안정성에 중요한 역할을 하며 통합되도록 선택된 약물(들)에 따라 다릅니다. 따라서 다른 연구를 시작하기 전에 약물(들)과 중합체의 최상의 페어링을 식별하기 위해 다중 블록 공중합체를 사용한 초기 연구가 필요할 수 있습니다.

미셀 제조의 용매 주조 방법은 잘 문서화되어 있으며 재현 가능한 방법입니다. 회전식 증발기의 실제 조건은 수조 온도, 회전식 증발기의 시간, 회전 속도 및 진공 압력을 변경하여 혼합물에 맞게...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 AACP New Pharmacy Faculty Research Award Program, Medical Research Foundation of Oregon New Investigator Grant, Oregon State University-Startup fund 및 Pacific University, School of Pharmacy Start-up fund의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PEG2000-b-PLA1800Advanced Polymer Materials, Inc6-01- PLA / 2000PLA MW는 주문시 지정할 수 있습니다
PEG4000-b-PLA2200Advanced Polymer Materials, Inc6-01- PLA / 4000PLA MW는
DocetaxelLC LaboratoriesD-1000100 mg
EverolimusLC LaboratoriesE-4040100 mg
.아세토니트릴EMD/VWREM-AX0145-1HPLC 등급; 4 L
라운드 바텀 플라스크 Glassco/VWR89426-4965 ml
RV 10 제어 회전 증발기IKA Works8025001증발기
Shimadzhu HPLC with DAD detectorShimadzhuRP-HPLC
Slide-a-lyzer 투석 케이스 MWCO 7000Thermo Scientific, Inc663703 ml
인산염 완충액 pH 7.4, 200 mMVWR100190-870500 ml
Malvern NanoZSMalvern Instruments, 영국DLS
나일론 필터Acrodisc/VWR28143-24213 mm; 0.2&마이크로; M
인산, NF스펙트럼 화학/VWR700000-626100 ml
GraphPad Prismwww.graphpad.com분석 소프트웨어
Zorbax SB-C8 빠른 해상도 카트리지 애질런트 테크놀로지866953-9064.6 × 75mm, 3.5 μ 중
주문시 지정할 수 있습니다스

참고문헌

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