입자 추적 미세유변학은 재료의 점탄성을 조사합니다. 여기서 이 기술은 박테리아 생물막의 다양한 매트릭스 구성 요소에 대한 점탄성, 크리프 규정 준수 및 효과적인 가교 역할을 결정하는 데 사용됩니다. 매트릭스는 박테리아가 분비하는 고분자 물질로 구성되며 그 구성 요소는 생물막 구조와 기계적 특성을 결정합니다.
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이 논문에서
요약
초록
박테리아 세포는 세포외 고분자 물질(EPS)로 자신을 감싸서 생물막으로 알려진 표면 부착 생물막 군집을 형성할 수 있습니다. EPS는 박테리아 세포를 수용하는 물리적 및 보호 골격 역할을 하며 단백질, 외다당류 및 DNA를 포함한 다양한 물질로 구성됩니다. EPS의 조성은 변경될 수 있으며, 이는 환경적 단서에 대한 반응으로 스트리머와 같은 대체 생물막 구조를 추가로 개발하거나 지원하기 위해 생물막의 기계적 특성을 리모델링할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 EPS 성분이 생물막의 기계적 특성과 기능에 어떻게 기여하는지에 대한 정량적 설명은 거의 없습니다. 물질의 흐름에 대한 연구인 유변학은 많은 생물막이 유동 조건에서 성장하고 지속적으로 전단 응력에 노출되기 때문에 생물막과 특히 관련이 있습니다. 또한 표면에 생물막이 퍼지는 것에 대한 측정 및 통찰력을 제공합니다. 여기에서 입자 추적 미세유변학은 개발 중 생물막의 다양한 부분에서 서로 다른 매트릭스 구성 요소의 점탄성과 효과적인 가교 역할을 검사하는 데 사용됩니다. 이 접근 방식을 통해 연구원은 마이크로 스케일에서 생물막의 기계적 특성을 측정할 수 있으며, 이는 생물막 제어 및 엔지니어링에 유용한 정보를 제공할 수 있습니다.
서론
대부분의 박테리아 세포는 모두 플랑크톤 (자유 생활)과 성장 (1)의 표면에 부착 (고착) 모드를 사용 할 수 있습니다. 성장면 부착 모드에서, 박테리아 세포는 분비 및 세포 외 폴리머 물질 (EPS) 바이오 필름을 형성하기 위해 다량으로 자신을 싸는. EPS는 주로 단백질, 엑소 폴리 사카 라이드, 세포 DNA로 구성되어 생물막 형성이 필수적이다. 그것은 박테리아가 공간적으로 구별하기 위해 사용하고 유해 환경 조건 및 호스트 응답에서 박테리아를 보호 할 수있는 물리적 발판 역할을한다. EPS의 다른 구성 요소는 크게 생물막 구조 4 개조 할 수 EPS 구성 요소의 표현에 biofilm 형성 (3) 변경에 별개의 역할이있다. EPS 구성 요소는 또한 5 시그널링 분자로서 기능 할 수 있으며, 최근의 연구는 이주 및 생물막 DIFF 안내하는 미생물 세포와 상호 작용하는 특정 EPS 성분을 보여 주었다erentiation 6-8.
EPS에 대한 연구는 크게 EPS 9, 10의 특정 구성 요소에 결함이있는 돌연변이에 의해 생성 된 바이오 필름의 형태 학적 분석을 기반으로 고급. 또한, EPS 보통 매크로 스케....
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프로토콜
1. 바이오 필름 재배
- 균주의 제조
- 일일 사전 생물막 재배, 냉동 세균성 문화에서 적절한 성장 배지 2 ㎖를 접종하여 플랑크톤 세균 문화를 준비합니다. 점액 P.에 대한 루리아 - 국물 매체 (10g의 L -1의 NaCl, 10g L -1 효모 추출물 및 10g의 L -1 트립 톤)를 사용하여 녹농균과 Δ의 화소와 Δ의 PSL 결함이있는 돌연변이. 37 ° C에서 200 rpm으로 진탕 조건에서 밤새 품어. 분광 광도계를 사용하여 OD 0.40 600 밤새 배양을 희석.
- 바람직하게는 분해하지 않고 플로우 셀을 이미징 현미경 실하게 될 수 이동국 또는 트롤리에 앞서 14 설명한 플로우 셀 설정을 조립한다.
- 2 L 또는 각 플로우 셀에 대한 5 L 병에 무균 성장 매체를 준비합니다. 최소 배지 (M9) (48 mM의 나 2 HPO 4, 22 mM의 사용KH 2 PO 4, 19 mM의 NH 4 CL, 9 밀리미터의 NaCl, 2 mM의 황산, 그리고....
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결과
보이드 (바이오 필름 위의 매체), 평원 (세포의 미분화 평면 층) 및 microcolonies (그림 2A의 라벨 참조)에 포함 된 바이오 필름의 다른 지역에서 바이오 필름의 로컬 점탄성 특성을 조사 하였다. 일에서 성숙하는 동안 바이오 필름의 점탄성 특성의 시간적 변화는 3-5도를 측정 하였다. 보이드의 입자 MSD 순수한 매질 입자 MSD에 제어 및 비교로서 사용 하였다. 반면, 생물막에 갇혀 입자가 고정 된 위치에서 진동과 MSD 값은 점탄성 물질의 전형적인 그 강하게 탄성 젤에게 (그림 3)에서였다.
점액 P. aeruginosa의 야생 유형과 Δ 펠 돌연변이 균주 (그림 2A와 2B)는 자신의 바이오 필름에 3 일에 의해 얇은 일반에 흩어져 microcolonies을 개발했다. 3 일에 일반은 너무 얇았다유변학 적 특성의 조사. 점액
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토론
Microrheology는 미생물 바이오 필름 등의 이기종 시스템, 로컬 유변학 적 측정을위한 유용한 도구입니다. 그것은 여러 시간 지점 위에 동일한 생물학적 샘플 내의 유동 학적 변화를 실시간으로 모니터링 할 수 있도록, 비파괴 기술이다. 이 프로토콜에서, 입자 추적 microrheology 그들이 탄성 생물막 매트릭스의 가교 효과에 미치는 영향을 조사하기 위해 펠 PSL 엑소 폴리 사카 라이드 및 돌연변이에 적용 하였다. 펠 점탄성 및 패자 생물막을 선호하는 반면 PSL 높은 효과적인 가교 탄성 생물막의 개발을 선호. 모두 엑소 폴리 사카 라이드가 생성되는 경우, 생물막 microcolonies 덜 효과적으로 펠 이상 PSL의 감소와 일치, 생물막이 성숙 가교된다.
다른 종의 박테리아에 의해 형성된 생물막은 별개의 EPS 조성이 있습니다. 점액 (P)의 EPS 주로 consi 본 연구에 사용 된 aeruginosa의 균주 엑소.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 우수 프로그램의 연구 센터에서 교육 싱가포르 국립 연구 재단과 교육부에 의해 지원, 스타트 업 보조금 난양 기술 대학 (M4330002.C70), 및 AcRF 계층 2 (MOE2014-T2-2-172) 교육부, 싱가포르. 저자는이 프로토콜의 데모에 참여 조이 참마 Kuok Hoong 감사합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 형광구 | Invitrogen | F-8821 | 1.0 μ M 카르복실레이트 변형이 있는 적색 형광(580/605) 미세구 |
| Zeiss Axio Imager M1 | Carl Zeiss | Epifluorescent Microscope | |
| Masterflex L/S Digital Drive 07523-80 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | 연동 펌프 |
| 플로우 셀 챔버 | 덴마크 기술 대학교 | ||
| 버블 트랩 | 기술 대학교 | ||
| 실리콘 튜빙 | Dow Corning | 3mm 외경, 1 mm 내경 | |
| 투명 폴리프로필렌 플라스틱 커넥터 | Cole Parmer | 06365-83 | 1/16 인치. (1.588의 mm) |
| 바인더 클립 | 튜빙 | ||
| 클램프 Coverslips | Thermo Scientific™ Nunc™ | 50 x 24 mm | |
| 주사기 3 ml | Terumo | ||
| 27 G 바늘 | 테루모 | ||
| 2 L 저장/미디어 병 | VWR® | ||
| 트롤리 | 생물막 설정을 유지하기 위해 |
참고문헌
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Yang, L., et al.
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재인쇄 및 허가
