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방법 논문

소장에 의해 지질 전송을 연구하기 위해 카코 2 셀을 사용하여

19.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53086

⸱

2015년 8월 20일

 , 
1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, California Northstate University, 2Department of Biomedical Sciences, James H. Quillen College of Medicine, East Tennessee State University

이 논문에서

요약

Caco-2 세포는 지질 및 지용성 약물/비타민의 장세포세포 수송을 연구하기 위한 시험관 내 모델로 사용할 수 있습니다. 투과성 멤브레인 시스템은 정점과 기저측 구획을 분리하는 반면, 렌티바이러스 발현 시스템은 효과적인 유전자 과발현 방법을 제공합니다. 지단백질의 분리는 TEM에 의해 확인됩니다.

초록

식이 지방 흡수에 대한 연구는 일반적으로 림프 캐뉼라를 장착한 동물 모델을 사용하여 수행됩니다. 이 동물 모델은 식이 지방 흡수의 생체 내 모델로 널리 받아들여지고 있지만, 관련된 수술 기술은 까다롭고 비용이 많이 듭니다. 동물 모델의 유전자 조작은 또한 비용과 시간이 많이 듭니다. 대안적인 체외 모델은 틀림없이 더 저렴하고 시간을 절약하며 덜 까다롭습니다. 중요한 것은 시험관 내 모델을 통해 조사자가 장세포를 격리된 시스템으로 검사할 수 있어 전체 유기체 모델에 내재된 복잡성을 줄일 수 있다는 것입니다. 이 논문은 인간 대장암 세포(Caco-2)가 지질, 지용성 약물 및 비타민의 장세포세포 수송을 연구하기 위한 체외 모델 역할을 할 수 있는 방법을 설명합니다. Caco-2 세포의 적절한 유지 관리와 지질 혼합물의 준비를 설명합니다. 또한 투과성 멤브레인 시스템을 사용하는 유용한 옵션에 대해 설명합니다. 분화된 Caco-2 세포는 편광되어 있기 때문에 투과성 멤브레인 시스템을 사용하는 주요 이점은 기저측 구획에서 정점을 분리한다는 것입니다. 결과적으로, 지질 혼합물은 정점 구획에 첨가될 수 있고 지단백질은 기저측 구획에서 수집될 수 있습니다. 또한, Caco-2 세포에서 유전자 발현을 상향 조절하는 렌티바이러스 발현 시스템의 효과에 대해 논의합니다. 마지막으로, 본 논문에서는 투과전자현미경(TEM)을 통해 장 지단백질의 성공적인 분리를 확인하는 방법에 대해 설명합니다.

서론

4 -식이 지방과 지용성 약물과 비타민의 장내 흡수 연구는 림프 누공 모델 1을 사용하여 생체 내에서 수행 할 수있다. 그러나 관련된 수술 기법은 도전뿐만 아니라 비용이 많이 드는되지 않습니다. 생체 이용 될 수 분변 분석에 기반 방식이지만, 이들은 위장관 2,5- 의해 흡수 퍼센트를 결정 주로 사용된다. 이 문서에 설명 된 체외 모델은 비용 효과적이며, 관련 기술은 틀림없이 덜 도전이다. 유전자 변형 연구는 시간이 많이 걸리는 사람들이 체외 모델을 사용하여 수행 할 때 더 경제적이고 저렴합니다.

장 세포에 의해 흡수되는 지용성 물질 지단백질 -6,7-로 포장되어 있기 때문에, 리포 단백질을 생산하기 위해이 시험 관내 모델의 효과는 매우 중요하다. 두 가지 주요 intestinaL 지단백질은 카일로 마이크론과 매우 저밀도 지단백질 (VLDL)입니다. 지질은 위장 루멘에 풍부하게 존재하는 경우 직경이 80 nm 이상과 지질 단백질로 정의 카일로 마이크론은, 소장에 의해 엄격하게 생산된다. 그들이 가장 큰 지단백질이기 때문에, 카일로 마이크론은 생각할 가장 효율적인 지질 수송이다. 킬로 미크론 (8)을 제조 할 수있는 이러한 시험 관내 모델은,식이 지방 흡수에 의한 소화관 지용성 비타민의 흡수 및 지용성 약물 경구 생체 이용률을 연구하는데 사용될 수있다. 지단백질 분획에 지용성 분자, 비타민, 또는 약물의 존재는 소장 흡수하여 자신의 지표이다. 전술 한 바와 같이,이 모델은 경구 지용성 약물 생체 이용율 (6)을 향상 시키는데 사용될 수있다.

이 논문은 카코 2 세포 투과 막 또는 일반 조직 배양 접시, 어떻게 지질 마일에서 유지되어야한다 방법을 설명합니다지질 단백질 생산을 자극 xture는 렌티 바이러스 발현 시스템이 효율적인 과발현을 달성하기 위해 이용 될 수있는 방법을 준비해야하며, 절연 지단백질은 어떻게 분석되어야한다.

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프로토콜

카코 2 셀 1. 유지 보수

  1. 일반 조직 배양 접시를 사용하여
    1. (FBS를 37 ℃의 수조에서 바이알을 배치하여 냉동 바이알로부터의 카코 -2 세포를 해동하고, 즉시 예열 된 성장 배지 (15 % 소 태아 혈청 10 ㎖를 함유 10cm 조직 배양 접시에 추가 ) 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM))에서.
      1. 카코 -2 세포 50~70% 합류점에 도달 한 경우, 이들을 1 분할 : 그들은 분리 될 때까지 37 ℃에서 0.05 % 트립신 / 0.53 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 3 ㎖와 함께 세포를 배양하여 6 (15 분) . 세포 응집을 방지 부드러운 피펫 팅하여 세포를 여러 번 혼합합니다. 예열 성장 배지 10 ㎖를 함유 10cm 조직 배양 접시에 세포를 트립신 0.5ml를 추가.
    2. 부드럽게 좌우 방향으로 이어 전후 방향으로 요리를 여러 번 흔들어. 요리를 소용돌이 피으로는 불평등 한 세포 분산 될 수 있습니다.
    3. 5 % CO 2와 함께 제공되는 37 ° C의 배양기에서 평평한 표면에 요리를 놓습니다. 경사면은 불평등 세포 분산 될 수 있습니다.
    4. 배양을 시작한 후 성장 미디어에게 일을 변경합니다.
    5. 세포를 모니터링하고 그들이 합류에 도달 하루를 기록한다. 셀들이 분할 일로부터 합류에 도달하는 것은 약 1 주일 정도 걸릴 것이다.
    6. 세포가 합류에 도달하기 전에 일주일에 두 번 성장 미디어를 변경합니다. 세포가 합류에 도달하면, 매일 성장 미디어를 변경합니다. 세포가 7 일 후 합류 한 후 매일 성장 미디어를 변경합니다.
      주 :이 13 일 후 합류 (그림 1) 때 세포 실험에 대한 준비가되어 있습니다. 세포는 결국 지질 단백질 생산에 덜 효과적이 될 것이기 때문에, 8 포스트 합류 13-17 - 일 사이에 세포를 사용합니다. 실험을 수행하는 방법에 대한 3 단계로 이동합니다.
  2. 투과 막 시스템을 사용하여
    1. 단계 1.1.1.1에 기재된 투과성 막 인서트 카코 -2 세포를 시드. 위. 자신의 휴대 성장 (회복 기간) 일반적으로 느린 때문에 냉동 유리 병에서 세포를 사용하지 마십시오. 간단히, 미리 예열 성장 배지 10 ㎖를 포함하는 혀끝 챔버 (상단 구획)에 트립신 세포의 0.5 ml를 추가합니다. 또한, 기저 챔버 (낮은 구획)에 미리 예열 성장 배지 10 ㎖를 추가합니다.
      참고 : 가장 좋은 방법은, 기저 챔버 먼저 다음 혀끝 챔버로 성장 매체를 추가 할 수 있습니다. 이전 용지를 제거 할 때, 혀끝의 미디어하기 전에 기저 용지를 제거합니다. 이 막 파열 될 수 있으므로 폴리 카보네이트 막 파고하지 마십시오.
    2. 인하여 폴리 카보네이트 막을 통해 열악한 셀 가시성 유사한 밀도 정규 조직 배양 접시에 카코 -2 세포를 시드 및 셀 합류 판단이 접시를 사용한다.
    3. 의에 따라TEPS 1.1.2-1.1.6 위.

2. 유전자 과발현

  1. 일반 형질 전환 방법을 사용하여
    1. 상술 1.1.1.1.-1.1.4에 기술 된 바와 같이 조직 배양 접시에 카코 -2 세포를 시드.
      주 : 세포가 40-50 %의 컨 플루 언트 될 때, 형질 감염이 될 준비가된다.
    2. microcentrifuge 관에서 감소 된 혈청 미디어의 472 μL에 형질 전환 시약의 67 μl를 추가합니다. 튜브 벽 희석 형질 전환 시약의 접촉을 피하십시오.
    3. pLL3.7 23 μg의이 형질 전환 시약 / 감소 혈청 미디어 혼합물에 녹색 형광 단백질 (eGFP는) 9 향상된 추가합니다.
    4. RT에서 20 분 동안 혼합물을 인큐베이션.
    5. DMEM에 10 % FBS 8 mL로 카코 2 세포의 성장 매체를 교체합니다.
    6. 드롭 현명한 접시에 DNA / 형질 전환 시약 / 감소 혈청 미디어 혼합물을 추가합니다.
    7. 조심스럽게 앞으로 바에서 요리를 여러 번 흔들어좌우 방향으로 이어 ckward 방향.
    8. 37 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다.
    9. 배양을 시작한 후 성장 배지 10 ml의 하루 접시에 미디어를 교체합니다.
    10. 유전자 발현을 모니터링합니다.
      1. 4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI) 얼룩없이 유전자 발현을 모니터한다. 형광 현미경을 사용하여, 녹색 세포의 비율을 결정한다. 비율은 형질 전환 효율을 나타낸다.
      2. DAPI 염색과 유전자 발현을 모니터링합니다.
        1. 인산염 완충 식염수 (PBS)로 3 회 세포를 씻으십시오.
        2. PBS (RT에서 10 분 동안 배양)에서 4 % 포름 알데히드를 10 ㎖를 첨가하여 세포를 고정.
        3. PBS로 3 회 세포를 씻으십시오.
        4. DAPI (500), 1 % BSA, 0.01 %의 디기 토닌 : 1을 함유하는 PBS의 8 mL를 실온에서 15 분 동안 어둠 속에서 세포를 배양한다.
        5. PBS로 3 회 세포를 씻으십시오.
        6. 유형광 현미경을 노래 블루 (그림 2 상단 패널) 된 것을 녹색 / 청색 상대적 세포의 수를 결정한다. 계산 된 비율은 형질 감염 효율을 나타낸다.
  2. 렌티 바이러스 과발현 시스템 (10)을 사용하여
    1. 15cm 조직 배양 접시에 씨앗 인간 배아 신장 (HEK) 293T 세포 (DMEM에 10 % FBS 성장 매체로).
      주 : 세포가 60-70 %의 컨 플루 언트 될 때, 형질 감염이 될 준비가된다.
    2. microcentrifuge 관 (11)에 감소 된 혈청 매체의 1,133 μL에 형질 전환 시약 162 μl를 추가합니다. 튜브 벽 희석 형질 전환 시약의 접촉을 피하십시오.
    3. 추가 24 pLL3.7 eGFP는 (또는 다른 구조물)의 μg의 15.6 레브 반응 요소 μg의 (RRE) REV 6.0 μg의 한 형질 감염 시약 / R로 포성 구내염 바이러스 당 단백질 8.4 μg의 (VSVG)educed 혈청 미디어 혼합물.
    4. RT에서 20 분 동안 혼합물을 인큐베이션.
    5. DMEM에 10 % FBS 16 mL로 성장 매체를 교체합니다.
    6. 드롭 현명한 접시에 DNA / 형질 전환 시약 / 감소 혈청 미디어 혼합물을 추가합니다.
    7. 부드럽게 좌우 방향으로 이어 전후 방향으로 요리를 여러 번 흔들어. 이 시점에서 분리 HEK293T 세포의 일부를 참조하는 정상이다.
    8. 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
    9. 배양 24 시간 후, 성장 배지 25 mL를 접시에 미디어를 교체합니다.
    10. 다음 날, 렌티 바이러스 (제 컬렉션) 함유 증식 배지를 수집한다.
    11. 단계를 반복 2.2.10 더 렌티 바이러스 (두 번째 컬렉션)를 수집합니다.
    12. (5 분 동안 2,500 XG) 제 1 및 제 2 집합을 수영장, 원심 분리에 의해 세포 파편을 제거한다.
    13. 일회용 병 톱 필터 (0.45 μm의 기공)과 컬렉션을 필터링하고,RT (JA-20 로터)에서 2 시간 동안 31,400 XG에서 컬렉션을 원심 분리하여 바이러스를 농축시킨다. 펠렛이있는 원심 분리 튜브의 하단을 표시한다. 상등액을 경사 분리하고, 약 15 분 동안 RT에서 반전 튜브를 떠난다.
    14. 1X PBS 100 ㎕와 바이러스 - 함유 펠렛을 재현 탁. 거품을 피하십시오.
    15. -80 ° C에서 집중 바이러스를 저장합니다. 동결 - 해동 사이클을 피하십시오.
    16. 적정에 의해 카코 2 세포를 형질 도입에 필요한 바이러스의 최적의 양을 결정합니다. 비용을 절약하기 위해, 24 웰 플레이트 (물론 성장 미디어 / 0.3 ml)을 대신 적정 10cm 조직 배양 접시를 사용합니다.
      1. 농축 된 바이러스의 양을 증가시키는 추가의 (0, 1, 2, 5, 10, 25, 50 μL / 웰) 40~70% 합류 카코 -2 세포에 폴리 브렌 (최종 농도 = 5 μg의 / ㎖)으로 보충. 1.1.2에 설명 된 바와 같이 부드럽게 24- 웰 플레이트를 흔들어.
      2. 자신의 유전자 발현 모니터 (단계 2.1.10를.) (그림 2 바닥4 패널).
    17. 형질 전환 유전자의 발현은 일반적으로 유지되어 있기 때문에, 미래의 실험 형질 세포를 유지하고 지속적으로 유전자 발현을 모니터한다 (단계를 2.1.10.).

3. 지단백질 분비를 자극

  1. 일반 조직 배양 접시를 사용하여
    1. 올레산 50 ㎎, 레시틴 40 mg의 나트륨 타우로 콜산 48 mg을 혼합하여 100X 지질 혼합물을 제조한다. (8 요리에 대한 충분한) PBS로 900 μL에 볼륨을 가져와. 적극적으로 지질 혼합물을 소용돌이.
    2. 성장 미디어의 89.1 ml의에 100X 지질 혼합물의 900 μl를 추가합니다. 혼합 및 지질 함유 미디어를 필터링 할 수 있습니다. 올레산, 레시틴, 및 나트륨 타우로 콜산의 최종 농도 (1X)는 2.0mm의 1.36 mm의 각각 1.0 mm의이다.
    3. 세포에 지질 함유 미디어의 10 ML을 추가합니다.
    4. (37)에서 4 시간 동안 지질 함유 매체를 사용하여 세포를 품어C 배양기를 °.
    5. PBS로 3 회 세포를 씻으십시오.
    6. 지질 단백질의 분비를 수집 세포 성장 배지 10 ㎖를 추가한다.
    7. 37 ° C 배양기에서 2 시간 동안 품어.
    8. 지질 단백질 함유 미디어를 수집합니다.
  2. 투과 막 시스템을 사용하여
    1. 단계에 따라 3.1.1-3.1.2 지질 혼합물을 제조.
    2. 혀끝 챔버 지질 함유 미디어 10 ㎖ 및 기저 챔버로 성장 매체의 10 ML을 추가합니다.
    3. 37 ° C 배양기에서 4 시간 동안 품어. 기저 챔버에서 지질 단백질 함유 미디어를 수집합니다.

4. 지단백 분리 (그림 3)

  1. 원심 분리 (5 분 2,000 XG)에 의해 지질 단백질 함유 매체에서 세포 파편을 제거합니다.
  2. 50 ㎖ 튜브에 미디어를 가만히 따르다.
  3. 미디어에 염화나트륨 5.95 g을 넣고.
  4. SA의 경우mple이 TEM에 의해 분석되며, 지단백질의 무결성을 유지하기 위해 1, 프로테아제 억제제 칵테일 정제를 추가한다.
  5. 물 23 ㎖의에 볼륨 (1.2 ㎍ / ㎖의 NaCl 농도 솔루션)를 준비한다.
  6. 완전히 용질을 녹여.
  7. 폴리 카보네이트 초 원심 분리기 튜브에 모든 용액을 경사 분리한다.
  8. 부드럽게 0.5 ml의 물 (1.0 ㎍ / ㎖ 농도)와 1.2 ㎍ / ㎖ 밀도 솔루션을 오버레이.
  9. 부피 중량이 아닌 튜브를 균형.
  10. 조심스럽게 T865 회 전자에 튜브를로드합니다.
  11. 4 ℃에서 24 시간 동안 429,460 XG에서 초 원심 분리기에서 샘플을 스핀.
  12. 즉시 부드러운 피펫으로 최고 0.5 ml의 솔루션을 격리 할 것. 가능한 한 여전히 튜브를 유지합니다.

5. TEM 분석

  1. (W / V) 및 6.0의 pH를 조절 2 % 포스 포 텅스텐 산을 5 ml를 준비한다.
  2. (0.2 ㎛의 공극 크기) 주사기 필터와 2 % 인 텅스텐 산 필터.
  3. 멸균 접시에 지질 단백질 샘플의 20 μl를 삭제합니다.
  4. 다음 같은 접시에 샘플로 필터링 2 % 인 텅스텐 산의 20 μl를 삭제합니다.
  5. 조심스럽게 무딘면이 샘플에 휴식과 EM 그리드를 놓습니다.
  6. 1 분 동안 실온에서 품어.
  7. 조심스럽게 그리드에서 샘플을 제거하기 위해 필터 종이에 EM 그리드의 측면을 누릅니다.
  8. 조심스럽게 무딘면이 2 % 인 텅스텐 산에 휴식과 EM 그리드를 놓습니다.
  9. 1 분 동안 실온에서 품어.
  10. 조심스럽게 그리드에서 포스 산을 제거하기 위해 필터 종이에 EM 그리드의 측면을 누릅니다.
  11. TEM을 사용하여, 지단백질 (도 4)의 이미지를 캡쳐.

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결과

1 표시 정상 13 일 이후 합류 카코 2 세포를 그림. 돔형 구조 및 세포 내 지질 액 적의 모습 분화 카코 -2 세포의 특성이다. 카코 2 세포를 파종시에 동일하게 분산되지 않을 때, 그들은 덩어리와 접시의 특정 지역에서 자라다 것이다; 어떤 세포없이 접시에 몇 가지 영역이 될 것입니다. 소용돌이 경사면에 접시를 배치하는 것은 피해야한다. 이 후 합류 카코 2 세포가 새로운 성장 미디어가 너무 약 세포에 추가 될 때 초연에 더 취약 참고하는 것도 중요하다. 따라서, 새로운 미디어는 세포 분리를 방지하기 위해 부드럽게 추가해야합니다.

이러한 연구에 기초하여, 카코 -2 세포의 형질 전환 효율은 30~60% (도 2 상단 패널) 사이였다. 대조적으로, 렌티 바이러스 발현 시스템을 이용 카코 -2 전달 효율은 약 100 %였다 (도 2 ...

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토론

본 논문에서는 사용될 수 개의 시스템 카코 -2 세포, 즉, 정규 조직 배양 접시 투과 막을 기재되어 유지한다. 투과성 막 시스템을 사용할 때의 이점은 정점의 분리 및 기저 외측 구획하고, 지질 혼합물을 배양하는 동시에 지단백질 분비를 수집하는 기능을 포함한다. 다만, 투과 막 인서트 비싸고, 그 폴리 카보네이트 막 좋은 셀 가시성을 허용하지 않는다. 이 시험 관내 모델의 장점 중 하나는 유전자 조작 연구가 더 경제적이고 덜 시간 소모적이 될 것이라는 것이다. 더 나은 효과를 위해, 렌티 바이러스 발현 시스템이 사용되어야한다. 형질 카코 -2 세포는 일반적으로 자신의 유전자의 발현을 유지한다.

암죽 미립을 제조하기는 Caco-2 세포의 능력은 매우 중요하다. 이 기능이 없으면, 카코 2 세포는 efficie 할 수 없을 것입니다ntly, 친 유성 물질을 수송 포함하지만 liphophilic 약품, 비타민 A, D, E, K 및, 임의의 지용성 영양소에 한정되는...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 캘리포니아 노스스테이트 대학교 약학대학(AMN)의 Seed Grant Award의 지원을 받았습니다. 저자는 이 논문의 출판 비용을 지원해 준 California Northstate University College of Pharmacy와 이 원고를 편집하는 데 도움을 준 George Talbott에게 감사의 뜻을 전합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEMVWR16750-112세포를 추가하기 전에 개별 조직 배양 접시에 성장 매체를 미리 따뜻하게
FBSFisher3600511우리는 우리의 혈청
TrypsinVWR45000-660세포를 Trypsin 처리 전에 PBS로 세척할 수 있습니다.
투과성 멤브레인 시스템Fisher720017310cm 접시, 3mm 공극 크기, 폴리카보네이트 멤브레인
10cm 접시Fisher08-772-E조직 배양 접시
15cm 접시Fisher08-772-24조직 배양 접시
24웰 플레이트Fisher12565163조직 배양 플레이트
지질 기반 형질 주입 시약FisherPRE2691다른 transfection 시약으로 대체 가능
Reduced serum mediaInvitrogen11058021For transfection
pLL3.7 eGFPAddgene11795https://www.addgene.org/11795/
Bottle-top filterFisher9761120 0.45 mm pore
PolybreneFisherNC984045410 mg/ml
올레산시그마01383-5G동결-해동 주기
레시틴 방지 피셔IC10214625에그 레시틴 
나트륨 타우로콜레이트FisherNC9620276제품 단종; 대체 카탈로그 번호: 50-121-7956
프로테아제 억제제 칵테일 정제 (EDTA-free)Fisher5892791001주로 TEM 분석이 필요한 샘플에 사용됩니다
폴리카보네이트 초원심분리기 튜브FisherNC9696153여러 번 재사용하면 튜브가 무너집니다.
초원심분리기 튜브용 뚜껑FisherNC9796914에서 튜브/뚜껑을 제거하려면 도구가 필요합니다
Fisher50-949-261일회용
주사기 필터Fisher09-719C기공 크기 = 0.2mm; 나일론
포스포텅스텐 산FisherAC2083102502% 포스포텅스텐 산, pH 6.0
준비 핀셋Fisher50-238-62엑스트라 파인 및 강력한 팁
Formvar/탄소 그리드Fisher50-260-34Formvar/탄소 필름 사각 그리드 400 구리
하십시오 . 이 무너집니다. 로터 주사기

참고문헌

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