Caco-2 세포는 지질 및 지용성 약물/비타민의 장세포세포 수송을 연구하기 위한 시험관 내 모델로 사용할 수 있습니다. 투과성 멤브레인 시스템은 정점과 기저측 구획을 분리하는 반면, 렌티바이러스 발현 시스템은 효과적인 유전자 과발현 방법을 제공합니다. 지단백질의 분리는 TEM에 의해 확인됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
식이 지방 흡수에 대한 연구는 일반적으로 림프 캐뉼라를 장착한 동물 모델을 사용하여 수행됩니다. 이 동물 모델은 식이 지방 흡수의 생체 내 모델로 널리 받아들여지고 있지만, 관련된 수술 기술은 까다롭고 비용이 많이 듭니다. 동물 모델의 유전자 조작은 또한 비용과 시간이 많이 듭니다. 대안적인 체외 모델은 틀림없이 더 저렴하고 시간을 절약하며 덜 까다롭습니다. 중요한 것은 시험관 내 모델을 통해 조사자가 장세포를 격리된 시스템으로 검사할 수 있어 전체 유기체 모델에 내재된 복잡성을 줄일 수 있다는 것입니다. 이 논문은 인간 대장암 세포(Caco-2)가 지질, 지용성 약물 및 비타민의 장세포세포 수송을 연구하기 위한 체외 모델 역할을 할 수 있는 방법을 설명합니다. Caco-2 세포의 적절한 유지 관리와 지질 혼합물의 준비를 설명합니다. 또한 투과성 멤브레인 시스템을 사용하는 유용한 옵션에 대해 설명합니다. 분화된 Caco-2 세포는 편광되어 있기 때문에 투과성 멤브레인 시스템을 사용하는 주요 이점은 기저측 구획에서 정점을 분리한다는 것입니다. 결과적으로, 지질 혼합물은 정점 구획에 첨가될 수 있고 지단백질은 기저측 구획에서 수집될 수 있습니다. 또한, Caco-2 세포에서 유전자 발현을 상향 조절하는 렌티바이러스 발현 시스템의 효과에 대해 논의합니다. 마지막으로, 본 논문에서는 투과전자현미경(TEM)을 통해 장 지단백질의 성공적인 분리를 확인하는 방법에 대해 설명합니다.
서론
4 -식이 지방과 지용성 약물과 비타민의 장내 흡수 연구는 림프 누공 모델 1을 사용하여 생체 내에서 수행 할 수있다. 그러나 관련된 수술 기법은 도전뿐만 아니라 비용이 많이 드는되지 않습니다. 생체 이용 될 수 분변 분석에 기반 방식이지만, 이들은 위장관 2,5- 의해 흡수 퍼센트를 결정 주로 사용된다. 이 문서에 설명 된 체외 모델은 비용 효과적이며, 관련 기술은 틀림없이 덜 도전이다. 유전자 변형 연구는 시간이 많이 걸리는 사람들이 체외 모델을 사용하여 수행 할 때 더 경제적이고 저렴합니다.
장 세포에 의해 흡수되는 지용성 물질 지단백질 -6,7-로 포장되어 있기 때문에, 리포 단백질을 생산하기 위해이 시험 관내 모델의 효과는 매우 중요하다. 두 가지 주요 intestinaL 지단백질은 카일로 마이크론과 매우 저밀도 지단백질 (VLDL)입니다. 지질은 위장 루멘에 풍부하게 존재하는 경우 직경이 80 nm 이상과 지질 단백질로 정의 카일로 마이크론은, 소장에 의해 엄격하게 생산된다. 그들이 가장 큰 지단백질이기 때문에, 카일로 마이크론은 생각할 가장 효율적인 지질 수송이다. 킬로....
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프로토콜
카코 2 셀 1. 유지 보수
- 일반 조직 배양 접시를 사용하여
- (FBS를 37 ℃의 수조에서 바이알을 배치하여 냉동 바이알로부터의 카코 -2 세포를 해동하고, 즉시 예열 된 성장 배지 (15 % 소 태아 혈청 10 ㎖를 함유 10cm 조직 배양 접시에 추가 ) 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM))에서.
- 카코 -2 세포 50~70% 합류점에 도달 한 경우, 이들을 1 분할 : 그들은 분리 될 때까지 37 ℃에서 0.05 % 트립신 / 0.53 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 3 ㎖와 함께 세포를 배양하여 6 (15 분) . 세포 응집을 방지 부드러운 피펫 팅하여 세포를 여러 번 혼합합니다. 예열 성장 배지 10 ㎖를 함유 10cm 조직 배양 접시에 세포를 트립신 0.5ml를 추가.
- 부드럽게 좌우 방향으로 이어 전후 방향으로 요리를 여러 번 흔들어. 요리를 소용돌이 피으로는 불평등 한 세포 분산 될 수 있습니다.
- 5 % CO 2와 함께 제공되는 37 ° C의 배양기에서 평평한 표면에 요리를 놓습니다. 경사면은 불평등 세포 분산 될 수 있습니다.
- 배양을 시작한 후 성장 미디어에게 일을 변경합니다.
- 세포를 모니터링하고 ....
- (FBS를 37 ℃의 수조에서 바이알을 배치하여 냉동 바이알로부터의 카코 -2 세포를 해동하고, 즉시 예열 된 성장 배지 (15 % 소 태아 혈청 10 ㎖를 함유 10cm 조직 배양 접시에 추가 ) 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM))에서.
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결과
1 표시 정상 13 일 이후 합류 카코 2 세포를 그림. 돔형 구조 및 세포 내 지질 액 적의 모습 분화 카코 -2 세포의 특성이다. 카코 2 세포를 파종시에 동일하게 분산되지 않을 때, 그들은 덩어리와 접시의 특정 지역에서 자라다 것이다; 어떤 세포없이 접시에 몇 가지 영역이 될 것입니다. 소용돌이 경사면에 접시를 배치하는 것은 피해야한다. 이 후 합류 카코 2 세포가 새로운 성장 미디어가 너무 약 세포에 추가 될 때 초연에 더 취약 참고하는 것도 중요하다. 따라서, 새로운 미디어는 세포 분리를 방지하기 위해 부드럽게 추가해야합니다.
이러한 연구에 기초하여, 카코 -2 세포의 형질 전환 효율은 30~60% (도 2 상단 패널) 사이였다. 대조적으로, 렌티 바이러스 발현 시스템을 이용 카코 -2 전달 효율은 약 100 %였다 (도 2 .......
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토론
본 논문에서는 사용될 수 개의 시스템 카코 -2 세포, 즉, 정규 조직 배양 접시 투과 막을 기재되어 유지한다. 투과성 막 시스템을 사용할 때의 이점은 정점의 분리 및 기저 외측 구획하고, 지질 혼합물을 배양하는 동시에 지단백질 분비를 수집하는 기능을 포함한다. 다만, 투과 막 인서트 비싸고, 그 폴리 카보네이트 막 좋은 셀 가시성을 허용하지 않는다. 이 시험 관내 모델의 장점 중 하나는 유전자 조작 연구가 더 경제적이고 덜 시간 소모적이 될 것이라는 것이다. 더 나은 효과를 위해, 렌티 바이러스 발현 시스템이 사용되어야한다. 형질 카코 -2 세포는 일반적으로 자신의 유전자의 발현을 유지한다.
암죽 미립을 제조하기는 Caco-2 세포의 능력은 매우 중요하다. 이 기능이 없으면, 카코 2 세포는 efficie 할 수 없을 것입니다ntly, 친 유성 물질을 수송 포함하지만 liphophilic 약품, 비타민 A, D, E, K 및, 임의의 지용성 영양소에 한정되는.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 캘리포니아 노스스테이트 대학교 약학대학(AMN)의 Seed Grant Award의 지원을 받았습니다. 저자는 이 논문의 출판 비용을 지원해 준 California Northstate University College of Pharmacy와 이 원고를 편집하는 데 도움을 준 George Talbott에게 감사의 뜻을 전합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM | VWR | 16750-112 | 세포를 추가하기 전에 개별 조직 배양 접시에 성장 매체를 미리 따뜻하게 |
| FBS | Fisher | 3600511 | 우리는 우리의 혈청 |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | 세포를 Trypsin 처리 전에 PBS로 세척할 수 있습니다. |
| 투과성 멤브레인 시스템 | Fisher | 7200173 | 10cm 접시, 3mm 공극 크기, 폴리카보네이트 멤브레인 |
| 10cm 접시 | Fisher | 08-772-E | 조직 배양 접시 |
| 15cm 접시 | Fisher | 08-772-24 | 조직 배양 접시 |
| 24웰 플레이트 | Fisher | 12565163 | 조직 배양 플레이트 |
| 지질 기반 형질 주입 시약 | Fisher | PRE2691 | 다른 transfection 시약으로 대체 가능 |
| Reduced serum media | Invitrogen | 11058021 | For transfection |
| pLL3.7 eGFP | Addgene | 11795 | https://www.addgene.org/11795/ |
| Bottle-top filter | Fisher | 9761120 0.45 mm pore | |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | 10 mg/ml |
| 올레산 | 시그마 | 01383-5G | 동결-해동 주기 |
| 레시틴 방지 | 피셔 | IC10214625 | 에그 레시틴 |
| 나트륨 타우로콜레이트 | Fisher | NC9620276 | 제품 단종; 대체 카탈로그 번호: 50-121-7956 |
| 프로테아제 억제제 칵테일 정제 (EDTA-free) | Fisher | 5892791001 | 주로 TEM 분석이 필요한 샘플에 사용됩니다 |
| 폴리카보네이트 초원심분리기 튜브 | Fisher | NC9696153 | 여러 번 재사용하면 튜브가 무너집니다. |
| 초원심분리기 튜브용 뚜껑 | Fisher | NC9796914 | 에서 튜브/뚜껑을 제거하려면 도구가 필요합니다 |
| Fisher | 50-949-261 | 일회용 | |
| 주사기 필터 | Fisher | 09-719C | 기공 크기 = 0.2mm; 나일론 |
| 포스포텅스텐 산 | Fisher | AC208310250 | 2% 포스포텅스텐 산, pH 6.0 |
| 준비 핀셋 | Fisher | 50-238-62 | 엑스트라 파인 및 강력한 팁 |
| Formvar/탄소 그리드 | Fisher | 50-260-34 | Formvar/탄소 필름 사각 그리드 400 구리 |
참고문헌
- Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).
- Nauli, A. M., et al.
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재인쇄 및 허가
