방법 논문

총 리그닌, 리그닌 단량체, 및 효소 설탕 자료 : 리그 노 셀룰로오스 바이오 매스의 반항의 변화의 높은 처리량 검열

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DOI:

10.3791/53163

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2015년 9월 15일

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1BioEnergy Science Center, National Renewable Energy Laboratory

이 논문에서

요약

식물 세포벽 구조 및 화학적 특성을 평가하여 바이오 연료 및 바이오 재료에 이상적인 공급 원료를 식별합니다. 표준 방법은 대규모 데이터 세트에 적용할 때 제한이 있습니다. 이러한 고처리량 전처리, 효소 당화 및 열분해 분자 빔 질량 분석 방법은 많은 수의 바이오매스 샘플을 비교하여 실험 시간과 비용을 줄입니다.

초록

리그노셀룰로오스 바이오매스를 연료, 화학 물질 및 기타 상품으로 전환하는 것은 재생 불가능한 에너지원의 사용을 줄이기 위한 한 가지 가능한 경로로 연구되었습니다. 다양한 풀 중에서 다운스트림 응용 분야에 대해 원하는 화학적 특성을 가진 식물을 식별하려면 셀룰로오스 및 리그닌 함량 또는 효소 당화 후 단량체 당 방출과 같은 속성을 비교해야 합니다. 표준 분석 방법의 실험 및 데이터 분석 프로토콜은 시간이 많이 소요되어 측정할 수 있는 샘플의 수를 제한할 수 있습니다. 고처리량(HTP) 분석법은 표준 분석법의 단점을 완화하고 사용 가능한 시료를 신속하게 스크리닝하여 원하는 형질을 가진 샘플을 분리할 수 있습니다. 이 연구는 National Renewable Energy Lab에서 사용하는 HTP 설탕 방출 및 열분해 분자 빔 질량 분석 파이프라인을 보여줍니다. 이러한 파이프라인을 통해 수천 개의 공장을 효율적으로 평가하는 동시에 노동력과 소모품을 줄여 실험 시간과 비용을 절감할 수 있었습니다.

서론

비 재생 연료 및 관련 제품 하락의 글로벌 공급으로, 과학자들은 식물 유래 소스 1에서 유사 연료 및 화학 물질을 만드는 데 도전하고있다. 이 작업의 핵심은 식물의 종은 바이오 연료 및 바이오 소재 2,3의 생산에 적합 할 수있는 결정하는 것입니다. 일반적으로 이러한 원료는 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 콘텐츠에 대한 평가; 뿐만 아니라 또는 이후의 효소 당화하지 않고, 열 기계, 및 / 또는 화학적 전처리를 통해 해체 (반항)에 감수성있다. 자세한 분석이 필요 헤미셀룰로오스, 리그닌 및 분획물의 특정 조성물뿐만 아니라 최적의 효소 활성을 결정하기 위해 사용된다. 본질적으로 원하는 상품에 생화학 적 또는 열 화학적 변환을위한 이상적인 특성을 소유하지 않는 식물의 형질 변경은 냄비의 크게 확장 된 소스와 연구자를 제공하고 있습니다ential 원료 4. 작은 샘플 세트에 매우 유용하지만, 화학 플랜트의 특징을 정량화하는 표준 분석 방법은 시료 5-7 수백 또는 수천의 신속한 스크리닝 부적당하다. 본원에 기재된 방법 HTP 신속하고 효율적으로 열 화학적 및 / 또는 효소 분해에 세포벽 들음의 변화를 바이오 매스 변이체 다수을 평가하기 위해 개발되어왔다.

그것은 HTP 스크리닝 분석법은 본원에 기술 된 변환이나 수율을 최대화하도록 설계되지 않았다는 것을 이해하는 것이 중요하다. 목적은 관련 미생물 시료 극한 들음에 상대적인 차이를 결정하는 것이다. 결과적으로, 분석 단계의 많은 목적은 최대 전환율 또는 범위를 획득하는 것 "전형적인"바이오 매스 변환 분석, 다르다. 예를 들어, 저급 전처리 심각도 짧은 효소 가수 분해 시간은 다를 최대화하기 위해 이용된다샘플 사이에 화상 으. 대부분의 경우, 상대적으로 높은 효소 로딩 상당히 결과를 왜곡 할 수있는 효소 활성 실험 변형으로 인한 차이를 감소시키기 위해 사용된다.

식물 세포 벽과 단량체 설탕의 구성을 결정하기위한 신속한 기술은 효소 당화 적외선 등의 진동 분광학과 같은 로봇, 사용자 정의, 열화학 호환 96 웰 플레이트 및 표준 실험 방법 8-11의 수정 및 악기 프로토콜을 (포함 다음의 해방 (IR), 근적외선 (NIR), 또는 라만) 및 핵 자기 공명 (NMR) 12-17. 이 방법은 실험의 감소로 이어지는 높은 셀룰로오스 또는 낮은 리그닌 내용, 또는 가장 높은 포도당, 자일 로스, 에탄올을 산출하기 위해 예상되는 등 이러한 방법은 바이오 매스 및 소모품의 소량을 사용 축소 된 분석을 활성화와 원료를 분리하는 열쇠입니다 비용 (18) 까지. 방법론이 접근법의 또 다른 특징은 다양한 실험 조건이 빠르게 될 수 있도록하며, 동시에 어떤 경우에는 평가. 예를 들어, 전처리 전략 또는 효소 칵테일 다른 다양한 최적 실험 파라미터 빨리 식별되고 사용될 수 있도록, 테스트 될 수있다. 옥수수 여물 9, 포플러 8, 10, 사탕 수수 사탕 수수 (8), 및 스위치 그래스 (8)과 같은 인기있는 원료는 성공적으로 HTP 방법을 사용하여 평가되었다.

총 리그닌과 리그닌 단량체 조성물은 또한 일반적으로 바이오 매스의 특성을 정량화하고 있습니다. 리그닌 함량의 감소는 다당류 (19, 20)의 효소 소화율을 증가시키는 것으로 나타났다. 리그닌 단량체 비율 (자주 syringyl / guaiacyl (S / G) 내용보고)이라는 역할은 아직 조사 중입니다 식물 세포 벽의 해체에서 재생됩니다. 일부 보고서는 지적했다 그 S / G의 감소다른 연구는 반대의 경향 19, 22을 공개하면서 비는 가수 분해 (21) 다음의 증가 포도당 수익률되었다. 리그닌과 단량체를 평가 처리량이 방법은 진동 다변량 분석 결합 분광법 (IR, NIR 및 라만 23-26), 및 열분해 분자 빔 질량 분석법 (pyMBMS) 27, 28을 포함한다.

매스 HTP 스크리닝 방법을 개발하는 경우, 여러 일체 고려 유념 할 필요가있다. 하나의 중요한 양상은 방법의 복잡성이다. 기술에 필요한 기술 수​​준은 무엇인가? 계량 화학 분석, 예를 들어, 구성, 평가 및 예측 모델을 유지하기위한 특별한 기술을 필요로한다. 표준 방법은 바람직하지 않은 준비 또는 데이터 분석 단계를 전시 또는 독성 시약을 사용한다. 모델의 개발은 새로운 데이터 모델의 견고성을 높이기 위해 시간 동안 모델에 통합 진행 과정이다. 또 다른 consideration은 비용을 절감하고 제안 된 고 처리량 방법의 실험적 분석 시간을 감소시켰다. 상기 방법은 상당히 빠르게하지만, 매우 고가 인 경우가 많은 실험실 채택위한 가능한 방법이 될 수 없다. 이 원고에 도시 된 방법은 스루풋 성능들을 증폭하도록 수정 표준화 기술의 변형이다. 이러한 프로토콜은 정량적 예측 모델의 개발을 필요없이 관심있는 미생물의 특성을 측정한다. 표준 모델을 개발하는 데 사용되는 분석과 강한 상관 관계를 보이는 동안이 예측 방법부터이 기술의 핵심 속성이다, 실제로 샘플에 대한 관심의 양을 측정하는만큼 정확하지 않습니다. 기본적으로 표준 벤치 규모 분석 방법의 버전을 축소되어 사용되는 방법 반면, 정확도와 정밀도는 속도와 처리량을 상장되어 거래되고있다. 대부분,이 결과는 작은 볼륨 피펫 및 무게에 더 높은 오류로 인해; 뿐만 아니라 증가 된 에스샘플 크기와 충분한 이질성이 감소된다. 큰 샘플 세트가 상영과 비교 될 수 있지만 별도의 캠페인 사이의 벤치 규모의 결과 비교를 할 때, 큰주의를 기울여야한다.

대부분의 시간 소모 단계 바이오 매스의 물리적 조작을 포함한다. 연삭 샘플은 샘플 사이의 밀을 청소 포함 샘플 당 몇 분을 취할 수있다. 수동, 하역, 청소 호퍼로드 및 작성, 차 가방 및 샘플 가방을 비우는 것은 매우 노동 집약적이다. 각 단계는 분 이상 걸릴 수 있지만, 샘플의 일을 수천 몇 시간 또는 며칠이 걸릴 수 있습니다. 로봇은 약 3 ~ 4 시간 또는 6 -1 플레이트 하루 8 로봇 바이오 매스와 일반적인 원자로 판을로드 할 수 있습니다 -1. 이러한 상황은 물론 시험 될 형 바이오 매스의 양으로 사용 정밀도 파라미터들에 의존한다. 물과 반응 판을 작성, 산을 희석 또는 효소 신속하게 액체 처리 로봇을 사용하여 수행됩니다. 피접시 스택 (1-20 반응 판)의 재치료는 어셈블리, 냉각시 1 ~ 3 시간 소요되며, 분해가 포함되어 있습니다. 효소 가수 분해 3 일 걸리며 당 분석 결과 분석을 완료하고 읽을 준비 시간 약 1 시간 플러스 반응기 접시 당 10 분을 필요로한다. 설정 전처리 및 분석 일의 주간 스케줄은 지속적으로 주당 800 ~ 1,000 샘플을 분석의 인간의 구성 요소에 대한 이상한 시간과 주말 노력을 최소화, 합리적인 작업 일정을 수용하고 처리 할 수​​ 있습니다. 최대 처리량이 많은 하드웨어 (로봇, 원자로 판 등), 얼마나 많은 "소프트웨어"(즉, 인력)이 수동 작업을 할 수 있습니다 주로하는 방법, 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 실제 상한은 2,500 ~ 3,000 샘플 / 주이다 그러나, 출력은 칠일 - 주 작업과 다수의 학생 인턴 및 기술자를 필요로한다. 비교하여, HPLC에 의해 3,000 샘플 SAM의 약 12​​5일을 필요PLE 분석 플러스 수동으로 분석하기 전에 원자로 및 필터링 샘플로 샘플 무게의 추가 노동.

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프로토콜

포도당과 크 실리 톨 수익률의 1. 높은 처리량 결정은 효소 당화 9, 29에 따라

  1. 샘플 준비 (디 - 녹말, 분쇄, 추출, 전처리)
    1. 와일리 밀, 이러한 입자는 20 메쉬를 통과하는 것이 (850 μm의) 스크린을 사용하여 각 시료의 바이오 매스의 적어도 300 mg의 분쇄. 정전기 방지 지퍼 가기 가방에 이동 (일반적으로 바코드) 및 바코드 데이터베이스에 기록 샘플 정보를 제공합니다.
    2. 조심스럽게 차 가방 (잉크 또는 마커를 사용하지 않는, 연필)을 방지하기 위해 바이오 매스를 통해 끝을 접어해야되고, 티 백을 롤 번호가 약 250 mg의 또는 정전기 방지 가방에서 지상 바이오 매스의 더 추가 드 녹말 추출하는 동안 손실.
    3. 주석 도금 구리 와이어를 사용하여 폐쇄 티백을 싸서. 각각의 바코드 샘플에 대한 티백 번호를 기록한다.
    4. 상업 효소 (일반적으로, 0.25 % (v / v)의 글루코 아밀라제 (~ 1600 AGU / L)과에서 드 녹말 효소 솔루션을 준비1.5 % (v / v)의 알파 - 아밀라제 0.1 M 나트륨 아세테이트 (~ 2,900 KNU-S / L) (PH 5.0)). 대량의 바이오 매스 g 당 16 mL를 120 티백 샘플 당 500 mL로 준비합니다. 주 : 접지 매스로부터 전분을 제거 할 수있는 하중은 효소 로딩 및 비율의 범위로 소화 한 후 전분을위한 시험함으로써 경험적으로 결정되어야한다.
    5. 플라스틱 용기에 일괄 접지 매스 1g 당 탈 녹말 효소 용액 16 ml를 추가. 일괄 드 녹말 프로토콜의 경우, 버퍼 효소 용액 500 ml의 120 티 백을 추가합니다.
    6. 가능한 전분을 제거하기 위해 120 rpm으로, 24 (± 4) 시간 동안 55 ℃에서 진탕에 품어.
    7. 디 녹말 인큐베이션 후 헹구고 30 분 동안 탈 이온수로 여러 리터 매스 소크. 캐스케이드에 뜨거운 액체 에탄올을 일으키는 원인이되는 솔루션의 수준에 갑자기 폭력적인 상승을 초래할 수있는 솔루션에 가스 거품의 범핑 (형성 될 수 있습니다 버퍼 염을 제거하려면이 과정을 두 개의 추가 번 반복추출 동안 반응 용기) 중.
    8. 드 먹인 바이오 매스의 철저한 세척에 따라, 추출을위한 속 슬렛 컬럼에 티 백을 배치합니다. 어떤 골무는이 단계에서 필요하지 않습니다.
    9. 95 % 에탄올을 사용하여, 속 슬렛 역류를 설정하고 24 시간 동안 샘플을 추출합니다.
    10. 속 슬렛 반응기에서 티 백을 제거하고 평평한 쟁반에 하나의 층에 확산.
    11. 샘플 흄 후드에서 실온에서 밤새 건조되도록.
    12. 티 백을 풀다 원래 바코드 정전기 방지 가방에 건조 된 바이오 매스를 반환합니다.
      주 : 정전기 잡화 취급 특성, 바이오 매스에 정전기를 감소시키는 개선에 효율적이다. 다른 저장 옵션을 사용하는 경우, 추가 매스 인해 저장 용기의 측면에 집착 매스에 필요할 수있다.
    13. 바코드 호퍼에 건조 된 바이오 매스의 50 mg의 이동 (더 재료를 사용하여 정확한 분배를 위해 더 낫다). 에스정전기 방지 가방 및 수신 호퍼의 바코드는 정확한 샘플 추적을 보장 할 수 있습니다.
    14. 고체가 랙에 샘플의 순서에주의를 기울이고, 로봇의 무게 위에로드 호퍼. 사용 된 플레이트의 수에 따라 분배 프로토콜을 모든 샘플을 포함하고 선택 충분히 반응기 판을로드.
    15. 로봇 부식 방지 스테인레스 스틸 96 웰 플레이트에 (0.3 mg을 ±) 건조 된 시료의 5 mg의 무게. 지역화 된 변형을 최소화하기 위해 분산 판 주위의 각 샘플을 3 회 반복 달아.
    16. 분석 성능을 추적하기 위해 잘 특성화 바이오 매스 표준 물질의 8 제어 바이오 매스 샘플을 포함합니다. 여러 접시를 들어, 여러 표준 바이오 매스 호퍼의 사용은 반복 분배주기를 통해 호퍼에 체질에 의한 입자 크기 드리프트를 최소화 할 수 있습니다.
      참고 : 각 플레이트에서 3 복제, 탈 이온수와 효소로 구성된 4 공백, 8 contro 24 샘플이 있어야한다LS, 이전에있어서 표준을 사용하는 바이오 매스. 판의 4 모서리의 각의 3 코너 우물은 설탕 표준을 위해 예약되어 있습니다.
    17. 잘못된 바이오 매스 입자 빈 설탕 표준 우물을 확인하고있는 경우 제거합니다.
    18. 각 웰에 탈 이온수 250 μl를 추가하고, 실리콘 접착제 백업 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 테이프로 번호판을 봉인.
    19. 1/8 "납땜 인두 팁을 사용하여, 각각의 판에 대한 각각의 스팀 포트 (117 총)에 PTFE 테이프를 관통. 가이드로 밀폐 된 원자로 접시에 쌓여 빈 접시를 사용하여 PTFE를 필름의 이동을 제한 할 수 있습니다.
    20. 단단히 상단과 스택의 바닥에 접시와 빈 판 사이 0.031 "두께의 유리 강화 PTFE 가스켓 (스팀 포트 구멍 천공)으로 판을 클램프. 17.5 분, 또는 원하는 심각도에 따라 다른 온도 / 시간 조합에 대해 180 ° C로 설정 증기 반응기를 사용하여 샘​​플 전처리.
    21. 50 ℃로 냉각 원자로 판; C 탈 이온수로 홍수.
  2. 효소 당화
    1. 1.0 M 시트르산 나트륨, pH 5.0으로 8 % (v / v)의 효소 용액 이루어진 당화 효소 용액을 제조 하였다. 원자로 판 당 5 mL를 준비합니다. 주 : 특정 효소 스톡 용액의 활성 및 단백질 함량에 기초하여 결정될 필요 희석한다.
    2. 플레이트가 멋진 경우, 20 분 동안 1,500 XG에서 스윙 버킷 로터에서 그들을 원심 분리기. 필름을 밀봉 제거합니다. 참고 :이 판은 무겁와 원심 분리기 사양의 호환성을 확인해야합니다.
    3. 각 웰 (G 바이오 매스 당 70 mg의 효소)에 8 % 효소 원액의 40 μl를 추가합니다.
    4. 새로운 PTFE 테이프로 봉인. 자기 플레이트 클램프로 밀봉 플레이트를 놓습니다.
    5. 조심스럽게 반전에 의해 샘플 (이상 15 회)를 혼합하고, 70 시간 동안 50 ℃에서 배양.
    6. 당화가 체결되면, 반전에 의해 믹스 1,500 X에서 번호판을 원심 분리20 분 동안 G.
  3. 설탕 분석
    1. 6 글루코스 0.014 M 시트르산 완충액 크실 로스 결합 검정 표준 0 내지 0.750 ㎎ / ㎖ 범위 (PH 5.0)의 세트 준비 (0, 0.2, 0.3, 0.45, 0.65, 및 0.75 mg의 / ㎖ 권장) 및 0-0.600 ㎎ / ㎖ (0, 0.1, 0.2, 0.35, ml의 권장 0.45, 0.6 밀리그램 /)는 각각 포도당과 자일 로스, 대한.
    2. 키트의 지침에 따라 포도당 산화 효소 / 퍼 옥시 다제 (GOPOD) 및 자일 로스 탈수소 효소 (XDH) 시약을 준비합니다.
    3. 피펫을 사용하여, 반응 플레이트의 모서리 우물 (총 12 우물)에 인접한 4 코너 우물과 가장자리의 우물에서 액체의 200 μl를 제거합니다.
    4. 피펫을 사용하여, 96- 웰 평면 바닥 폴리스티렌 희석 플레이트의 각 웰에 탈 이온수 180 μL 분주. (12) 당 표준 및 코너 우물에 물을 추가하지 마십시오 (96 채널 헤드를 사용하는 경우 그 팁을 제거).
    5. 피펫을 사용하여, PL 포도당 분석의 각 웰에 180 ㎕를 GOPOD 시약을 분배먹었다.
    6. 피펫을 사용하여, 글루코오스 분석 플레이트의 각 웰에 180 μL의 XDH 시약 분주.
    7. 피펫을 이용하여 희석 플레이트 96 웰 반응 플레이트로부터 20 μL 분취 분해물 옮긴다. 우물의 상부에서 피펫은 바이오 매스 고체와 코너 우물에 잔류 액을 방지 할 수 있습니다. 적어도 10 사이클 저작하여 혼합한다.
    8. 피펫을 사용하여 희석 플레이트의 모서리 우물, 중복, 설탕 표준의 110 μl를 전송합니다.
    9. 피펫을 사용하여 포도당과 자일 로스 분석 플레이트에 희석 플레이트에서 20 μL 씩 전송합니다. 분쇄하여 섞는다.
    10. 30 분 동안 실온에서 글루코오스 및 글루코오스 분석 판을 배양한다. 주의 깊게 읽기 전에 어떤 표면의 거품을 휴식. 간략 판의 표면에 전달되는 열 총은 잘 작동합니다.
    11. 자외선 / 가시 96- 웰 플레이트 판독기를 사용하여 510 nm의 파장을 측정하고 설정 시약 블랭크에 대해 흡광도를 기록한다.이 측정은 글루코오스 농도에 비례 퀴논 이민의 형성을 모니터링한다. 글루코스 농도는 1.3.1에서 제조 검정 표준에 기초하여 검량선으로부터 계산된다.
    12. 자외선 / 가시 96- 웰 플레이트 판독기를 사용하여 340 nm의 파장을 측정하고 설정 흡광도를 기록한다. 이 측정은 글루코오스 농도에 비례하는 NADH의 NAD + 환원을 모니터링한다. 글루코오스 농도는 1.3.1에서 제조 검정 표준에 기초 검량선으로부터 계산된다.

pyMBMS 28 사용하여 총 리그닌과 리그닌 단량체 내용의 2. 높은 처리량 결정

  1. 샘플 준비
    1. 분쇄 및 단계 1.1.1 및 1.1.6-1.1.8에서 설명한 방법을 이용하여 바이오 매스를 추출 하였다. 이 연마하고 실험적인 컨트롤을 사용하여 표준 집합의 추출이 포함되어 있습니다.
      참고 : pyMBMS의 지표 성과를ements하지 입도 의존하므로 만 pyMBMS 프로토콜을 사용하는 경우, 미생물 제제 샘플 <샘플 홀더에 4mm 맞게 있도록 수행되어야한다.
    2. 약 4 mg의 작은 주걱을 사용하여 분배 자동 샘플러 위해 설계된 80 μL 스테인레스 컵에 준비된 바이오 매스 (3~5 mg을 선호).
    3. 분석 된 시료의 적어도 10 %는 국립 표준 기술 연구소에서 사용할 수있는 등의 관리 기준 있는지 확인하십시오 (사탕 수수 사탕 수수-8491, 포플러-8492, 소나무 - 8493 또는 밀 밀짚 8494). 표준은 이미 표준 방법을 사용하여 특성화되었다 분석 될 샘플 유사한 어떤 종류 일 수있다.
    4. 무작위로 인해 시간이 지남에 따라 가능한 분광계 드리프트에 편견을 방지하기 위해 핀셋을 사용하여 자동 샘플러 컵에 샘플을로드합니다. 주의 : 샘플의 전형적인 랜덤는 다시 랜덤이어서 일단 모든 샘플의 측정 값을 포함 할 것이다중복 측정 용 샘플의 순서. 무작위 프로그램은 온라인으로 사용할 수 있습니다.
    5. 표준 홀 펀치를 사용하여 수동으로 바인더와, 입력 A / D 유리 섬유 시트로부터 유리 필터 디스크를 생성한다. 핀셋으로 둥근 유리 섬유 필터를 잡고 샘플 컵에 그것을 센터, 실험 기간 동안 각 컵에 재료를 한정하기 위해 3.5 mm 육각 렌치를 사용하여 샘​​플로 밀어 넣습니다.
  2. 경음악 프로토콜
    1. 실험 샘플에 대해 존재할 수있는 화합물의 전체 범위에서 피크 강도를 갖는 공지 된 표준을 이용하여 질량 분석을 교정. 일반적으로 바이오 매스 샘플은, 루오 로트리 (PFTBA)를 사용합니다.
    2. 가스 유량계를 사용하여 0.9 L / 분의 헬륨 캐리어 가스 유량을 설정한다.
    3. 500 ℃의 열분해 온도 및 오토 샘플러 소프트웨어를 사용하여 350 ° C로 인터페이스 온도로 자동 샘플러로를 설정한다. 참고 : 1/8 "스테인레스 스틸 가열질량 분석기로 자동 샘플러를 접속 가열 테이프에 싸서 전달 라인은 250 ℃에서의 열 제어를 이용하여 제어된다.
    4. 질량 분석기에 대한 데이터 수집을 시작하고 배경 스펙트럼 수집을위한 충분한 데이터를 얻기 위해 최소 60 초를 기다립니다.
    5. 2.2.2의 사양을 자동 자동 샘플러 방법을 시작합니다. 참고 : 자동 샘플러 자동 샘플러로에 개별적으로 각각의 샘플을 삭제합니다. 총 데이터 획득 시간은 약 1.5 분이며; 그러나, 일반적인 4 mg의 시료의 열분해는 30 초 후에 완료됩니다.
    6. 0.5 초 스캔 속도로 질량 분석 소프트웨어를 사용하여 각 샘플의 기록 총 이온 함유량 (TIC). M / Z 30-450 사이의 기록 강도.
      참고 : 일반적인 바이오 매스 화합물은 17 eV의에서 부드러운 이온화를 사용합니다. 장비는 1,000 M / Z 1에서 더 큰 간격을 기록 할 수 있습니다; 그러나, 스캔 속도는 컴퓨터의 CPU 파워에 의해 제한됩니다.
    7. 엄마를 사용하여 스펙트럼에서 배경을 제거nual 소프트웨어의 기능을 향상시킬 수 있습니다. 주 : 데이터 수집의 시작에서 초기의 주사 부 (60)는 배경 평균 값을 계산하는데 사용된다. 이 평균 배경 스펙트럼은 질량 분석기 소프트웨어에서 자동 실험 샘플 스펙트럼으로부터 제거된다.
    8. 데이터베이스 프로그램에 각 샘플에 대한 분광 데이터를 포함하는 질량 분석기 소프트웨어에 의해 생성 된 단일 열 텍스트 파일을 가져 오기 및 하나의 데이터베이스로 모든 샘플을 결합한다. 스프레드 시트에 적용 가능한 메타 데이터를 추가합니다. 통계 소프트웨어 패키지로 형식의 데이터 (스프레드 시트 / CSV 파일을) 가져 오기 및 열분해 샘플 질량의 변화를 설명 할 수있는 스펙트럼을 정상화 의미한다.
    9. 측정에 사용되는 복제 표준 샘플의 그룹을 분석 스펙트럼 데이터를 이용하여 주성분 분석 (PCA)을 수행하는 통계 소프트웨어 패키지를 사용하여,뿐만 아니라 화학적 분류에 통합되는 피크 평가할부하의 화합물은 28 플롯.
      PCA는 그룹 그들의​​ 스펙트럼의 유사성을 기준으로 샘플을하고, 표준 검사로 인해 운전 중 기기의 드리프트에 실험 오차를 측정 할 수 있습니다 :합니다.
    10. 리그닌 syringyl (S) / guaiacyl (G)의 비율을 계산하기 위해, S 피크의 면적 합계 (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208, 및 210) G 피크의 합으로 나눈 124, 137, 138, 150, 164, 178에서.
    11. 총 리그닌 함량을 계산 m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194, 및 210 리그닌 피크를 합산한다.
    12. 이러한 Klason 리그닌으로, 총 리그닌을 추정하기위한 표준 방법에 pyMBMS 측정을 스케일링하는 보정 팩터를 계산한다. pyMBMS를 사용하여 해당 표준 시료에 대한 측정 된 총 리그닌 함량에 의해 개별 표준의 Klason 리그닌 값을 나눈다.
    13. 데이터 세트에있는 모든 종 등이 보정 계수를 적용한다. 분석 바이오 매스의 각 유형에 대해이 단계를 반복합니다. NOTE : 보정 계수가 크게 분석 바이오 매스의 S / G에 기초하여 변할 수있다.

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결과

열 화학적 전처리 및 후속 당화 효소의 결합 된 효과는 분석의 단부에 해제 포도당과 자일 로스의 질량의 함수로서 측정된다. 결과는 바이오 매스의 g 당 발표 포도당과 자일 로스의 밀리그램의 관점에서보고됩니다. 이것은 일반적으로 출발 물질의 조성 분석에 기초하여 이론적 퍼센트 수율로보고 벤치 스케일 분석에서보고 된 데이터에 대조적이다. 아직 주 당 샘플 수천 성분 분석을 수행하는 것이 실용적이지 않다 같이, 데이터는 가장 질량 기준 변환 수치로보고된다. 비교가 너무 많이 변하지 않는 밀접하게 관련된 미생물의 시료와 시료 사이에 조성 된 바와 같이이 긴 적당한 샘플 평가를 허용한다.

분석의 주요 목표는 결합 열화학 / enzym에 식물 세포벽의 저항의 상대적인 차이를 평가하는 것이다개별 변형의 범위에 걸쳐 ATIC 당화. 이 분석법은 당화 사용 조건 중 하나를 최적화하는 것을 시도하지 않는 주목할 가치가있다. 사실, 전처리 조건은 이론적 심각도의 50 % 내지 70 %의 최종 환...

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토론

다음 높은 처리량 스크리닝 실험을 실시 할 때 정확하고 재현성있는 데이터를 획득하기위한 키 샘플 준비 단계는 다음과 같다

설탕 자료 분석 :

일반적으로, 샘플은 수십에서 한 번에 수천에 이르기까지 많은 준비되어있다. 각 주요 단계는 전형적으로 샘플 제제 사이의 편차를 최소화하기 위해 전진에 앞서 모든 샘플에 대해 수행된다. 디 녹말 원래 프로토콜의 일부가 아닌이고 어떤 경우 생략 될 수있다. 목재 코어 샘플 및 senesced 초본 자료는 따라서 변동성을 줄이기 위해 해제 녹말 필요로하지 않는, 전분에서 지속적으로 낮은합니다. 전분은 중요한 관심사이다; 그러나, 특히 수확 몇 시간에 걸쳐 발생하는 큰 샘플 세트 녹색 조직 식물의 샘플 세트에. 전분 수준이 낮 시간 동안 상승과 어둠 중에 고갈됨에 따라, 전분 수준의 이상 크게 달라질 수 있습니다전분에서 everal 시간과 포도당은 셀룰로오스에서 포도당에서 구별 따라서, 높은 ...

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공개 사항

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감사의 글

저자는 이 원고에서 논의된 두 개의 고처리량 파이프라인에 대한 바이오매스 샘플 준비와 관련하여 최고의 통찰력을 제공한 인턴 Evelyn Von Neida에게 감사를 표합니다. 이 연구와 원고의 개발에 대한 지원은 BioEnergy Science Center에서 제공했습니다. 바이오 에너지 과학 센터(BioEnergy Science Center)는 미국 에너지부 바이오 에너지 연구 센터로, DOE 과학국(DOE Office of Science)의 생물 및 환경 연구실(Office of Biological and Environmental Research)에서 지원합니다. NREL(National Renewable Energy Laboratory)은 미국 DOE 에너지 효율 및 재생 에너지 사무국의 국립 연구소로, Alliance for Sustainable Energy, LLC에서 DOE를 위해 운영합니다. 이 작업은 계약 번호에 따라 미국 에너지부의 지원을 받았습니다. DE-AC36-08-GO28308 미국 국립재생에너지연구소(National Renewable Energy Laboratory)

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Biomek FX 자동화 워크스테이션Beckman CoulterBiomek FX자동 액체 처리기
Wiley millThomas Scientific3375E15 (모델 4) 또는 3383L20 (Mini-mill)
정전기 방지 백Minigrip*MGST4P025032.5x3", 여러 공급업체 사용 가능
주석 코팅 구리선McMaster-Carr8871K840.016" 직경, 벤드-앤-스테이 와이어
티백Herbcopress n' brew 티백3.5x5 인치
글루코-아밀라아제NovozymesSpirizyme Fuel 
알파 아밀라아제Novozymes,Liquozyme, SC, DS
아세트산 나트륨, 삼수화물,모든 화학 물질 공급업체, 시약 등급
아세트산모든 화학 물질 공급시약 등급
시약 등급 : 190 증명 (95 %), 에탄올모든 화학 물질 공급 업체시약 등급
호퍼,Freeslate
96- well C-276 Hastelloy 플레이트Aspen Machining(콜로라도주 라파예트)N/A(맞춤형)
1/8" 납땜 인두 팁Sears
실리콘 접착식 백업 테프론 테이프3M51803" 너비(36야드 롤)
효소 용액NovozymesCellic CTec2
구연산 일수화물모든 화학 공급업체
trisodium citrate dihydrate모든 화학 물질 공급 업체
, 일회용, 폴리스티렌 96-웰 플레이트Greiner Bio-One655101또는 이와 동등한 것; 여러 공급 업체가 포도
oxidase/peroxidase를MegazymeK-GlucMegazyme D-포도당 분석 키트
크실로스 탈수소효소MegazymeK-XyloseMegazyme D-xylose 분석 키트
포도당 표준 용액MegazymeK-GlucMegazyme D-포도당 분석 키트
자일로스 표준 용액MegazymeK-XyloseMegazyme D-xylose 분석 키트
스테인리스강 샘플 컵Frontier LaboratoriesPY1-EC80F
유리 섬유 시트Pall662278x10" 시트; 표준 구멍 펀치로 구멍을 뚫은
원형 사탕수수 Bagasse 전체 바이오매스 공급 원료NIST8491
동부 미루나무(포플러) 전체 바이오매스 공급 원료NIST8492
Monterey Pine 전체 바이오매스 공급 원료NIST8493
밀 밀짚 전체 바이오매스 공급 원료NIST8494
, , , , 업체 , , ,, 당 사용할 수 있음;

참고문헌

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