방법 논문

대사 분석을위한 미토콘드리아 농축 분획의 제조

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DOI:

10.3791/53149

⸱

2015년 9월 30일

 , 
1Biology Department, Adelphi University, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, Brown University

이 논문에서

요약

미토콘드리아는 신진대사와 항상성을 조절하는 데 중심적인 역할을 합니다. 유기체 생리학에 영향을 미치는 미토콘드리아 대사의 미묘한 변화는 전체 유기체 대사체학 연구에서 감지하기 어려울 수 있습니다. 여기에서는 Drosophila melanogaster에서 미묘한 대사 변화의 감지를 향상시키는 분리 방법을 설명합니다.

초록

미토콘드리아는 아미노산 대사, 탄수화물 대사 및 지방산 산화에 중요한 역할을 하기 때문에 미토콘드리아 기능의 결함은 종종 이러한 복잡한 질병으로 고통받는 사람들의 삶을 위태롭게 합니다. 미토콘드리아 대사 변화를 감지하는 것은 미토콘드리아 장애와 약리학적 제제에 대한 미토콘드리아 반응을 이해하는 데 매우 중요합니다. 미토콘드리아 대사가 대사 조절의 핵심이지만, 미토콘드리아 대사의 미묘한 변화를 감지하는 것은 전체 유기체 또는 전체 조직 추출을 사용하여 얻은 다른 세포질 대사 산물의 과대 발현으로 인해 방해를 받을 수 있습니다.

여기에서는 초파리에서 whole-fly 제제와 미토콘드리아 농축 제제 간에 뚜렷한 뚜렷한 미토콘드리아 대사 변화를 감지한 분리 방법을 설명합니다. 이 방법의 민감성을 설명하기 위해 유전적으로 다양한 미토콘드리아 DNA(mtDNA)를 품고 있는 초파리 세트를 사용하여 라파마이신(rapamycin)이라는 약물에 노출시켰습니다. 이 방법을 사용하여 우리는 라파마이신이 미토콘드리아 유전자형 의존적 방식으로 미토콘드리아 대사를 수정한다는 것을 보여주었습니다. 그러나 이러한 변화는 미토콘드리아 농축 분획에서 대사 산물을 추출했을 때 대사체학 연구에서 훨씬 더 뚜렷하게 나타납니다. 대조적으로, 전체 조직 추출물은 mtDNA와 독립적으로 약물 rapamycin에 의해 매개되는 대사 변화만 감지했습니다.

서론

이 절차의 목적은 초파리를 이용하여 대사 체학 연구에 대한 충분한 미토콘드리아 대사 산물을 산출 풍부한 미토콘드리아 분획을 개발하는 것입니다. 우리의 경험에 의하면, 전체 세포 추출 방법을 사용하여 대사 체학 분석은 초파리의 미묘한 미토콘드리아 대사 산물의 변화를 감지 할 수 없습니다. 그러나, 종래 대사 체학 분석 미토콘드리아 분별은 미토콘드리아 대사 변화를 식별하기 위해 감도를 증가시킨다.

미토콘드리아는 세포가 정상적인 기능 (1)에 필요한 에너지의 90 %를 제공 할 책임이 세포 소기관이다. 최근 몇 년 동안 그것은 미토콘드리아 단지 아데노신 삼인산 (ATP)를 생산하는 것보다 세포 및 유기체 기능에 훨씬 더 역동적 인 역할을하고, 지금 대사 항상성의 2,3의 규제를위한 허브로 인식되는 것을 인식하고있다. 미토콘드리아는 DIS되는 endosymbiotic 프로세스의 결과tinct 미생물 계통 1.5 억년 전에 4 ~ 합병했다. 미토콘드리아에 해당하는 세포 기관으로 발전으로, endosymbiont에서 유전자 신흥 핵 게놈에 통합되었다. 37 유전자가 산화 적 인산화 (5)의 효소 복합체의 서브 유닛이다 미토콘드리아 단백질을 인코딩 13있는 미토콘드리아 DNA에 남아있는 동안 동물 오늘날, 약 1,500 미토콘드리아 단백질은 핵 인코딩됩니다. 미토콘드리아 및 핵 구획 간의 조정은 미토콘드리아 적절한 기능을 유지하는데 필요하다.

여기에 설명 된 방법을 이용하여, 우리는 미토콘드리아 게놈과 핵 사이의 조정 조작의 결과 초파리 미토콘드리아 대사의 변화를 감지 할 수 있었다. 우리는 미토콘드리아 DNA 라 자매 종에서 초파리의 변형을 사용 simulans는 단일 D. 위에 놓는다 핵 배경 6 melanogaster의. 이 '중단'mitonuclear유전자형은 D의 '기본', 또는 공동 발전 mitonuclear 유전자형을 비교 하였다 네이티브 (D)와 같은 핵 게놈을 들고 melanogaster의 미토콘드리아 DNA를 melanogaster의. D. melanogaster의 및 D simulans mtDNAs 100 ~에 의해 아미노산과 mitonuclear 통신 7,8에 영향을 미칠> 500 동의어로 대체를 다릅니다. 우리는 약리학 적 스트레스에 반응하여 대사 산물의 변화를 연구하기 위해 전체 비행 추출물과 미토콘드리아 농축 추출물을 생성합니다. 여기에서 우리는 미토콘드리아 농축 분수를 사용하는 경우 우리는 (D)를 운반하는 네이티브, 공동 발전 유전자형 사이의 미토콘드리아 대사에 뚜렷한 변화를 감지 것을 보여 melanogaster의의 mtDNAs와 D를 들고 혼란 유전자형 simulans 미토콘드리아 DNA. 반면, 이들 두 유전자형 간의 대사 변화는 전체 플라이 추출물을 이용하는 통상의 방법을 사용하여 미묘. 따라서,이 방법은 mtDNAs이의 미토콘드리아 변화를 중재 방법을 이해하는 경로를 제공다른 약물에 반응.

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프로토콜

1. 시약 및 솔루션

  1. 플라이 음식과 미디어의 준비
    1. 열 플라이 재료를 90 ℃로 설정 열판에서 물에 V / W 0.79 % 한천 11 % 설탕, 2 % 자기 분해 된 효모, 5.2 %의 옥수수 가루,. 균질 혼합물을 약간 조밀 얻어 질 때까지 정기적으로 교반한다. 각각의 음식을 비행 5 ㎖와 100 병의 총 비행 음식의 550 ML의 최종 부피를 준비합니다.
    2. , 열원으로부터 제거 음식 아래 80 ° C로 냉각 될 때까지 때때로 교반하고, 95 % 에탄올에 녹인 0.2 % tegosept 메틸 -4- 히드 록시 벤조 에이트를 추가한다.
    3. 두 개의 동일한 볼륨에서 음식을 분할합니다. 다른 볼륨에 에탄올 50 mm의 하나의 볼륨에 에탄올 라파 마이신의 1.1 ml의 1.1 ML을 추가합니다. 라파 마이신과 음식에 에탄올 솔루션을 저어. 온도가 약을 추가하기 전에 50 ° C로 감소 있는지 확인하십시오.
  2. 절연 버퍼
    1. 절연 버퍼 [225 mM의 만니톨, 75 mM의 자당, 10 mM의 3- (N <500 ml의 준비/ EM> -morpholino) 프로판 술폰산 (MOPS) 및 1mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 2.5 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민 (BSA)] 물.
    2. 수산화 나트륨을 사용하여 7.2로 pH를 조정한다. 초기 pH는 산성이 될 것입니다.
    3. 용액을 멸균하고 4 ℃에서 보관하는 0.22 ㎛의 공극 크기를 갖는 멸균 필터 저장 병을 사용.
  3. 세척 버퍼
    1. 세척 버퍼 [225 mM의 만니톨, 75 mM의 자당, 10 mM의 KCl을 10 mM 트리스 염산, 5 mM의 KH 2 PO 4] 물 500 mL로 준비합니다.
    2. 수산화 나트륨을 사용하여 7.2로 pH를 조정한다. 초기 pH는 산성이 될 것입니다.
    3. 용액을 멸균하고 4 ℃에서 보관하는 0.22 ㎛의 공극 크기를 갖는 멸균 필터 저장 병을 사용.

초파리 균주 2. 양육

  1. , 개발 과정에서 유충 밀도를 제어 할 문화 병에 부모 25 쌍을 배치하고 48 시간 동안 알을 낳기 할 수 있도록합니다.
    2. <리> 달걀의 밀도를 조절하기 위해 48 시간 후 부모를 제거합니다.
  2. 반복 신흥 F1 자손을 사용하여 2.1 및 2.2 단계, 그래서이 밀도 제어의 두 세대가 달성된다.
  3. 성인을 수집, 이산화탄소 (CO 2)와 성을 분리하여 파리 마취.
    1. 5 PSI의 연속적인 흐름에 높은 압력을 탱크로부터 전달되는 순수 CO 2 싱글 스테이지 조정기를 사용한다. 정전기를 방지하려면 물에 플라스크를 필터링 500 ml의에 이산화탄소를 촉진하기 위해 플라스틱 튜브를 사용합니다.
    2. 플라스크를 밀봉 한 구멍이있는 고무 마개를 사용합니다. CO 2 패드에 플라스크의 측면 구멍을 연결하는 플라스틱 튜브를 사용합니다.
    3. 10 ~ 15 분 이상 더 이상 패드에 파리를 놓습니다. 실험 조건에 배치하기 전에 24 시간 동안 마취에서 복구 할 수 있습니다.
  4. 미토콘드리아 풍부한 분수에 충분한 대사 산물을 생성 샘플 당 300 파리를 사용합니다. 여기에, 여성을 사용하지만, gendeR은 다른 실험에서 다를 수 있습니다. 집에서 만든 1 패 인구 통계학 케이지 (150) 파리를 전송합니다. 유리 병에 플라이 음식을 5 ml에 액세스 할 수 있습니다.
  5. 또 다른 1 패 케이지에 남아있는 150 파리를 전송합니다. 150 개 이상의 파리와 케이지에 너무 많이하지 마십시오.
  6. 실험 조건에 따라 여섯 복제 샘플을 사용합니다. 전체 동물 추출물보다 대사 산물을 얻을 수 있기 때문에, 전체 동물의 1 샘플이 분리 생성 (50) 여성 한 케이지 (으)로 운항하는 항공사 전송합니다. 미토콘드리아 분리에 관해서는, 실험 조건에 따라 여섯 복제 샘플을 사용합니다.
  7. 12 시간 빛과 12 시간의 어둠의주기와 25 ° C에서 장소 케이지.
  8. 음식 품질을 유지하기 위해 음식의 5 ml의 바이알에서 매 2, 3 일 신선 식품을 제공한다.
  9. 십일 음식에 파리를 유지한다. 이 단계는 라파 마이신 치료 7 필요합니다. 다른 치료 또는 조건이 다를 수 있습니다.

미토콘드리아 분획 3. 분리

  1. 덤프로 한 케이지 (150 파리)에서 운항하는 항공사유리 테플론 다운스 균질는 냉장 분리 버퍼 1ml를 가득.
  2. 아래 15 스트로크 유봉 위를 이동하여 균질화. 그대로 미토콘드리아를 유지하기 위해 얼음에 박격포를 유지합니다.
  3. 4 ℃에서 5 분 300 XG에 1.5 ML 튜브와 원심 분리기로 전송 균질.
  4. 미토콘드리아에 대해 풍부하게 4 ℃에서 10 분 동안 6,000 XG에 뜨는 원심 분리기를 가져 가라.
  5. 상층 액은 세포질 부분을 포함 바와 같이, 상층 액을 제거 또는 대체 실험을 위해 사용합니다. 세척 완충액 300 μL에 펠렛을 재현 탁.
  6. 두 번째 케이지 3.5 - 반복 3.1 단계를 반복합니다. 극저온 microcentrifuge 관에서 모두 케이지의 재현 탁 알약을 결합합니다.
  7. 4 ℃에서 10 분 동안 6,000 XG에 원심 분리기.
  8. 뜨는을 취소하고 액체 질소에 펠렛을 플래시 동결.
  9. -80 ° C 이하의 온도에서 미토콘드리아 풍부한 분수를 저장합니다.
    1. 또한, 전체 동물 사전에 대한paration, 극저온 microcentrifuge 관에서 성인을 놓습니다. C 이하의 온도 ° -80에서 액체 질소 저장 성인 병을 플래시 동결.

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결과

프로토콜은 위에서 설명 된 사용하여, 우리는 발산 mtDNAs 7 라파 마이신 약물의 효과를 시험하기 위해 미토콘드리아 분획을 농축 및 전체 동물 추출물에 대사 체 분석을 수행 하였다. 우리는 플라이 음식에 약물을 용해하여 라파 마이신의 200 μM을 전달했다. 파리 10 일 라파 마이신에 노출되었다. 전체 비행 추출물로부터 미토콘드리아 대사 추출물로부터 용매 추출은 표준 방법을 사용하여 가스 크로마토 그래피 질량 분석 (GC / MS) 및 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LC / MS / MS)를 사용하여 수득 하였다.

도 1은 미토콘드리아 분획에서 농축 미토콘드리아의 지표로 막 수송 단백질의 포린 농축을 나타낸다. 포린 단백질은 세포질 분획 탐지했다. 반대로, 튜 불린 단백질을 미...

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토론

이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 1) 풍부한 공간에서 충분히 파리를 양육. 그것은 150 개 이상의 파리 각각 인구 통계학 새장에 너무 많이하지 않는 매우 중요하다; 2) 자주 식품 영양 학적 스트레스 및 경쟁을 방지하기 케이지 음식을 변경하는 단계; 3) 4 ° C에서 모든 샘플을 유지하는 것은 미토콘드리아 부분의 분리시 무결성을 보장합니다. 또한 분리 완충액 세척 완충액, 및 사용 전에 유리 - 테플론 다운스 균질기를 진정 권장한다. 풍부한 미토콘드리아 파벌의 세포질 오염을 줄이기 위해, 단계 3.5에서 미토콘드리아 펠릿을 세척 완충액으로 세척 할 수있다.

풍부한 미토콘드리아 분획에서 대사 산물의 추출은 복제 샘플 (6 복제 / 실험 조건)의 높은 숫자를 필요로한다. 총, 24 케이지는도 1 및 2에 사용된다. 우리는 (S)의 추출을 행하는 것을 권장실험적인 변동성을 감소시키기 위해 같은 날 불가능한 명령어....

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

이 작업은 Adelphi University 교수 개발 보조금 및 EVC에 수여된 NIGMS의 보조금 R15GM113156, NIGMS의 보조금 R01GM067862 및 DMR에 수여된 NIA의 보조금 R01AG027849의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.2% 테고셉트-메틸 4-하이드록시벤조에이VWRAAA14289
에탄올시그마-알드리치792799
만니톨시그마-알드리치M4125
자당시그마-알드리치S9378
3-(N-모르폴리노) 프로판설폰산 (MOPS)시그마-알드리치M1254 
에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)시그마-알드리치38057 
소 혈청 알부민 (BSA)시그마-알드리치5470
KCl시그마-알드리치P9333
트리스 HCl시그마-알드리치RES3098T-B7
KH2PO4Sigma-Aldrich1551139
CO2 패드 마취Tritech ResearchMINJ-DROS-FP
1 L 케이지웹 레스토랑 스토어999RD32
1 L 케이지 뚜껑웹 레스토랑 스토어999LRD
유리 테플론 dounce 균질화기 Fisher ScientificNC9661231
수산화나트륨시그마-알드리치S8045
라파마이신 LC 연구소 R-5000
항포린MitoSciencesMSA03
항알파 튜불린개발 연구 하이브리도마 은행12G10
피어스 BCA 단백질 분석 키트 써모 사이언티픽 23225
CO2 패드Tritech Research, IncMINJ-DROS-FP
필터 플라스크에나스코SB08184M
고무 마개에나스코S08512M
트

참고문헌

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