동일한 공여자로부터 인간 간세포와 비실질 간 세포를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 다양한 간 세포 유형은 기능적 간 모델 및 조직 공학의 기초를 구축합니다. 이 새로운 방법은 높은 수율과 생존력으로 간 세포를 분리하는 것을 목표로 합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
실질 간세포 옆에, 간은 비 실질 세포 (NPC) 즉 쿠퍼 세포 (KC), 간 내피 세포 (LEC)와 간 성상 세포 (HSC)로 구성되어 있습니다. 차 인간 간세포 (PHH)의 두 차원 (2D) 문화는 여전히 약물 대사 및 간독성의 시험관 테스트를위한 "골드 표준"으로 간주됩니다. 그것은 PHH의 2 차원 단일 문화는 탈분화 및 기능의 상실을 앓고 것으로 잘 알려져있다. 최근이 간 NPC 간 (병리) 생리학의 중심 역할과 PHH 기능의 유지 보수를 재생 것으로 나타났다. 현재의 연구는 2 차원 단일 재배의 한계를 극복하기 위해 3D- 공동 배양 모델에 의해 생체 내 조직 구조의 복원에 초점을 맞추고있다. 이전에, 우리는 인간 간 세포를 분리하는 방법을 발간 실험 생물학 및 의학 1 세포 배양 물에서의 사용을위한 이들 세포의 적합성을 연구 하였다. 이 테의 폭 넓은 관심을 바탕으로이 문서의 목적을 chnique하는이 기술을 쉽게 재생 허용하는 비디오를 포함하는 간 세포 분리 방법에 대한 상세한 프로토콜을 제공하는 것이다.
인간 간세포는 두 단계 EGTA / 콜라게나 제 P 관류 기술에 의해 수술 개입 인간의 간 조직 샘플로부터 분리 하였다. PHH 50 x g에서 초기 원심 NPC로부터 분리 하였다. 밀도 구배 원심 분리 단계 사균의 제거를 위해 사용 하였다. 개인 간 세포 집단은 특정 세포 성 및 세포 선별 방법을 사용하여 농축 된 NPC 분획으로부터 분리 하였다. PHH 격리 옆에 우리는 더 재배 KC, LEC와 HSC를 분리 할 수 있었다.
함께, 제시된 프로토콜은 한 기증자의 조직 샘플에서 높은 품질과 수량에 PHH 및 NPC의 분리를 할 수 있습니다. 정제 간 세포 집단에 대한 접근은 인간의 리 같은 생체의 생성을 허용 할 수 있습니다버전 모델.
서론
인간의 간 조직은 매우 복잡하고 여러 개의 셀 엔티티 실질 세포 및 비 실질 세포 (NPC)로 구성된다. 실질 간 세포는 간세포와 담관을 포함한다. 간세포는 전체 간세포의 60 ~ 70 %를 차지하며 대사성 간 기능의 대부분을 차지하고, 예를 들면, 담즙산 및 인자 합성, 생물 전환 및 에너지 대사 2,3- 보완.
작은 NPC 분획 총 간세포 30-40 %로 구성한다. NPC는 서로 다른 세포 집단, 즉 쿠퍼 세포 (KC), 간 내피 세포 (LEC)와 간 성상 세포 (HSC)를 포함한다. 이 이종의 세포 분획 간의 생리적 과정에서 중요한 역할을한다. 또한, NPC는 예를 들어, 약물 - 유도 간 손상 (딜리)뿐만 아니라 만성 간 손상, 간경화 4 급성 간 손상을 중재에 참여한다.
최근, H잃어버린 간 세포는 간 질환에 점점 더 중요한 연구 및 약물 검사, 약물 개발 및 새로운 생화학 적 경로의 식별 개발되고있다. 시험관 테스트를 위해 PHH의 단일 재배는 여전히 "황금 표준"으로 간주됩니다 5. 현재 동형 간 모델의 주요 제한은 수일 내에 4 탈분화 및 간세포의 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
참고 : 모든 세포가 기본 또는 보조 간 종양 부분 간 절제술 후 남아 절제된 비 종 양성 인간의 간 조직에서 분리 하였다. Universitätsmedizin 베를린 - 환자의 동의는 샤리 테의 윤리적 지침에 따라 얻었다.
재료 및 솔루션 1. 준비
- 분리 과정 중에 박테리아 오염을 방지하기 위해 미리 모든 장비 및 재료 멸균.
- 갓 제조 소화 용액 제외 간 조직 샘플 간세포 비 실질 간세포의 단리 공정 및 표 1 및 2에 따른 차 인간 간세포의 배양 관류에 필요한 용액을 준비 사용 전에. 모든 솔루션은 4 ° C에 저장할 수 있습니다 준비 후 4 주 이내에 사용할 것을 권장합니다.
- 소독하다0.22 μm의 병 상단 필터를 사용하여 모든 솔루션을 제공합니다.
관류 장비 2. 준비
- 도 1a에 도시 된 바와 같이 간 조직 샘플의 관류 및 소화 장치를 설정한다.
- 관류 및 소화하는 동안 최적의 콜라게나 P 활동을 보장하기 위해 39 ° C의 물 목욕 온도를 조정합니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
준수의 특성과 맥의 사용과 결합 정리 절차로 밀도 기울기 원심 분리를 이용하여 실질이 아닌 실질 부분에 분리는 성공 PHH 및 NPC 분리로 연결됩니다. PHH 및 NPC는 높은 품질과 수량에 고립 될 수있다. (1) 간 관류 및 소화 용 장비의 대표 설정을 보여줍니다. 프로테아제 단백질 분해 활성을 감소시키는 대가로 콜라게나 제 P 활성 안정화 용액 II - 10 % FCS 관류를 함유하는 콜라게나 제 P로 하였다. NPC 분리에 필요한 결과 이상 소화 시대 PHH의 생존 능력에 부정적인 영향없이 적용 할 수있다.
그림 1.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
게시 된 프로토콜은 동시에 인간의 간 조직의 동일한 샘플에서 높은 품질과 순도, 순수 PHH 및 NPC, 즉 KC, HSC와 LEC를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 간세포 아이솔레이션 다루는 문헌의 대부분은 인간 조직 수행 그 세포 집단 18-20 및 분리 절차들 중 하나 (21) (당국이 외. 검토) 희소 커버. 인간의 간을 동물 조직 (예를 들면, 쥐의 간) 설립 방법의 적응력 동물과 인간의 세포 집단 사이의 셀 속성에서 몇 가지 차이점을 밝혔다. 다른 간세포 집단을 덮는 간 세포 분리 방법의 확립은 실질 비 실질 세포 분리를 조합하여 인해 최적의 결과를 위해 요구되는 소화 시간차에 중요한 단계 인 것으로 나타났다. 이 도전에 직면 우리는 다른 기술을 결합 간 세포 격리 프로토콜을 개발하고 적응우리 PHH 분리 프로토콜 10 SE.
용액 II를 함유하는 콜라게나 제 P로 10 %.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 경쟁하는 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
0315741 : 우리는 본 연구는 교육 및 연구 (BMBF) 프로젝트 가상 간의 독일 연방 교육부에 의해 지원되었다 그림 1의 생성에서의 지원 지아 리 리우에게 감사의 말씀을 전합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| General Equipment | |||
| PIPETBOY | Eppendorf | ||
| 피펫 | Eppendorf | ||
| 현미경 | Carl Zeiss | ||
| 현미경 | Olympus | ||
| CO2-incubator | 바인더 | ||
| Lamin Air | Heraeus | ||
| 원심분리기 Varifuge 3.0R | Heraeus | ||
| 소변 비커 | Sarstedt | 2041101 | |
| 퍼퓨저 주사기 50ml | B.Braun | 12F0482022 | |
| 병 상단 필터 | Nalgene | 1058787 | |
| Falcon 50ml 폴리프로필렌 원추형 튜브 | BD Biosciences | 352070 | |
| Falcon 15 ml 폴리 프로필렌 원뿔 튜브 | BD Biosciences | 352096 | |
| 조직 배양 플레이트 | BD Biosciences | 533047 | 24 웰 |
| 혈청 학적 피펫 | BD Biosciences | 357525, 357551, 357543 | 25 ml, 10 ml, 5 ml |
| 피펫 팁 | SARSTEDT | 0220 / 2278014, 0005 / 2242011, 0817 / 2222011 | 100 µ l, 200 &마이크로; l, 1,000 &마이크로; l |
| Name | Company | >카탈로그 번호 | Comments< |
| strong>Isolation Equipment | |||
| water bath | Lauda | ||
| 연동 펌프 | Carl Roth | ||
| 순환 온도 조절기 | Lauda | ||
| pH 측정기 | Schott | ||
| 미세 저울 | Sartorius | ||
| 스탠드 | |||
| Bü chner 깔때기 | Haldenwanger | ||
| 브 팁 | |||
| 플라스틱 깔때기 | |||
| 실리콘 튜브 | |||
| 유리 접시 | |||
| 집게 | |||
| 메스 | 깃털 | 12068760 | |
| Neubauer 계산 챔버 | 시신경 노동 | ||
| 세포 리프터 | Costar | ||
| 외과 드레이프 | Charité 대학교ä tsmedizin 베를린 | A2013027 | |
| 압축 | Fuhrmann | 40013331 | |
| 멸균 수술 장갑 | Gammex PF | 1203441104 | |
| 조직 접착제 | B. Braun | 1050052 | |
| 유리병 | VWR | ||
| 콜라겐 분해 효소 P | Roche | 13349524 | |
| Percoll 분리 솔루션 | Biochrom | L6145 | 밀도 1.124 g / ml |
| 행크 ' s BSS | PAA | H00911-3938 | |
| 둘베코 s PBS | PAA | H15 - 002 | without Mg/Ca |
| Ampuwa | Plastipur | 13CKP151 | |
| 알부민 | 시그마-알드리치 | A7906 | |
| NaCl | 머크 | 1,064,041,000 | |
| KCl | 머크 | 49,361,000 | |
| 헤페스 복어 | Roth | 133196836 | |
| EDTA | Sigma | E-5134 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Media Equipment | |||
| DMEM | PAA | E15-005 | 저포도당(1g/L)(L-글루타민 제외) |
| HEPES 완충 용액 1 M | GIBCO | 1135546 | |
| L-글루타민 | GIBCO | 25030-024 | 200mM |
| MEM NEAA | GIBCO | 11140-035 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | GIBCO | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15 - 039 | L-글루타민 |
| 피루브산 나트륨 | 없음 GIBCO | 1137663 | 100mM |
| 트리판 블루 솔루션 | : 시그마 - 알드리치 | T8154 | 0.4 % |
| 윌리엄 ' s E | GIBCO | 32551-020 | |
| with GlutaMAX™ | |||
| EGTA | 시그마-알드리치 | 03780-50G | |
| 포테코르틴 | 머크 | 49367 | 8 mg/2 ml |
| 인간-인슐린 | 릴리 | HI0210 | 100 IE/ml |
| N-아세틸 시스테인 | 시그마-알드리치 | A9165-5G | |
| 태아 송아지 혈청(FCS) | PAA | A15-101 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| >면역염색용 장비 | |||
| CD 68 | R& D Systems, 미국 | 단클론 | |
| CK 19 | 산타 크루즈 | D2309 | 다클론 |
| CK18 | 산타 크루즈 | K2105 | 단클론 |
| Vimentin | 산타 크루즈 | 단클론 | |
| GFAP | 시그마 알드리치 | 단클론 | |
| 트리톤 X-100 | 시그마 알드리치 | 23.472-9 | |
| 염소 안티 마우스 IgG1-PE | 산타 크루즈 | C0712 | |
| 염소 안티 토끼 IgG-FITC | 산타 크루즈 | L0412 | |
| 메탄올 | J.T.Baker | 1104509006 | |
| 포름 알데히드 4 % | Herbeta Arzneimittel | 200-001-8 | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | 시그마 Aldrich | A7906-100G |
참고문헌
- Pfeiffer, E., et al. Isolation, characterization, and cultivation of human hepatocytes and non-parenchymal liver cells. Exp Biol Med. , Maywood. (2014).
- Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev Cell. 18 (....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
