고체 지질 나노 입자 (SLNs) 세포 내 타겟팅을위한 응용 프로그램

요약

이 연구에서는 생체 적합성 나노 입자의 초소형 집단을 합성하는 방법과 세포 상호 작용을 평가하기 위한 몇 가지 시험관 내 방법을 설명했습니다.

초록

나노 입자 기반 전달 차량은 세포 내 표적화 응용 분야에 큰 가능성을 보여주었으며 세포 신호 전달 및 유전자 발현을 특이적으로 변경하는 메커니즘을 제공했습니다. 이전 조사에서는 국소 약물 전달 및 바이오마커 검출 응용을 위한 초소형 고체 지질 나노입자(SLN)의 합성이 입증되었습니다. SLN은 유망한 약물 전달 매개체로 부상한 나노 입자 전달 시스템의 잘 연구된 예입니다. 이 연구에서는 SLN에 형광 염료를 주입하여 입자-세포 상호 작용을 조사하기 위한 모델로 사용했습니다. 위상 반전 온도(PIT) 방법은 생체 적합성 나노 입자의 초소형 집단을 합성하는 데 사용되었습니다. 나노 입자-세포 상호 작용 연구 전에 적절한 투여 수준을 설정하기 위해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide(MTT) 분석을 활용했습니다. 또한, 1차 인간 진피 섬유아세포와 마우스 수지상 세포는 시간이 지남에 따라 염료가 주입된 SLN에 노출되었으며 독성 및 입자 흡수와 관련된 상호 작용은 형광 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 특성화되었습니다. 이 연구는 나노입자 전달 시스템인 초소형 SLN이 다양한 세포 유형의 세포 내 표적화에 적합하다는 것을 보여주었습니다.

서론

나노 입자 기반 전달 비히클은 특히 셀룰러 시그널링 및 유전자 발현을 변경하는기구를 제공하고, 세포 내 표적 애플리케이션을위한 큰 약속을 보여 주었다. 이들 차량은 약물, 단백질 및 세포 반응에 영향과 표적 조직에서 원하는 효과를 달성하도록 설계된 핵산으로 로딩 될 수있다. nanocarriers 여러 유형의 지질, 폴리머, 실리콘, 및 자성 물질을 포함하여 치료 및 진단을 위해 유익 탐구되어왔다. 이러한 시스템으로 인해 치료 목표 조직에서 농도 및 독성의 감소를 증가 지역화 된 약물 전달에 대한 자신의 잠재력에 매력적이다.

고형분 지질 나노 입자 (SLNs)는 최근 유망한 약물 전달 비히클로 떠오르고있다 나노 입자 전달 시스템의 잘 연구 된 예이다. SLNs 용이 바이오 센싱 ^{(1), (2)} 화장품 및 t를 포함하여 다수의 애플리케이션 용으로 제형 화 될 수있다herapeutic 배달 ^3-7. 효용성은 향상된 생체 적합성 결과, 재 흡수성, 독성 지질 전적으로 구성되어 있다는 사실로부터 유래한다. 합성 과정에서, 친 유성 약물함으로써 비경 구 투여 용 약물 용해도 및 적합성을 증가 SLN 차량에 통합 될 수있다. SLN 차량은 또한 그 분해 및 클리어런스를 감소 및 치료 작용을 극대화 캡슐화 치료학을 안정하는 것을 돕는다. 이러한 차량으로 인해 체온 ^{3,4,8,9에서} 안정성에 특히 긴 연기, 제어 방출 제제에 적합하다. 중요한 지질 나노 입자의 약물의 캡슐화는 약물 분자의 극한 약동학 프로파일을 변경. 이것은 좁은 치료 지수를 가진 약물의 제어 방출을 허용함으로써 잠재적 이점을 제공한다. SLN-혼입 치료제의 방출 속도는 조정 지질 분해 속도 또는 약물의 확산 속도에 기초 할 수있다지질 매트릭스.

SLNs는 종종 특정 표적 조직에 축적하도록 설계되었습니다. 예를 들어, 크기 (전형적으로는 10 nm 이상)는 종양 조직의 새는 혈관은 증착을 용이하게 순환의 유지를 증강시켜. 또한, 입자 투여 경로는 예컨대 림프절 ^10,11 특정 생리 학적 구조를 대상으로 잠재적으로 생체 분포를 변경하는 것으로 나타났다. 표적 조직에 침착, 적당한 세포 상호 작용을 달성하고 궁극적으로 나노 입자의 내재화에 의한 선택적으로 셀 ^(12)의 밖으로 이온 및 분자의 흐름을 제어하는 세포막의 능력에 도전. 세포 흡수를 용이하게하기 위해, 펩타이드, 작은 분자 및 모노클로 날 항체 ^{(13, 14)을} 포함하여 특정 리간드 nanocarriers을 수정하는 것이 가능하다. 수동 침투 및 나노 입자의 능동 수송을 모두 포함하는 여러 메커니즘세포막 이전 ^3,12,15을 설명 하였다. 일반적으로, 이것은 세포 - 나노 입자의 상호 작용은 이러한 세포 형태 또는 세포주기 단계 ^(12)와 같은 셀 - 특정 매개 변수 외에, 크기, 형상, 표면 전하 및 표면 화학을 포함하는 나노 입자의 물리 화학적 특성에 의해 영향을받는 것으로 입증되었다.

이전의 조사는 상전이 온도 ^(PIT)을 사용하는 방법 ^{(17) (16)} 및 국소 바이오 마커 검출 애플리케이션 ¹ 서브 10 나노 SLNs의 합성을 증명했다. 이것은 온도가 서서히 변화시키면서 조성물은 일정하게 유지 ² 부드러운 합성법이다. 가열 된 용액의 연속 교반,로는 나노 에멀젼의 RT 결과를 냉각시킨다. 보다 작은 입자 크기를 가진 ¹ SLNs의 합성 과정이 결과는 이전의 NaN 지질 합성을위한 다양한 방법을 이용하여보고oparticles ^{17 ~ 22.} 얻어진 크기 규모는, 20nm 이하는, 증가 된 표면적과 상호 작용을위한 향상된 셀룰러 전위 세포 표적화 애플리케이션을위한 이점을 제공한다.

형광 염료 또는 치료를 제공하도록 설계 SLNs의 개략은,도 1에 도시된다. SLNs는 지질 내부 (예를 들면, 선형 알칸) 친 유성 화합물 (예를 들면, 염료 또는 치료제)의 결합을 허용하고, 계면 활성제의 외관의 구성 물에 둘러싸여 (예를 들어, 선형 비이 온성 계면 활성제). 본 연구에서는 SLNs는 형광 염료로드 된 입자 세포 상호 작용을 조사하기 위해 모델로 사용. 차 인간 피부 섬유 아세포 및 마우스 수지상 세포 독성 및 흡수 입자에 대하여 상호 작용을 특성화하기 위해 시간에 걸쳐 SLN 로딩 염료를 노출시켰다. 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) -2,5- diphenylphenyltetrazolium 브로마이드 (MTT) 분석은 utili이었다적당한 투여 수준을 설정하기 위해 평탄화. 형광 현미경 및 유동 세포 계측법은 시험관 내에서 입자의 흡수를 검사하기 위해 사용하는 두 가지 방법이었다.

주요 성분을 표시 SLN의 그림 1. 도식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

SLNs 1. 처리

1. SLNs의 합성
   참고 : 하위 20 나노 SLNs ^1을 제조 피트 방법 ^1,17,20을 사용합니다.
   1. 무균 기술, bioreagents 또는 세포 배양 등급 시약 및 살균 물질 (즉, 피펫, 주걱, 유리 병 등)를 사용합니다.
   2. SLNs의 합성 (그림 2)에 대한 바이오 안전성 캐비닛을 사용합니다.
   3. 형광 염료의 0.6 ㎎을 결합하고 바이알 (15 mL)에 Heneicosane (지질, 5 중량 / 중량 % 지질 농도) 0.10 g에서 공동 용융 (나일 레드 (NIR)을, NIR 농도는 약 0.3 ㎎ / ㎖ 임) 90 ° C 및 교반.
   4. 0.11 g의 폴리 옥시 에틸렌 (10) 올레 일 에테르 (계면 활성제, 5.5 중량 / 중량 % 계면 활성제 농도)를 추가합니다. 90 ℃에서 교반하고, 생성 된 혼합물을 동시 - 용융.
   5. 90 ° C의 혼합물, 열 멸균 물 1.79 g을 넣고, 투명 나노 에멀젼이 형성 될 때까지 저어.
      참고 : 계속 교반 및 제어 냉각, SL에서NS 생성됩니다. 이러한 조건은 중유 에멀젼 유 중수 에멀젼의 반전을 일으킨다. 이러한 지질 방울에 NIR 파티션으로 친 유성 분자.
   6. 대조군 샘플로서 기능하기 위해서는, 형광 색소를 첨가하지 않고 평행 나노 에멀젼을 제조. 90 ° C, 및 바이알에서 교반 (15 mL)을 공동으로 용융물 Heneicosane 0.10 g 및 0.11 g의 폴리 옥시 에틸렌 (10) 올레 일 에테르 결합.
      1. 90 ° C의 혼합물, 열 멸균 물 1.79 g을 넣고, 투명 나노 에멀젼이 형성 될 때까지 저어.
   7. 또한 멸균 0.2 μm의 필터를 사용하여 각각의 나노 에멀젼을 살균.
   
   그림 SLNs의 합성 2. 도식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 입자 크기와 폴ydispersity
   1. 입자 크기 및 분산도 유리 큐벳을 사용 SLNs ¹ 및 입자 크기를 측정하기위한기구를 측정하기 위해 동적 광산란 (DLS)을 사용한다.
   2. 시료의 측정에 앞서, 표준 제제와 측정을위한 제조사의 프로토콜은 다음 두 가지 알려진 표준 입자 크기를 측정한다.
   3. 표준 용액 1.5 ㎖의 유리 큐벳을 채우고 샘플과 같은 측정 조건을 사용하여 표준 용액을 측정한다.
      주 : 이전 단계는 각 표준에 대해 반복 하였다.
   4. 제조 된 샘플을 측정합니다. 각각에 대해,하기 실험 파라미터들을 사용하여 100 초, 물의 굴절율 (1.33), 물의 점도의 실행 시간을 20 ° C (1.002 MPA · 초)에서.
      주 :이 기술은 주파수가 나노 입자의 크기를 측정하기 위해 광을 시프트 이용한다.
   5. 이상적 상대의 평균 입자 직경 및 분산도를보고CLE 크기 분포.
3. 녹는 점과 녹는 잠열
   1. SLNs ^(1)의 열적 거동을 조사하기 위해 자동 샘플러 및 액체 질소 냉각 소스를 구비 시차 주사 열량계 (DSC)를 사용한다.
   2. 약 25 밀리그램의 질량과 40 μL의 알루미늄 팬에 AS-준비 SLNs를 피펫 및 기밀 DSC 스캔 중에 수분 손실을 최소화하기 위해 보편적 크림 퍼 프레스를 사용하여 팬을 밀봉.
   3. 5 ~ 80 ° C에서의 각 나노 에멀젼을 측정한다.
   4. 융점 계곡 융점 물질의 양으로 나눈 DSC 플롯에서 곡선 아래 면적의 적분을 나타내는 DSC 플롯에서 용융 잠열이 융해 잠열을 나타내는보고한다.

섬유 아 세포와 수지상 세포 2. SLNs 상호 작용

1. 기본 인간 섬유 아세포의 문화
   1. 문화 차 인간 Fi를broblasts 낮은 혈청 성장 보충 (LSGS) 키트 보충 (106 중) 인간 피부 섬유 아세포의 배양 액체 배지에서 제조업체의 지침에 따라. 80 % 합류에 도달시, 37 ℃, 5 % CO _2에서 배양 가습 분위기에서 세포를 유지한다.
   2. MTT 및 이미징 웰 당 2 × ¹⁰⁴ 세포의 밀도로 분석 96 웰 플레이트에 시드 세포, 및 37 ° CO / N 종래 SLN 노광에서 평형을 허용 모두.
   3. 지질 농도에 대하여, (도 4)에 표시하고, 각 웰 당 10 μL를 추가로 타임 제로에서, 완전 배지로 희석 SLNs 96 웰 플레이트에 웰 복제.
   4. 인큐베이션 기간 동안, 37 ° C, 5 % CO _2에서 세포를 유지한다.
2. MTT 독성 분석
   1. SLNs으로 배양 24 시간 후에, 제조자의 프로토콜에 따라 MTT 분석을 이용하여 세포 생존력을 결정한다.
   2. 한 번 세포를 세척하고 각 웰 (100 μL / 웰)에 새로운 배지를 추가합니다. 새로운 배지로 교체하기 전에 10 분 동안 70 % 메탄올 용액에 배양에 의해 제어 우물을 죽여.
   3. 마이크로의 각 웰에 MTT 시약 (물론 당 10 μL)를 첨가하고, 37 ℃에서 O / N을 품어.
   4. O / N 배양 한 후, 제조 업체의 프로토콜에 따라 제공되는 세제와 세포 내 formazin 결정을 (물론 당 100 μL) 용해.
   5. RT에서 3 시간 배양 한 후, 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 570 nm의 파장에서 측정 된 흡광도 값을 얻었다.
      참고 : 3- (4,5- dimethylthiazolyl-2) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (V / W)은 1 % 미만이어야 사용 MTT 시약.
3. 형광 현미경
   1. SLN와 섬유 아세포의 투여 후 특정 시점에서, 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 두 번 씻어 섬유 아세포를 차가운 70 % 메탄올로 10 분 동안 고정한다.
   2. 10 분 후, 대역 통과 (BP) 50분의 690 nm의 필터 세트를 사용하여, 거꾸로 현미경을 사용하여 PBS 캡처 이미지와 메탄올을 대체합니다.
4. 마우스 골수 수지상 세포의 문화
   1. 유도 마우스 골수 유래의 수상 세포 (BMDC)는 앞서 ^{설명한 23,24.} 간략히, 재조합 쥐 과립구 - 대 식세포 콜로니 - 자극 인자 (GM-CSF, 300 U / ml) 및 재조합 뮤린 IL-4와 2 × ⁶ / 플레이트에서 100mm 배양 접시에서 C57BL / 10 골수 플레이트 단일 세포 현탁액 (B 세포 인자는, 200 U / ㎖의 자극). 3 일마다 미디어를 변경합니다.
   2. 7 일째, 37 ° C에서 세포를 0.5 μg의 5.0 / ㎖ 지질의 최종 농도로 요리 근적외선 SLNs로드를 추가하고 유지, 노출, 원하는 길이의 5 % CO ₂ 인큐베이터.
   3. 판의 철저한 세척 한 다음, 50 ㎖ 튜브에 수집, 판에있는 모든 미디어를 흡입하여 요리에서 세포를 수집 (느슨하게 광고를 꺼 내려4 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수 5 ㎖ (PBS)와 내재 세포). 동일한 50 ㎖ 튜브에서 얻은 세포 현탁액을 수집한다.
5. 유동 세포 계측법을 통해 SLNs 법인의 평가
   1. 2.4.3 점에서 얻어진 세포 현탁액의 농도를 결정하고 12mm X 75mm의 둥근 바닥 FACS 튜브에 3 × ^{105 세포를} 분산.
   2. PBS 1 ㎖를 첨가 한 후 4 ℃의 온도에서, 400 XG에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리하여 세포를 세척한다.
   3. 상층 액을 제거하고 방지하는 CD11c-FITC 모노클로 날 항체 (0.25 μg의 / ㎖ 최종)를 함유하는 PBS / 2 mM의 EDTA / 0.1 % 소 혈청 알부민 100 ㎕ (BSA) (염색 완충액)으로 펠렛을 재현 탁. 어둠 속에서 얼음에 30 분 동안 품어.
   4. PBS 1 ㎖로 세포를 씻어 준 후 4 ℃의 온도에서, 400 XG에서 5 분 동안 원심 분리 튜브.
   5. 뜨는을 취소하고 각을 재현 탁염색 버퍼 400 μL로 펠렛. 셀은 유동 세포 계수기 (아마도 파란색과 빨간색 레이저가 장착)와 샘플 수집을위한 준비가되어 있습니다.
   6. 분석 소프트웨어 유세포를 사용하는 CD11c + 세포 (FITC 양성)의 모집단에 게이팅 및 (를 PerCP-Cy5.5 또는 APC 채널에서 측정) SLNs 관련 형광의 세기를 비교하여 DC에 의한 SLNs 혼입 수준을 평가.

결과

PIT 방법은 SLNs를 합성하는 데 사용하고, 상전이 온도 수조를 이용하여 측정 하였다. 샘플을 서서히 가열하여 맑은 용액이 등장 할 때까지 온화하게 교반한다. heneicosane 지질을 사용하여 제조 SLNs위한 상전이 온도는 45 ° C. 표 1은 입자 크기, 분산도, 융점 SLNs 위해 용융 잠열을 요약 한 것이다. 전술 한 공정 조건을 사용하여 합성 SLNs은 18.59 및 16.87 nm의 평균 입자 직경 및 5.83 및 4.47의 다 분산도는 각각 (도 3)와 제어 SLNs와 근적외선로드 SLNs 결과. SLNs 분산액의 안정성은 두 개의 서로 다른 저장 온도 (4 및 23 °의 C)에서 6일 위에 입자 크기의 측정에 의해 모니터링 하였다. 입경 6 일 동안 변화가 없었다 (데이터는 미도시).

SLNs의 열 동작은 investig했다시차 주사 열량계를 사용 ated. 합성 SLNs 각각 제어 SLNs와...

토론

본 연구에서는 SLNs의 합성과 세포 내 표적 응용 프로그램에 대한 적용 가능성은 탐구했다. 이러한 생체 적합성 나노 입자는 약물 전달, 유전자 침묵, 그리고 백신 기술을 ^{25 ~ 30} 등의 여러 응용 프로그램에 대한 배송 차량 등의 약속을 보여 주었다. 초소형 SLNs가 용이 한 공정으로 합성하고, 주요 피부 세포 및 주요 면역 세포와의 상호 작용을 탐색 하였다. SLNs는 모델 치료화물을 역임 형광 염료 (NIR)의 캡슐화를 포함하도록 설계되었다.

PIT SLN 방법은 얻어진 입자의 성질 (융점의 입자 크기, 분산도, 융점 및 잠열) 동적 광산란 및 시차 주사 열량계를 사용하여 평가 하였다를 합성하는데 이용 하였다. 세포 내 대상에 대한 입자 크기 및 분산 분석 좁은 분산도 초소형 SLNs의 합성을 밝혀, 이상보내고 응용 프로그램. 이전에보고 된 바와 같이, 입자 크기가 세포의 상호 작용 ^(12)에 중요한 역할을 할 수있다. 나노 입...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
나일 레드 (NiR)	Sigma	19123	BioReagent, 형광에 적합, ≥ 98.0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, 폴리옥시에틸렌 (10) 올레일에테르
Water	Sigma	W3500	멸균 여과, BioReagent, 세포 배양
주사기 필터 0.2 &마이크로에 적합합니다. m Supor Membrane Low Protein Binding	Life Sciences	PN4612	비발열성
Nanotrac Ultra	Microtrac	일련 번호 U1985IS	계기
시차 주사 열량계	Mettlet-Toledo		Instument
주요 인간 섬유아세포	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	인간 피부 섬유아세포 배양을 위한 무균 액체 배지.
저혈청 성장 보충제 키트(LSGS 키트)	Life Technologies	S-003-K	완전한 LSGS
MTT 세포 증식 분석 키트	Trevigen	4890-025-K	테트라졸륨 염, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT)
Safire2 마이크로플레이트 리더	Tecan	의	기구
인산염 완충 식염수	Sigma	P5493	분자생물학용
재조합 쥐 GM-CSF	Peprotech	315-03	>97%, 감소 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 및은 염색으로 시각화.
재조합 쥐 IL-4	Peprotech	214-14	>97%, 감소 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 및은 얼룩으로 시각화.