Colliculo-thalamocortical 마우스 뇌 조각의 변경, 3 차원 챔버 구성 요소의 인쇄 및 멀티 스케일 광학 이미징을 통합

Summary

여러 각도를 사용하여 마우스 강아지의 머리를 잘라, 우리는 주요 청각 중뇌와 전뇌 구조의 가장 사이의 연결을 캡처 이전에 설명 급성 뇌 조각을 개선.

Abstract

감각 정보를 처리하는 뇌의 능력은 오름차순과 내림차순 투영 세트에 의존합니다. 최근까지 이 두 가지 시스템과 이들이 어떻게 상호 작용하는지 연구할 수 있는 유일한 방법은 생체 내 제제를 사용하는 것이었습니다. 체성 감각계, 시각 및 청각 시스템에서 시상 피질 및 피질 시상 경로를 포함하는 급성 뇌 절편에 대한 주요 발전이 이루어졌습니다. 청각 시상피질 절편¹의 최근 수정에 대한 주요 개선을 통해 대부분의 주요 청각 중뇌 및 전뇌 구조, 즉 하구(IC), 내측 외상체(MGB), 시상 망상핵(TRN) 및 청각 피질(AC) 사이의 투영을 보다 안정적으로 캡처할 수 있습니다. 이러한 모든 연결의 일부를 유지하면 in vivo 제제로 답변할 수 있는 질문을 보완하는 자세한 질문에 답할 수 있습니다. 플라보단백질 자가형광 이미징을 사용하면 주어진 슬라이스의 연결성을 신속하게 평가하고 후속 실험을 안내할 수 있습니다. 이 슬라이스를 기록 및 이미징 기술과 함께 사용하면 정보가 피질로 올라갈 때 청각 전뇌의 각 지점에서 정보 처리가 어떻게 발생하는지, 그리고 하행 피질 조절의 영향을 더 잘 이해할 수 있습니다. 슬라이스 챔버 구성 요소를 구축하기 위한 3D 프린팅은 양면 관류와 슬라이스 내 네트워크에 대한 광범위한 액세스를 허용하고 이 준비를 최대한 활용하는 데 핵심적인 광범위한 연결을 유지합니다.

Introduction

감각 주연부와 열등한 둔덕 간의 정보의 실질적인 처리가 있지만 그것이 청각 피질에 도달하기 전에 청각 시스템에서, 상당한 추가 처리가있다. 우리는 처리가 수행하고 변환 뇌가 들어오는 감각 정보를 해석 할 수 있습니다 방법에 대한 때문에 작은 방법에 대해 거의 알고있다. 후각을 제외한 각각의 감각은 초기 신호가 피질 상승으로 감소 높은 충실도로 중계되는 신호에 주연 매우 유사한 조직을 갖는다. 피질은 더 들어오는 정보를 조절하는 하부 구조에 대한 전망을 보냅니다. 이 복잡한 시스템은 생체 내뿐만 아니라 시험관 제제의 수가 다양한 방식으로 연구되어왔다. 전, 모든 연결은 감각 입력을 제어하고 측정하면서, 연결의 집합을 조사하기 위해 연구를 가능하게 그대로주어진 영역에서 출력. 이 방법을, 강렬 복잡한 출력 상승을주고, 다른 감각 입력, 각성,주의를 포함하여 다른 입력의 큰 다양성없이 제어에 거의 없다. 시험관, 뇌 조각이 하나의 세트를 캡처 잘라왔다 연구자들은 자극과 구 심성 또는 뇌 영역의 다양한 평가를 할 수 있도록 예측, 또는 두 개의 연결된 뇌 영역의. 이들은 종종 시상에 입력 또는 시상과 대뇌 피질에 출력 하나가 ^2-5 보존 thalamocortical 또는 tectothalamic 중 하나 조각입니다. 이러한 제제는, 약물, 전기 및 optogenetic 조작 다양한 허용한다. 그러나 두 개의 뇌 영역으로, 이들은 주로 정보의 전송을 평가하고 시상 통과함에 따라 정보의 변화를 평가하는 기능이 부족하다. 또한 주목 변조 역할을 세망 시상 투영은 ^6-9 인 PR이 조각에 ESENT. 여기에서 우리는 어떻게 시상 게이트 및 필터 정보의 독특한 관점을 제공하기 위해 시상에 다양한 입력의 연구자를 제어 할 수 있습니다 이전 준비 ^1시에 개선을 보여줍니다. 우리 커플 단일 세포 수준에서 다양한 입력의 영향을 측정하기 위해 슬라이스 연결 및 대규모 활성화 분석 뉴런 집단 분석 시상 칼슘 이미징 및 단일 세포 기록을 평가하기위한 flavoprotein 자기 형광 영상이 신규 슬라이스 제제.

이러한 광범위한 연결을 유지하는 데 도움을주기 위해 우리는 또한 강화 된 관류에 대한 슬라이스를 상승시키는 대신에 뇌 조각과 다리를 유지하는 일반 슬라이스 앵커 (일명 "하프")의 수정을 개발했다. 하프는 슬라이스를 둘러싸고 하프 문자열에 대한 사용자 지정 부착 점 수 있도록 수정 된 말굽 모양으로 설계되어 있습니다. 세 개의 문자열은첨부 ⅰ) 하나 ⅱ) 하나가 AC의 꼬리 가장자리 IC의 꼬리 에지로부터 연장 ⅲ) 하나의 영역에 슬라이스의 내측 가장자리로부터 비스듬하게 연장되어, 슬라이스의 내측 가장자리를 따라 가로로 놓여 지도록 AC에 주동이 (도 1a 참조). 문자열 슬라이스 무결성을 유지할 수 있도록 슬라이스 압력 저하 량을 허용 하프 (시아 노 아크릴 레이트 접착제)을 붙이는 프레임에 작은 요철이 (도 1b 참조). 입체 인쇄를 사용하여, 우리는 조직의 상하 인공 뇌척수액 (ACSF)의 이상적인 흐름 수 있도록 우리 고유의 사양뿐만 아니라 다리에 사용자 정의 디자인 수금 할 수 있습니다. 이것은 또한 패치 클램프 전기 생리학의 조직에 침투하는 빛이 넓은 영역을 유지합니다.

Protocol

모든 절차는 일리노이 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 동물 실험 동물 관리의 인증에 대한 미국 협회의 승인을 동물 보호 시설에 수용되었다. 모든 시도가 사용 동물의 수를 최소화하고 연구의 모든 단계에서의 고통을 감소시키기 위해 만들어졌다.

및 공격 태도를 보여준 마우스에서 뇌의 제거 1. 준비

1. 관류 및 슬라이스 배양을 위해 준비합니다.
   1. 약 30 분 슬라이스 전에 녹음 또는 영상 이전 슬라이스의 배양을위한 높은 크로스 커팅 솔루션 및 저 칼슘 ACSF을 준비합니다.
   2. 모든 필요한 도구 (대형 무딘 끝 가위, 작은 봄 가위, 해부 포셉, 큰 가위 단두대, 홍채 가위, 보석상의 집게, 27G X 1/2 인치 바늘로 10 ML의 주사기, 1cm X 2cm 필터의 작은 조각을 배치합니다 종이 및 SL에 대한 깨진 팁 파스퇴르 피펫관류 및 슬라이싱 및 관류 트레이를 준비 얼음 전송).
   3. 32 ^O C의 물을 욕조와 솔루션을 절단 가득 배양 접시에 산소 ACSF와 실을 배양 설정합니다.
2. 공격 태도를 보여준 무대 절단 준비합니다.
   1. 약 1cm ³ 범프의 뇌에 대한 역전과 1.5 cm X 1.5 mm X 3mm로 사용할 3 % 한천의 작은 조각을 잘라하는 IC를 지탱하는 데 사용합니다.
   2. 시아 노 아크릴 레이트 접착제 스테이지뿐만 아니라 그들이 80 ^{O 각도를} 형성하도록 역전의 오른쪽에 범프 상 역전을 붙인다.
3. 뇌를 제거합니다.
   1. 깊이 P12-P20 케타민 100 ㎎ / ㎏과 xylaxine 3 ㎎ / ㎏ (또는 유사한 윤리위원회의 승인 절차)와 (이상적 p14-18) 마우스를 마취.
      참고 : 발가락 핀치에 응답의 부족을 통해 적절한 마취 수준을 확인합니다. 동물은 마취하에 간단히 바와 같이, 안연고는 불필요하다.
   2. 무딘 사용가위를 종료 목에 칼 모양의 과정에서 갈비뼈를 노출.
      1. 칼 모양의 과정을 찾아 약 1.5 cm의 수평 절단을합니다.
      2. 어깨에 이전 수평 절단의 끝에서 두 개의 수직 절단, 약 1.5 cm 각을 확인합니다.
   3. 다이아 프램 및 늑연골 접합을 극복하는 것은 마음을 노출.
   4. 작은 스프링 가위, 마음의면을 지느러미에 복부에서 우심방으로 잘라 작은, 2-5mm합니다.
   5. 1/2 인치 X 27G 바늘 10 ㎖ 주사기를 사용하여 좌심실을 주입하고 신속하게 높은 절삭 수크로오스 용액을 관류 동물.
   6. 피가 명확한 실행하면, 머리를 제거하는 큰 가위를 사용합니다.
      참고 : 우리는 체계적으로 관류의 유용성을 평가하지 않았습니다. 그러나, 우리의 경험에서,이 젊은 쥐 (rongeur)로 거의 100 % 성공을 함께 할 수 있고, 빨간색 (BL)을 제거하는 이점이 있는가형광 이미징 방해 할 수있는 짐 우드 세포.
   7. 두개골을 노출하는 중간 선을 피부를 잘라.
   8. 구부러진 홍채 가위를 사용하여 한 눈 사이의 절단, 조심스럽게 아래 뇌 손상되지 않도록 중간 선 봉합 돌보는 따라 전치부에서 잘라부터 눈 사이 두개골을 잘라.
      참고 : 두라는 일반적으로 두개골과 떨어져 온다. 필요한 경우, 신중하게 뇌를 제거하기 전에 경질을 제거합니다.
   9. 보석상의 집게 사용 놀리려는 두개골을 열고 조심스럽게 뇌를 제거하고 솔루션을 절단의 뇌를 놓습니다. 피질이 손상되지 않도록주의하십시오.

2. 공격 태도를 보여준 뇌를 준비

1. vibratome 무대에 장착 뇌를 준비합니다.
   1. 90 ^O에서 두 개의 라인으로 표시된 슬라이드 오른쪽 아래 왼쪽 상단에서 17 ^O에서 대각선을 사용하여, 두 선이 만나는 곳, 사용, 최대 뇌 등의 측면을 배치 교차면도날은, 평평한 표면을 생성 주동이의 끝 뇌의 2-4mm를 제거합니다.
   2. 새로 만든 평평한 표면에 뇌 꼬리 쪽을 놓고 수평 및 수직 라인과 뇌의 중간 선으로 뇌의 등쪽 표면을 맞 춥니 다.
   3. , 17 ^{O 라인으로} 면도날을 맞 춥니 다 (30) ^O 각도에서 면도칼을 기울이고 이중 대각선 컷 (관상에서 17 수평면에서 ^O와 60 ^O)의 오른쪽 피질의 약 3mm를 제거합니다.
2. vibratome 무대에서 뇌를 장착.
   1. 긴 치수는 중심선에 수직이되도록 여과지 뇌의 복부 측 1cm X 2cm의 작은 조각을 배치했다.
   2. 신중 백스톱 (및 범프의 좌측으로) 앞의 영역에 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 소량 적용.
   3. 뇌와 후뇌의 꼬리 부분이되도록 홍보 접착제에에 두 번 대각선으로 잘라 뇌 얼굴을 배치범프에 opped 및 뇌의 우측에 대해 역전된다.
   4. 섬세 전체면이 슬라이싱 챔버와 접촉하는 것을 보장하는, 뇌에 눌러.

3. Colliculo-thalamocortical 슬라이스를 구하기

1. 신속하게 vibratome에서 절단 단계 및 발생하는 솔루션을 절단으로 무대를 채운다.
2. 뇌의 상단 (복부 측면)과 날을 맞 춥니 다.
3. 뇌의 상부로부터 1.5 mm를 제거 300-500 μm의 조각을 제거하고, 제거 후에 깊이를 평가한다.
   참고 : IC, MGB 및 측면 geniculate 핵 (LGN)이 모두 볼 수 있습니다, 그리고 치아 이랑 (dentate gyrus)가 'C'모양이 600 μm의 슬라이스 한을 형성합니다. 도 3a를 참조하십시오.
4. 지주 (32 ^O를 C) 가열 된 챔버에 넣어 조각.

슬라이스 4. 영상

1. flavoprotein의자가 형광 이미징을위한 준비.
   <리> 표준 전기 생리 녹화 실에서 조각의 관류 ACSF을 준비, 95 %, _O2 / 5 % CO _2와 버블 ACSF.
   1. 자극 용 유리 전극을 당기십시오. 그 여러 가지 자극 전극 및 구성 (유리, 텅스텐, 탄소 섬유, 모노 폴라, 바이폴라) flavoprotein의자가 형광 이미징 모든 작업이 매우 잘 결합을합니다.
   2. 컴퓨터, 카메라, 미세 조작기, 광원, 자극 소프트웨어, 이미지 캡처 소프트웨어를 켭니다.
   3. 챔버에서 슬라이스를 상승 사용자 정의 다리 (보충 자료에서 사용할 수있는 디자인)를 배치, 산소 ACSF로 기록 챔버를 관류.
      참고 : 관류 속도가 설정 개인에 따라 달라질 수 있습니다 5-15 ml의 / 분 여기에 사용됩니다.
   4. 남북의 경로를 통해 하프 문자열을 배치하지 않도록주의하면서 조각을 통해 특별히 제작 된 하프를 배치하는 동안 다리를 들어 올려에서 슬라이스를 방지하기 위해 챔버 내의 액체 레벨을 낮추고, 챔버에서 슬라이스를 배치EST (그림 1A). 슬라이스 위와 아래 ACSF 흐름을 유지하기 위해 슬라이스 위의 약 1-2mm에 액체 수준을 높입니다.
      주 : 재배치가 필요한 경우, 파손 단부 파스퇴르 피펫을 사용하거나 ACSF 레벨이 상승하고는 조심스럽게 집게를 사용하도록 허용.
   5. (그림 1A 참조), ACSF 가득 유리 전극에 염화은 전극을 삽입 미세 조작기에 유리 전극을 삽입하고 아이솔레이터를 자극에 연결하고 조심스럽게 시상으로 이어지는 IC / 백질에 유리 전극을 배치합니다.
2. 자가 형광 이미지 획득을 Flavoprotein.
   1. (무한 보정 2X 매크로 목표를 사용하여 (NA 0.13)) 4 Hz에서 이미지와 105 초 동안 카메라를 전기적으로 자극하면서 (각 자극이 0.05 Hz에서 40 Hz에서 2 밀리 초 펄스 조직의 1 초를 다섯 번으로 구성) 조명하면서 수집 푸른 빛 470-490 nm에서 515 nm의 위의 캡처와 조직. 이미지가 어느 쪽인지 확인O 어두운,도 터져 참조 그림 3 참조 열을 떠났다.
      주 : 수집 시간, 컬렉션 주파수 및 자극 주파수는 실험과 같은 변형 될 수 부원료 포함 지정 프로그램에 적합하도록 변경 될 수있다.
   2. matlab에, 및 보충 자료에서 사용할 수있는 사용자 작성 프로그램을 사용하여 내보내기 이미지는 0.05 Hz에서 이미지의 스펙트럼 전력을 분석합니다. 결과 이미지는 연결 경로를 표시합니다.
      주 : 지정 프로그램은 화상을 생성하는 고속 푸리에 시계열의 화소 값의 변환을 이용한다.
3. 칼슘 이미징을위한 준비.
   1. ACSF는 약 32 ^O C.을 온도를 유지하도록 가열 패드 상부 및 슬라이스의 아래쪽, 및 장소 모두에 도달 할 수 있도록 3cm 배양 접시에 올려 배양 막을 이용한 작은 배양 챔버를 준비
   2. 95 % O 따뜻한 ACSF 천천히 거품 작은 배양 챔버를 입력_{5분의 2} %의 CO _2.
   3. 2 플루로 닉 F-127 산의 μL 및 DMSO 48 μL에 용해의 Fura - 오전 2시의 50 μg의 혼합.
   4. 제기 막 조심스럽게 마이크로 피펫을 사용하여 작은 배양 챔버에 넣어 슬라이스 염색 직접 MGB 상기 혼합물 (또는 관심의 다른 구조)를 추가합니다.
   5. 1 시간 - 이전 영상에 표백을 방지하고, 조각이 45 분 동안 배양 할 수 있도록 슬라이스를 커버.
   6. 를 초과하는 물질을 씻어 10 ~ 15 분 동안 가열 보유 챔버 조각을 제거합니다.
   7. 자극 준비와 이미지 colliculo-thalamocortical 슬라이스 4.1.6에 단계 4.1.1을 따르십시오.
4. 칼슘 화상 취득.
   1. 365 nm의 빛과 조직을 조명 510 nm의 위에 형광을 캡처하는 동안 전기 0.2 Hz에서 (각 자극 한 2 밀리 초 펄스로 구성)를 다섯 번 조직을 자극하면서 25 초 동안 (20X 물 침지 목표를 사용) 10 Hz에서 이미지를 수집합니다.
   2. MATLAB과 보충 자료에서 사용할 수있는 사용자 작성 프로그램을 사용하여 내보내기 이미지는 0.2 Hz에서 이미지의 스펙트럼 전력을 분석합니다. 결과 이미지는 활성 셀을 보여줍니다.

Results

P15 마우스에서 얻은 colliculo-thalamocortical 마우스 뇌 조각의 예는 그림 2에 나타나있다. 이상적인 슬라이스 IC가 자극 될 때 모든 활성화 된 네 개의 주요 중뇌와 전뇌 청각 구조 IC, MGB, TRN, 및 AC를 포함합니다 (도 2A). 푸리에 분석을 사용하여, 상기 스펙트럼 전력은 주기적으로 자극 주파수 ^(10)에 혼입 인 활성을 나타내는 접속 뇌 영역과, 전기 자극의 주파수에서 측정된다. 이 프로토콜은 특히 중뇌와 대뇌 피질 사이의 넥서스와 시상에서 정보의 상승 흐름을 연구 할 수 있습니다. 포함 된이 프로토콜 접속 colliculo-thalamocortical 슬라이스의 생산을 보조뿐만 아니라 3D 인쇄의 혼입과 하드웨어의 더욱 쉽게 사용자 정의 세트를 제공은 피질 시상 (도 2B에서 연결되지 슬라이스의 예이지만 ) 시상은 flavoprotein의자가 형광 이미징 (그...

Discussion

이 프로토콜은 청각 시스템¹의 정보 흐름을 연구하기 위해 p12-20 마우스에서 이전에 기술된 구상-시상 피질 뇌 절편에 대한 개선을 설명합니다. 이 방법은 단일 슬라이스에서 더 많은 뇌 영역 간의 연결을 유지함으로써 다른 유사한 뇌 슬라이스 준비에 비해 많은 이점이 있으며, 이는 연구자에게 전뇌의 청각 핵 간의 상호 작용과 상호 작용을 이해할 수 있는 새로운 도구를 제공합니다. 이 프로토콜에는 이전 작업¹과 비교하여 연결된 슬라이스의 수율을 증가시키는 몇 가지 주요 수정 사항이 있었습니다. 이러한 수정에는 20^o에 비해 수평면 17^o에서 약간 다른 절단 각도, 관상 평면에서 60^o 증가 및 IC 아래의 2 mm 1.5mm 더 작은 범프가 포함됩니다. 작지만 이러한 수정은 방법의 수율과 신뢰성을 크게 향상시키며, 연습을 통해 슬라이스는 80-100%의 시간 동안 얻어야 합니다. 구상-시상 피질 절편을 얻는 것과 함께 프로토콜은 추가...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
mM의 고 자당 절단 용액			: 206 자당, 10.0 MgCl2< / sub>, 11.0 포도당, 1.25 NaH 2 < / sub >PO 4< / sub>, 26 NaHCO3< / sub>, 0.5 CaCl2< / sub>, 2.5 KCl, pH 7.4
낮은 칼슘 aCSF			(mM): 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 포도당, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
aCSF			(mM): 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 포도당, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
Stimulus Isolator	World Precision Instruments	A360
DMSO	Life Technologies	D12345	lot: 1572C502
Fura-2AM	Life Technologies	F1201	Lot: 144912
Pluronic F-127	Life Technologies	P3000MP	Lot: 1499369
대형 배양 접시	Fisherbrand	08-757-13	100 x 15 mm 배양 접시
소형 배양 접시	Falcon	353001	35 x10 mm 배양 접시
제기 배양 멤브레인	밀리셀	PICMORG50	슬라이스의 양쪽에서 산소가 함유된 유체 관류를 유지하는 데 사용됩니다.
플라보단백질 이미징 형광 큐브	Olympus	UMNIB	470– 490nm 여기, 505nm 이색성, 515nm 방출 긴 패스.  우리는 거의 모든 녹색 형광 단백질 필터 큐브가 여기에서 작동한다는 것을 발견했습니다.
칼슘 이미징 형광 큐브	Omega Optical	BX-18	XF1005 365 nm exitation, XF2001 400 nm dichroic, XF3080 510 nm 방출
뇌			물 무게의 3%
Viper si Stereo Lithography Apparatus	3D Systems