세균 인공 염색체 : RNA 바이러스 양성 가닥의 연구에 대한 기능 유전체학 도구

요약

여기에서는 일본뇌염 바이러스의 양성 가닥 게놈 RNA의 전체 길이 cDNA를 포함하는 감염성 박테리아 인공 염색체를 만들기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 다른 양성 가닥 RNA 바이러스의 기능적 cDNA를 구성하는 데 사용할 수 있어 바이러스 생물학 연구를 위한 강력한 게놈 도구입니다.

초록

복제된 cDNA에서 감염성 바이러스를 완전히 구출하는 방법인 역유전학은 게놈이 세포 mRNA와 동일한 극성을 가진 양성 가닥 RNA 바이러스 분야에 혁명을 일으켰습니다. cDNA 기반 역유전학 시스템은 바이러스 게놈 RNA를 직접 조작할 수 있는 독창적인 방법으로, 바이러스 복제 및 발병기전에서 바이러스 RNA 요소와 유전자 산물 모두에 대한 분자 및 유전 연구를 위한 재조합 바이러스를 생성합니다. 또한 외래 유전자 전달을 위해 유전적으로 정의된 백신과 바이러스 벡터를 개발할 수 있는 귀중한 플랫폼을 제공합니다. 그러나 일본뇌염 바이러스(JEV)와 같은 많은 양성 가닥 RNA 바이러스의 경우 복제된 cDNA가 불안정하여 기능적 cDNA의 구성 및 전파에 큰 장애물이 됩니다. 본 보고서에서는 바이러스 RNA 분리, cDNA 합성, cDNA 서브클로닝 및 변형, 전장 cDNA 조립, cDNA 선형화, 시험관 내 등의 일반적인 실험 절차를 사용하여 유전적으로 안정적인 전장 감염성 JEV cDNA를 박테리아 인공 염색체(BAC)로 생성 및 증폭하는 데 있어 전략적 고려 사항을 설명합니다. RNA 합성 및 바이러스 회수. 이 프로토콜은 다양한 양성 가닥 RNA 바이러스, 특히 >10kb 길이의 게놈을 BAC 벡터로 복제하는 데 적용할 수 있는 일반적인 방법론을 제공하며, BAC 벡터에서 감염성 RNA를 박테리오파지 RNA 중합효소로 in vitro에서 전사할 수 있습니다.

서론

RNA 바이러스 학자를 들어, 1970 년대 후반에, 재조합 DNA 기술의 출현은 가능한 다음 RNA 바이러스의 유전 적 조작을위한 박테리아 플라스미드로 전파 될 수의 cDNA 클론 내로 바이러스 RNA 게놈을 변환했다. ⁽¹⁾ 제 RNA 바이러스로 복제 분자는 박테리오파지 Qβ, 대장균 감염 포지티브 - 가닥 RNA 바이러스이다. E.에 도입 할 때 Qβ 게놈 RNA의 전체 cDNA의 복사본을 포함하는 플라스미드 전염성 Qβ 파지 초래했다 대장균. ⁽²⁾ 그 후 곧,이 기술은, 소아마비 바이러스에인가 인간과 동물의 포지티브 - 가닥 RNA 바이러스 하였다. 폴리오 바이러스 게놈 RNA의 전장 cDNA 베어링 플라스미드 감염성 포유 동물 세포 내로 형질 감염성 비리 온을 생성 할 때 ^3, 클로닝 된 cDNA는 바이러스 RNA 복제를 개시하는 세포 내에서 전사되어야이 "DNA 발사"접근 방식이다.;전사가 개시되는 방법과 증명서가 올바른 바이러스 서열에 어떻게 처리되는지 그러나 불분명하다. 이러한 문제는 다른 "RNA 발사"의 개발을 주도하고있다 접근법, 바이러스 RNA 게놈의 완전한 cDNA의 사본 E. 인식 프로모터 하에서 복제된다 숙주 세포 내로 도입 될 때 완전한 바이러스 복제 사이클을 겪는다 정의 5 '및 3'말단을 가진 시험관에서 합성 RNA를, 생산 용 대장균 또는 파아지 RNA 폴리머 라제.이 방식 제 성공 브롬 모자이크 바이러스에 대해보고 된 ^4,5- , ^6,7- 식물의 양 가닥 RNA 바이러스. 그 후, RNA 발사 접근법 caliciviruses, alphaviruses, 플라 비 바이러스, arteriviruses 및 코로나 포함한 양성 가닥 RNA 바이러스의 광범위한 개발되었다. ^1,4,5,8-

DNA- 및 모두에서, FUL의 구성을 역 유전학 시스템 RNA 발사~ 10 L - 길이의 cDNA 클론은 감염성 DNA 또는 포지티브 - 가닥 RNA 바이러스의 RNA를 생성하는 키이지만 바이러스 게놈 크기가 증가 상당한 기술적 도전. 특히 ^9-17의 큰 RNA 게놈진다 -32 KB는 전신 기능의 cDNA 클로닝에 세 가지 주요 장애물을 제시한다. RT-PCR의 정확도는 바이러스 성 RNA의 길이에 반비례하므로 ¹⁸ 제 어려움 복사 충실한 cDNA를 합성한다. 긴 RNA 분자는 E. 불안정 플라스미드에서의 cDNA 단편을 제조 할 수있는 예기치 않은 서열을 포함 할 가능성이 있기 때문에 두번째 장애물은 잠재적으로 독성 서열의 존재이다 대장균. 이> 10 KB의 바이러스 cDNA를 삽입을 수용 할 수있는 클로닝 벡터를 발견하기 어렵 기 때문에 셋째, 가장 중요한 이슈는, 적당한 벡터의 유용성이다. 지난 3 년 동안,이 장벽은 효소 학, 방법론, 여러 진보에 의해 극복되었다D의 vectorology. 이들 중 ^1,4,5,8-는 가장 유망한 혁신 개발은 큰 긍정적 인 가닥 RNA 바이러스 등 전염성 세균 인공 염색체 (BAC에)의 복제입니다. BAC 벡터는 E.에 기초하여 저 복사 클로닝 플라스미드 (1-2 복사 / 셀) 인 DNA의 평균 삽입 크기를 갖는 대장균 인자 불임, ~ ^19-21 120-350 KB DNA 단편은 일반 클로닝 벡터로 클로닝에 유사한 방식으로 BAC 벡터에 삽입된다.; 결과 BAC 클론 E. 많은 세대에 걸쳐 안정적 대장균. 현재까지 ^{22, 23는,} BAC 기술은 즉 세 가지 긍정적 인 가닥 RNA 바이러스 가족, 플라 비비 리다, ^{24 ~ 29} Arteriviridae, ³⁰ Coronaviridae의> 10 명에 대한 감염의 cDNA 클론을 만드는 데 사용되었다. ^{9,16,17 , 31, 32}

예를 들어 일본 뇌염 바이러스 (JEV)를 사용하여, 본 연구는 일 수 상세한 절차를보고양성 가닥 RNA 바이러스의 다양한 유전자 안정된 전장 감염성 BAC를 구성하는데 사용된다. 발생 JEV가, JEV 감염이 심한 종종 치명적인 신경 질환 일본 뇌염이 발생할 수 있습니다 인간에서 동물 매개 모기 벡터에 의해 조류, 돼지, 그리고 다른 척추 동물의 호스트 사이의 자연에서 전송 플라 비 바이러스 ^{(33). (34, 35)입니다} (JE), ⁽³⁶⁾ ~ 50,000-175,000 임상 경우의 예상 연간 발병률 아시아와 서태평양, ^{37, 38의} 부품. ^{39, 40} JEV의 게놈 ~ 11 KB, 단일 가닥 긍정적 인 감지 RNA 분자이며 구성 5 '및 3'두 개의 비 코딩 영역 (의 NCR)에 의해 형벌 단일 오픈 리딩 프레임 (ORF)이 종료된다. ^{41, 42} ORF가 지정된 10 개별 단백질을 생성하는 호스트 및 바이러스 성 단백질 분해 효소에 의해 분해되는 폴리를 인코딩 C, PRM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5 또한 C- 말단 방향에 N-있다. ^34,43,44, 전자NS1 (NS1 ')의 xtended 양식 코돈 NS2A의 8-9에 의해 -1 리보솜 frameshifting 표현된다. 이들 11 단백질의 ^{45, 46,} 세 개의 구조 단백질 (C, PRM, E는) 감염의 형성에 필수적인 비리, ^{47, 48} 및 나머지 8 비 구조 단백질 (NS5에 NS1 및 NS1 ')는 바이러스 성 RNA 복제, ^49-51 입자 어셈블리, ^52-56 및 선천성 면역 회피에 대한 중요하다. ^57-59 모두 5'3 '의 NCR은 기본 시퀀스 및 바이러스 성 RNA 복제를 조절에 중요한 형태의 RNA 1 차 / 2 차 구조, ^60-62을 보존 포함. ^{63, 64}

이 프로토콜은 SA ₍₁₄₎ -14-2 전체 길이 JEV의 감염 혈중 알코올 농도를 생성하기위한 도구, 방법 및 전략을 설명합니다. ^(28)이 기능 BAC 클론은 발기인에 포함되어 JEV 게놈 RNA의 전체 cDNA를 복사, ^(65)을 포함 SP6의 RNA 중합 효소에 대한 상향바이러스의 5'- 말단 및 체외 런 - 오프 전사 바이러스 3'- 말단의 하류 고유 XbaI으로 I 제한 사이트. 이 기술은 BAC 양성 가닥 RNA 바이러스의 배열에 대해 완전히 기능 분자의 cDNA 클론을 구축에 적용 할 수있다.

프로토콜

참고 :도 1은 BAC로서 전체 길이의 cDNA 감염성 JEV의 구성을위한 전략을 제시 ²⁸ 표 1은이 프로토콜에서 사용 된 올리고 뉴클레오티드의리스트를 제공한다 ^(28)..

1. 세포 배양 상층 액에서 JEV 입자에서 바이러스 성 RNA를 추출

1. JEV SA ₁₄ -14-2, 바이오 레벨 2 봉쇄 필요 JE 라이브 백신 바이러스를 함유하는 세포 배양 배지와 함께 시작한다.
   주 : 바이러스 역가가 약 1-3 × ¹⁰⁶ 플라크 형성 단위 / ㎖이다.
2. 이전 JEV SA ₍₁₄₎ -14-2 작업에 모든 표준 미생물 학적 방법, 안전 장비, 실험실 시설에 필요한 바이오 안전성 교육을 가져 가라.
3. 페놀과 구아니딘 이소 티오 시아 네이트 ⁽⁶⁶⁾ (도 1a)의 단 일상 용액을 사용 바이러스 - 함유 세포 배양 배지의 분취 량에서 바이러스 RNA를 정제.
   1. 광고D 1.7 ml의 마이크로 튜브에서 배양 상층 액 200 μL에 대한 단상 시약 600 μL. 30 초 동안 격렬하게 튜브를 손으로 흔들어-RT에서 5 분 동안 배양하여 혼합물을 균질화시킨다.
   2. 균질화 된 시료에 클로로포름 160 μl를 추가합니다. 15 초 동안 적극적으로 튜브를 손 흔드는과 실온에서 2 ~ 3 분 정도를 남겨 철저하게 섞는다.
   3. 즉 두 액체상의 분리, 하부 유기층과 상부 수 성상을 초래 4 ° C에서 15 분 동안 13,400 × g에서 원심 분리하여 분해물 총. 새로운 마이크로 튜브에 RNA를 포함하는 상 수상 (이하 200 μL)를 전송합니다.
   4. 5 μg의 / μL의 글리코겐 1 μL 100 % 이소프로판올 400 μl를 첨가하고, RT에서 10 분 동안 인큐베이션하여 RNA를 침전.
   5. 원심 분리기 4 ℃에서 10 분 동안 13,400 × g에서 혼합물. 뜨는을 취소하고 다섯 펄스 텍싱 세 75 % 에탄올 1 mL로 RNA 펠렛을 씻어시간과 4 ℃에서 5 분 동안 13,400 × g에서 원심 분리.
   6. 10 분 동안 RNA 펠렛을 공기 - 건조 DH ₂ O 40 μL에 용해 사용할 때까지 -80 ° C에서 추출 된 RNA를 저장합니다.

2 개의 중첩 된 cDNA 조각 (F4로 F1) 역전사하여 전체 바이러스 성 게놈 RNA (RT)을 스패닝 - PCR의 설정을 합성

1. 주형으로 정제 된 바이러스 RNA의 10 μL 분취 및 몰 로니 뮤린 백혈병 바이러스의 변형 형태 역전사 효소와 20 ㎕의 RT 반응을 수행한다. ⁽⁶⁷⁾
   1. (10) 정제 된 RNA의 μL, 1 μL 10 밀리미터의 dNTP 믹스, 1 μL 4 pmol의 / μL 프라이머, 1 μL의 DH ₂ O를 포함하는 13 μl의 혼합물을 설정 F4에 대한 F3에 대한 F1, F2의 2RT, 3RT에 대한 1RT 및 4RT 각 RT 반응에 대한 단편 특정 프라이머를 사용합니다.
   2. 1 분, 5 분, 65 ℃에서 얼음에 장소를 혼합물을 품어하고 빠른 스핀 콩트를 수집튜브의 하단에있는 국세청.
   3. μL 역전사 / 4 μL 5 × RT 버퍼, 1 μL 0.1 M DTT, 1 μL 40 U / μL의 RNase 억제제, 1 μL 200 U를 추가합니다. 최대 피펫 팅에 의해 3-5 배 아래로 섞는다.
   4. 반응물을 15 분 동안 70 ℃에서 샘플을 열 - 불 활성화, 1 시간 동안 50 ℃에서 계속하자. 사용할 때까지 -20 ℃에서 합성 된 첫 번째 가닥 cDNA를 저장합니다.
2. 템플릿과 고성능 열 안정성 DNA 폴리머 라 아제 ⁽⁶⁸⁾ (도 1b)와 같은 열 - 불 활성화 RT 반응의 5 μL 분취과 100 μL PCR 반응을 수행한다.
   1. RT 반응의 5 μL, 20 μL 5 × PCR 버퍼, 4 μL 10 밀리미터의 dNTP 믹스, 5 μL 10 μm의 정방향 프라이머, 5 μL 10 μm의 역방향 프라이머, 1 μL 2 U를 포함, 얼음에 100 ㎕의 PCR 반응을 설정 / μL DNA 폴리머 라제, 및 60 μL의 DH ₂ O. 각각의 PCR reactio에 대한 단편 특정 프라이머 쌍을 사용하여N : F1 (2,573 BP)에 대한 1 층 + 1R, F2의 2 층 + 2R (4171 BP), F3에 대한 3F + 3R (3922 BP), 및 F4에 대한 4 층 + 4R (1,798 BP).
   2. 아래에 그 내용을 수집하기 위해 손가락 튀기는 튜브를 3-5 회 원심 분리기 짧게에 의해 부드럽게 섞는다.
   3. 다음 PCR 프로파일과 25-30 사이클이어서 98 ° C에서 30 초의 초기 변성 단계로 시작 열 순환 : 98 ℃에서 10 초, 60 ℃에서 30 초, 및 1-2 분 (30들 / 72 ° C에서 KB). 분석 할 때까지 4 ° C에서 PCR 제품을 보관하십시오.
3. 0.5 μg의 / ㎖ 에티 디움 브로마이드 (EtBr이) (그림 2)를 포함하는 0.8 % 아가 로스 젤에 각각의 PCR 반응의 2-5 μL 나누어지는을 실행합니다.
   주의 : EtBr이이 강력한 돌연변이이며, 사용, 저장, 폐기시 준수해야하는 실험실 코트, 안전 안경, 그리고 착용하는 장갑과 각별한주의가 필요합니다.

3. 서브 클론 BAC 벡터에 네의 cDNA 조각 (F4로 F1)의 각각은 PBAC / F4의 B에 PBAC / F1을 만드는 방법Y 분자 복제 기술

1. 다음, 벡터를 소화하고 두 적당한 제한 엔도 뉴 클레아으로하는 DNA를 삽입 :
   1. 60 μL (포함 총 부피 ~ 500 ng를 DNA에, ³⁰ PME 내가 가진 pBeloBAC11 플라스미드 (7507 BP, GenBank 등록 번호 U51113)의 유도체가 아닌 I를 PBAC / PRRSV / FL (벡터)의 순차적 소화를 수행 , 15,426 bp의 벡터 단편을 얻을 수 12-15 시간 동안 37 ° C에서 10 U 효소 소화 1X 버퍼, 및 1 × BSA).
   2. 25에서 60 μl의 총 부피에 순차 스몰 I와 네 된 cDNA 증폭 산물 (삽입 체)의 각각의 소화 아닌 I를 수행 (~ 1 μg의 DNA를, 20 U 효소, 1 × 분해 완충액을 함유하고, 1 × BSA) ° C SMA (I) 또는 12-15을 원하는 크기 다음 삽입 단편을 산출 시간, 37 ° C (다른 I) : F1 (2559 BP), F2 (4157 BP), F3 (3908 BP), 및 F4 (1,784 BP).
2. 정화벡터를 원하는 겔 추출 된 DNA 단편을 삽입합니다.
   1. 포함 된 1 % 저 융점 아가로 오스 겔 0.5 μg의가 / ㎖ EtBr이에 이중으로 분해 제품을 분리합니다. 장파 자외선 아래 아가로 오스의 최소 금액 (보통 ~ 200 μL)으로 원하는 DNA 단편의 밴드를 잘라.
   2. 1.7 ml의 마이크로 튜브에 아가로 오스 절제에 동일한 TEM 버퍼의 양 (10 mM 트리스 - CL, 1 mM의 EDTA, 10 밀리미터의 MgCl _2)를 추가합니다. 아가로 오스가 완전히 녹을 때까지 매 2 ~ 3 분으로 텍싱, 10-15 분 동안 72 ℃에서 샘플을 배양한다.
   3. RT에서 10 분 동안 13,400 × g에서 1 분간 원심 분리 동안 격렬하게, 소용돌이를 예열 완충액 포화 페놀 동량을 추가한다.
      주의 : 혼합물은 하부 유기층과 상부 수 성상으로 분리한다. 새로운 마이크로 튜브에 DNA를 함유하는 상부 수 성상을 전송.
   4. 이소 아밀 알코올 (24 : 1) 클로로포름 동량 추가 13에서, 1 분 동안 와동 및 원심 분리기,실온에서 10 분 동안 400 ×의 G. 새로운 마이크로 튜브로 위 수성 위상을 전송합니다.
   5. 10 μg의 / μL 효모의 tRNA의 0.5 μL, 3 M 아세트산 나트륨의 1/10 부피, 100 % 에탄올 2.5 볼륨을 추가합니다. 20 분 동안 얼음에 혼합 보관하십시오.
   6. RT에서 10 분 동안 13,400 × g에서 원심 분리하여 혼합물. 상등액을 제거 세 ~ 5 배를 펄스 - 볼 텍싱하고 10 분 동안 13,400 × g에서 원심 분리하여 70 % 에탄올 1 ㎖로 DNA 펠렛을 세척 하였다.
   7. 10 분 동안 DNA 펠릿을 공기 - 건조시키고 TE 완충액 20 μL (10 mM 트리스 - CL과 1mM의 EDTA [pH를 7.6])에 용해.
3. 원하는 벡터를 결찰하고 T4 DNA 리가 제를 사용하여 DNA 단편을 삽입한다.
   1. 벡터 DNA의 50-100 ng의 삽입 DNA의 2 ~ 3 배 몰 과량, 400 U T4 DNA 리가 제, 및 1 × 결찰 완충액을 포함하는 20 ㎕의 결찰 반응을 설정한다. 12 ~ 15 시간 동안 16 ° C에서 연결 반응을 품어.
      참고 : 부정적인 제어 방식을 포함OL 반응, 즉, 만 병렬로 삽입없이 벡터.
   2. 각각 (F1에 대한) 2559-BP와 PBAC / PRRSV / 플로리다의 15426-BP PME I-하지 나는 조각에 합류, 네 별도의 결찰를 수행 4157-BP (F2 용) (F3 용) 3908-BP, 또는 (F4 용) 1784-BP 네의 cDNA 증폭 중 하나의 스몰 I-하지 나는 단편은, 서브 클론 PBAC / F4에 PBAC가 / F1 키를 생성합니다.
4. E. DNA에 결찰 변환 _CaCl2를 -Heat 쇼크 법에 의해 대장균 DH10B.
   1. _CaCl2를 100 ㎕ 분취 유능한 DH10B 세포를 -80 ℃에서 보관 ^69을 처리 한 타고 얼음을 녹여.
      참고 : 변환 당 세포의 100 μl를 사용합니다.
   2. , 1.7 ml의 마이크로 튜브에 해동 세포를 100 ㎕의 DNA 결찰 반응의 10 μL 나누어지는을 추가 튜브를 눌러 부드럽게 혼합하고, 30 분 동안 얼음에 보관하십시오.
   3. 열 충격 42 ° C까지 워싱턴에서 45 초 동안 DNA 세포 혼합물다음 터 목욕, 2 분 동안 얼음에 장소, 그리고 LB 배지 900 μL RT에 미리 예열을 추가합니다.
   4. 225-250 rpm에서 진탕하면서 1 시간 동안 35 ℃에서 열 - 충격 세포를 배양한다.
   5. 10 μg의 / ㎖의 클로람페니콜을 함유하는 LB 아가 플레이트에서 배양 된 세포 (CML)의 50~200 μL 분취를 확산. 그들은 건조 될 때까지, 바로 옆, 실온에서 판을 보관하십시오.
   6. 거꾸로 판을 켜고 15 시간 동안 35 ℃에서 배양한다.
5. 열 기반 정제 방법 (도 1C)에 의해 숙주 세포로부터 클로닝 된 BAC DNA 복구.
   1. LB-CML 한천 플레이트에서 6-8 세균성 식민지를 선택하고 10 μg의 / ㎖ CML을 포함을 함유하는 2 × YT 배지 3 ㎖로 접종. 격렬한 흔들림 (225-250 RPM)와 10 시간 동안 35 ° C에서 문화를 품어.
   2. 제조업체의 지시에 따라, 스핀 열을 사용하여 박테리아 문화의 1.5 ml의에서 재조합 DNA를 BAC을 격리 할 것. ⁽⁷⁰⁾ 용출 추출 된 DNA (typiTE 버퍼의 20 μL에 으 100-200 NG).
   3. 하나의 클로닝을 위해 사용한 것과 동일한 효소를 사용하여 정확한 삽입하여 벡터의 존재를 식별하기 위해, 10 ㎕의 총 부피에서 ~ 6 시​​간 동안 격리 BAC에 두 분석적 제한 효소 digestions을 수행 (참조 프로토콜 3.1), 및 기타 독특한 제한 효소 프래그먼트 패턴을 생성한다 (예를 들어,을 BglII, NCO I 또는 태평양 표준시 I) 적절한 효소로 복제 된 BAC에의 무결성을 테스트한다.
   4. 을 함유하는 2 × YT-CML 매체의 500 ㎖에 (프로토콜 3.5.1)에서 긍정적 인 세균성 문화 500 μl를 접종하고 225-250 rpm으로 진탕하면서 35 ℃에서 6 시간 동안 접종을 배양하여 올바르게 복제 BAC에 전파. 제조업체에서 권장, 필터 열을 사용하여 500 ml의 문화에서 BAC DNA (일반적으로 10 ~ 20 μg의)를 정화. ⁽⁷¹⁾
      참고 : 초기 네 개의 BAC의 서브 클론, JEV 게놈 RNA의 cDNA의 단편을 포함하는 각에이 입증 할 수있다또는 E (기준 서열로서 작용) 바이러스 게놈 ^(42)의 공통 서열과 비교하여 더욱 원하지 않는 돌연변이 (들). 이러한 돌연변이는 전체 길이의 cDNA JEV의 어셈블리 이전에 PCR 기반의 부위 특이 적 변이에 의해 보정 될 필요가있다. ⁽²⁷⁾

4. 5 'SP6 발기인 및 3'실행 - 오프 사이트 전체 길이 JEV cDNA를 만들기

1. 세 유전자 변형이 본격적인 5 '및 3'와 게놈 길이의 RNA의 체외 실행 - 오프 전사를 허용하도록 복제 된 cDNA에 (4.1.1-4.1.3 프로토콜 아래 참조) 확인 바이러스 게놈의 끝납니다.
   1. 중첩 확장 PCR (그림 1D, PBAC / F1 ^SP6)에 의해 바이러스 게놈의 5 '말단의 바로 상류 SP6 프로모터를 소개합니다.
      1. 제품의 (두 프라이머 쌍 SP6F + SP6R (제품 크기, 173 BP)과 F1F + F1R로 PBAC / F1의 첫 번째 표준 PCR을 통해 두 개의 중첩 된 DNA 단편을 증폭이지는, 676 BP), 1 μL의 주형 DNA (~ 200 PG / μL)를 함유하는 50 ㎕의 반응에있어서 각각 10 μL를 5 × PCR 완충액, 2 ㎕의 10 mM의 dNTPs를 2.5 μL 순방향 10 μM의 각각의 리버스 프라이머, 0.5 μL 2 U / μL DNA 중합 효소, ^68, 31.5 μL의 DH ₂ O 30 초 동안 98 ° C를, 10 초 동안 98 ° C, 25 사이클, 30 초간 60 ℃, 20 초 동안 72 ° C : 다음 사이클 프로파일을 사용하여 PCR을 수행한다.
      2. 프로토콜 3.2에 기재된 바와 같이, 1.5 % 저 융점 아가로 오스 겔상에서 PCR 두 제품 각각을 실행 한 후 두 PCR 증폭 된 DNA 단편을 겔 - 정제.
      3. 1 μL 개의 정제 된 DNA 단편을 각각 (~ 100 PG / μL)를 포함하는 100 ㎕의 반응에서 (제품 크기, 821 BP) 최 프라이머 SP6F + F1R를 사용하여 초 융합 PCR을 통해 두 겔 - 정제 된 DNA 단편을 융합하여, 20 ㎕의 5 × PCR 완충액, 4 μL 된 10 mM의 dNTP, 5 ㎕의 10 μM의 정방향 및 역방향 프라이머 각각, 1 μL2 U / μL DNA 중합 효소, ^68, 63 μL의 DH ₂ O. 30 초 동안 98 ° C, 10 초, 30 초, 60 ° C, 30 초 동안 72 ° C ~ 98 ° C의 25주기 다음 열 순환 프로파일을 사용합니다.
      4. 프로토콜 3.2에 기재된 바와 같이, 1 % 저 융점 아가로 오스 겔로부터 융합 된 PCR 증폭 물을 겔 - 정제.
      5. 생성 PBAC / F1의 9532-BP 팩맨 I-BSI 위스콘신 단편 젤 정제 융합 된 PCR의 증폭의 760-BP 팩맨 I-BSI 위스콘신 단편을 결찰하는 프로토콜 3.1-3.5에 설명 된 5 단계 복제 절차를 수행 PBAC / F1 ^SP6.
   2. 중첩 확장 PCR (그림 1D, PBAC / F3 ^KO)를 통해 자동 점 돌연변이 (T → ^9134)을 도입하여 염기 9131에서 기존의 내부 XbaI으로 내가 사이트를 제거합니다.
      1. 두 프라이머 쌍 X1F + X1R에 PBAC / F3의 첫 번째 표준 PCR에 의해 두 개의 중첩 된 DNA 단편을 증폭(제품 크기, BP 746) 및 X2F + X2R 프로토콜 4.1.1.1에 기재된 실험 조건 하에서 50 ㎕의 반응에서 (제품 사이즈, BP (316)).
      2. 프로토콜 3.2에서 설명하는대로, 1.5 % 저 융점 아가로 오스 겔에서 전기 영동 분리 후에 두 PCR 증폭 된 DNA 단편을 겔 - 정제.
      3. 프로토콜 4.1.1.3에 기재된 실험 조건 하에서 100 μL 반응에서 최 프라이머 X1F + X2R (제품 크기 1033 BP)를 사용하여 두 번째 PCR을 통해 융합 두 겔 - 정제 된 DNA 단편을 퓨즈.
      4. 프로토콜 3.2에서 설명하는대로, 1 % 저 융점 아가로 오스 겔로부터 융합 된 PCR 증폭 물을 겔 - 정제.
      5. 16245-BP하지 I-BSI (WI) 및 2141-BP BSI W I와 젤 정제 융합 된 PCR의 증폭의 949-BP AVR Ⅱ-하지 나는 단편을 결찰하는 프로토콜 3.1-3.5에 설명 된 5 단계 복제 절차를 수행 - PBAC / F3의 AVR II 조각은 PBAC / F3 ^KO를 생산합니다.
   3. PCR 기반의 부위 특이 적 변이 (그림 1D, PBAC / F4 ^RO)에 의해 바이러스 게놈의 3 '말단의 하류 새로운 인공 XbaI으로 나는 실행 오프 사이트 엔지니어.
      1. 1 μL의 주형 DNA를 함유하는 100 ㎕의 반응에서 프라이머 ROF + ROR (제품 크기, 324 BP) (~ 200 PG / μL)와 PBAC의 PCR에 의해 하나의 DNA 단편을 생성은 / F4, 20 ㎕의 5 × PCR 완충액, 4 μL 10 밀리미터의 dNTPs, 5 μL 앞으로 10 μm의 각 및 역방향 프라이머, 1 μL 2 U / μL DNA 중합 효소, ⁶⁸ 및 64 μL의 DH ₂ O 30 초 동안 98 ° C를, 10 초 동안 98 ° C의 25주기, 30 초 동안 60 ° C, 15 초 동안 72 ° C : 다음 사이클 프로파일을 사용하여 PCR을 수행합니다.
      2. 프로토콜 3.2에서 설명하는대로, 1 % 저 융점 아가로 오스 겔로부터 PCR 증폭 된 DNA 단편을 겔 - 정제.
      3. 283-BP SFI I-N을 결찰하는 프로토콜 3.1-3.5에 설명 된 5 단계 복제 절차를 수행PBAC / F4 ^소유주를 만들 수 PBAC / F4의 16933-BP SFI I-하지 나는 단편 젤 정제 된 PCR의 증폭의 OT 나는 조각.
2. (세 개의 자연 제한 사이트에서 BSR의 GI, 빵 HI, 그리고 에바 내가 가입하여 (PBAC가 / SA ₍₁₄₎ -14-2) 하나의 전체 길이 SA ₍₁₄₎ -14-2 BAC로 cDNA를 중첩, 수정 네 세트를 조립 ) 프로토콜에 설명 된 절차를 복제 5 단계를 사용하여 순차적으로 3.1-3.5 (그림 1E) : PBAC의 그것과 PBAC / F1 ^SP6의 BSR G I-하지 내가 조각을 대체하여 F1 ^SP6 → F1 ^SP6 F2 (/ 의 아바 I-하지 내가 조각을 대체하여 (F1 ^SP6 F2F3 ^KO F4 ^소유주 → PBAC / F3 ^KO)의 그것과 PBAC / F1 ^SP6 F2의 빵 H I-하지 내가 조각을 대체하여 F1 ^SP6 F2F3 ^KO → F2 () PBAC / F1 ^SP6 (F2)PBAC / F4 ^{소유주의와} F3 ^KO).

5. 전체 길이의 고순도 맥시 준비 SA ₍₁₄₎ -14-2 BAC 준비

1. E.의 단일 식민지를 성장 다음 225-250 rpm에서 진탕하고, 35 ℃에서 10 시간 동안 10 μg의 / ㎖ CML을 포함는 2xYT 국물의 PBAC / SA ₍₁₄₎ -14-2 3 mL로 운반하는 대장균 DH10B 10 시간 500 μl를 접종하여 확장 을 함유하는 2 × YT-CML 매체와 격렬 35 ° C에서 6 시간 동안 접종을 배양 500 ml의에 세균 배양.
2. 원심 분리기 4 ° C에서 15 분 동안 3107 × g에서 두 250 ml의 병 세균 배양. GTE 용액 (50 mM의 포도당, 25 mM 트리스 - CL, 10 mM의 EDTA [pH가 8.0])의 30 ml의 각 펠렛을 재현 탁하고 / ㎖의 리소자임 60 mg을 500 μl를 추가합니다. 10 분 동안 얼음에있는 두 개의 세포 현탁액을 품어.
3. 각 세포 현탁액에 갓 분해 용액 (0.2 N NaOH를 1 % SDS)의 60 ML을 추가 지울 때까지 잘 섞는다하고 해물을 유지실온에서 10 분 동안.
4. 각각의 병 (60 mL의 5 M 칼륨 아세테이트, 11.5 ㎖의 빙초산 및 28.5 ml의 DH ₂ O로 이루어진, 100 mL)로 중화 용액 45 mL를 넣고 병을 반전하여 잘 혼합하고, 얼음 중화 해물을 부화 10 분 동안.
5. 원심 분리기 4 ℃에서 20 분간 18,566 × g에서 중화 해물. 두 개의 새로운 250 ml의 병으로 두 병의 상층 액을 이동; 각각 100 % 이소프로판올 0.6 볼륨을 추가하고, 20 분 동안 얼음에 보관하십시오.
6. 4 ° C에서 20 분 동안 18,566 × g에서 침전물을 스핀 다운. , TE 완충액 5 ㎖에 각각 펠렛을 용해 (총 10 ㎖) 50 ㎖ 튜브에 이들을 결합하고, 5 M 염화 리튬의 동량을 첨가하여 RNA를 침전. 10 분 동안 얼음 혼합물을 품어.
7. 원심 분리기 4 ℃에서 20 분간 14,636 × g에서 RNA 침전물. 새로운 250 ㎖의 튜브에 상청을 전송하고 100 % 이소프로판올 2 부피를 첨가하여 DNA를 침전.20 분 동안 얼음 혼합물을 품어.
8. 4 ° C에서 20 분 동안 18,566 × g에서 DNA 침전물을 스핀 다운. 상층 액을 흡인 TE 완충액 (pH 7.6) 9.5 ㎖에 DNA 펠렛을 재현 탁하고, 염화 세슘 (CSCL) 10 g 및 / ㎖ EtBr이 10 mg을 390 μL를 추가한다.
9. 18 G 바늘이 장착 된 주사기를 이용하여 16 × 76mm 밀봉 폴리 프로필렌 튜브에 DNA-협동 학습 - EtBr이 솔루션을로드합니다. 20 ° C (그림 3)에서 16 시간 동안 401,700 × g에서 초 원심 분리기에 봉인 된 협동 학습 그라데이션 스핀.
10. 구배의 정상에 통기 및 그라데이션의 측면에서 BAC의 DNA를 검색 20 G 바늘 갖춘 주사기를 만드는 18 G 바늘을 사용 CSCL 구배에서 BAC 플라스미드 DNA 밴드를 수집한다.
11. DH _2의 2.5 볼륨을 추가 EtBr이 묻은 BAC의 DNA 샘플에 부탄올을 오 - 포화 텍싱하여 혼합한다. 원심 분리기는 1 분 동안 13,400 × g에서 혼합물은 새로운 1.7 ml의 마이크에 낮은 수성 상을 전송rotube. 이 절차를 여섯 번 반복합니다.
12. 3 M 아세트산 나트륨 1/10 부피 및 부탄올 추출 BAC DNA의 100 % 에탄올 2.5 볼륨을 첨가하고 얼음 위에서 10 분 동안 배양하여 EtBr이없는 BAC DNA를 침전. 원심 분리를 10 분 동안 13,400 × g에서 침전물을 1 ㎖의 70 % 에탄올로 DNA 펠렛을 세척하고, 원심 분리를 다시 펠렛.
13. 10 분 동안 DNA 펠릿을 공기 - 건조시키고 TE 완충액 (pH 7.6) 200 μL에 용해.
    참고 :도 4는 JEV SA ₁₄ -14-2 대한 역 유전학 시스템의 개요를 나타낸다.

6. 선형화 된 전체 길이 JEV BAC DNA로부터 체외에서 합성 RNA를 속기

1. 의 대규모 제한 효소 소화를 수행 PBAC / SA ₁₄ 37 °에서 (3 μg의 DNA, 60 U 효소, 1 × 분해 완충액 및 1 × BSA를 함유 함) 100 μL의 총 부피에 XbaI으로 I와 -14-2 12 ~ 15 시간 동안 C. D의 3 μL 나누어지는을 검사/ ㎖ 0.5 μg의 EtBr이 포함 된 0.8 % 아가 로즈 겔상에서 igestion 반응.
2. 2 시간 동안 30 ° C (그림 4A)에서 녹두 클레아 제 25 U (MBN)와 더 소화 반응을 품어.
3. DH ₂ O 300 μL에 XbaI으로 I-소화, MBN 처리 된 샘플의 볼륨을 가져와 10 분 동안 13,400 × g에서, 격렬하게 1 분 동안 스핀을 희석 된 샘플에, 와류 다음 새로운 1.7 ml의 상부 수성 상을 트랜스퍼 (1 : 24 (25)) 이소 아밀 알코올 : 클로로포름 : 페놀 동량을 추가 마이크로 튜브. 클로로포름의 동일한 볼륨을 추가하고 추출 절차를 반복합니다.
4. 에탄올 침전으로 페놀 / 클로로포름 추출, 선형화 된 BAC 복구 : 3 M 아세트산 나트륨 1/10 부피의 100 % 에탄올 2.5 볼륨을 추가하고, 얼음에서 20 분 동안 배양한다. 원심 분리를 10 분 동안 13,400 × g에서 침전물을 70 % 에탄올 1 ㎖로 DNA 펠렛을 세척 한 다음, 다시 원심 분리하여 스핀 다운.
5. DNA PELLE을 자연 건조10 분 동안 T와 DH ₂ O 30 μL에 용해 0.5 μg의 / ㎖ EtBr이 (그림 5A)와 0.8 % 아가로 오스 겔에 복구 된 BAC의 1 μL 나누어지는을 검사합니다.
6. ~ 200 NG의 주형 DNA, 0.8 mM의 캡 아날로그 [M ⁷ G (5 ') PPP (5'), 1 mM의 rNTPs를 포함하는 25 μL (총 부피에서 선형화 된 BAC DNA를 실행 - 오프 전사를 수행, 40 U의 RNase 억제제, 1 시간 동안 37 ° C (도 4b)에서 20 U SP6 RNA 폴리머 라제, 및 ⁷² × 1 전사 완충액). 포함 0.5 μm의 ^[3 H] DE-81 필터 종이에 흡착에 의해 모니터링으로 ^[3 H] UTP의 결합에 기초 RNA 정량을위한 UTP. ⁶⁹
7. 0.5 μg의 / ㎖ EtBr이 (그림 5B)를 포함하는 0.6 % 아가 로스 젤에 결선 전사 반응의 1-2 μL 나누어지는을 실행합니다.

7. RNA 감염성 및 바이러스 수율 결정

1. 육성 BHK-21 150mm의 cultu 세포5 % CO _2, 37 ℃에서 24 시간 동안 3 × 10 ⁶ 세포 / 요리의 밀도로 요리 재.
   참고 : 10 % 소 태아 혈청 및 2 mM 글루타민, 비타민, 및 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 알파 최소 필수 배지에서 BHK-21 세포를 유지한다.
2. 차가운 솔루션 (137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 8.1 밀리미터 나 ₂ HPO _4, 1.5 mM의 KH ₂ PO ₄₎ 10 mL로 세포 단층을 씻어. 트립신 EDTA (0.25 %)의 4 ㎖로 처리하여 접시로부터 세포를 분리하고, 2 분 동안 원심 데스크탑 270 × g에서 원심 분리에 의해 그들을 수집.
3. 2 분 동안 50 ml의 원추형 원심 분리 관에서 270 × g에서 세포 현탁액을 차가운 용액 A 50ml로 세포 펠렛을 재현 탁. 이 세척 과정을 세 번 반복; 마지막 세척 후, 솔 A.에서 2 × ¹⁰⁷ 세포 / ml의 농도에서 세포 펠렛을 재현 탁
4. 2 μ와 세포 현탁액 400 μL 나누어지는 믹스980 V, 99 마이크로 초 펄스 길이, 5 펄스 (도 4C) : 2 mm 간극의 큐벳에서의 RNA 합성 g, 즉시 최적의 조건 하에서 일렉트로 electroporator와 혼합 electroporate.
   주 : 추가 정제없이 직접 전기에 대한 프로토콜 6.5에서 합성 된 ³ H 표지 RNA를 사용합니다.
5. 실온에서 10 분 동안 세포를 전기 천공 남겨 완전한 배양 배지 600 μl를 함유하는 1.7 ml의 마이크로 튜브에 옮긴다.
6. 완전 배지 1 ml의 일렉트로 세포의 10 배의 일련의 희석액을 제조하고 6- 웰 플레이트 unelectroporated BHK-21 세포 (5 × ^105)의 단일 층의 각 희석액 100 μL 분취를 접시.
7. 배양 4-6 시간 후에, 10 % 소 태아 혈청을 함유하는 최소 필수 배지에서 0.5 % 아가 로스를 오버레이 셀. 5 % CO _2, 37 ℃에서 4 일 동안 번호판을 품어.
8. 전염성 센터를 시각화의 5 % 에탄올 ⁽²⁷⁾ (그림 6A)에 1 % 크리스탈 바이올렛과 7 %의 포름 알데히드 및 염색 고정하여 (플라크).
   1. 옵션 : 면역 형광 분석 ^27,73 (그림 6B)에 의해 JEV 단백질 발현을위한 18 ~ 20 시간 후 - 형질 전환에서 RNA-일렉트로 세포를 검사하고 바이러스 22 및 40 시간 포스트 형질에서 RNA-일렉트로 세포의 상층 액을 수확 플라크 분석 ^27,63 (그림 6C)에 의해 적정.

결과

모든 포지티브 스트랜드 RNA 바이러스에 대해, 역 유전학 시스템의 신뢰성 및 효율을 가진 시퀀스 바이러스 성 게놈 RNA의 공통 서열에 해당 클로닝 된 전장 cDNA의 유전 적 안정성에 의존한다. ^(27)도 1은 5- 도시 JEV SA에 대한 BAC로 전체 길이 감염의 cDNA의 건설을위한 단계 전략 ₁₄ -14-2 ²⁸ : 1 단계, JEV 감염 BHK-21 세포 (그림 1A)의 세포 배양 상층 액에서 바이러스 RNA의 정화; 2 단계, 전체 바이러스 게놈 (도 1b)에 걸친 네 중첩 된 cDNA 증폭 (F1 내지 F4)의 합성; PBAC / F4 (그림 1C)에 PBAC / F1을 만드는 3 단계, BAC 벡터에 네 개의 연속 된 cDNA 조각의 각각의 서브 클로닝; 4 단계, SP6의 RNA 중합 효소, 즉와 체외 실행 - 오프 전사 복제 된 cDNA의 수정, SP6을 배치프로모터 서열 무음 점 돌연변이를 도입하여 뉴클레오티드 9131에서 기존 내부 XbaI으로 I 사이트를 제거 바이러스 5'- 말단 (PBAC / F1 ^SP6)의 바로 상류, ^9134는 T (PBAC / F3 ^KO), 그리고 삽입 →을 바이러스 3'- 말단 (PBAC / F4 ^RO) (그림 1D)의 바로 하류 새로운 인공 XbaI으로 나는 실행 오프 사이트; 그리고 5 단계, 전체 길이의 조립 SA ₍₁₄₎ -14-2의 cDNA BAC, PBAC / SA ₍₁₄₎ -14-2 (그림 1E). 표이 복제 과정에서 사용되는 올리고 뉴클레오티드 (1) 목록. ⁽²⁸⁾

기능적 JEV의 cDNA 건설, 제 중요한 단계는 RT-PCR을위한 주형으로 정제 된 바이러스 RNA를 이용하여 네 개의 중첩 된 cDNA 단편을 합성한다. (2)가 있었다 네 RT-PCR 제품에 대한 대표적인 결과를 제공 도표 0.8 %에 전기 영동아가 로스 젤. 이 젤은 전체 길이 JEV cDNA를 네 개의 중첩 된 cDNA 조각으로 증폭되는 것을 명확하게 보여줍니다. 때때로, RT-PCR 반응은 cDNA 합성 때문에 / 증폭시 프라이머의 어닐링 특이성, 예상되는 대부분의 제품보다 작은 하나 이상의 추가의 바이러스 특이 적 또는 비특이적 인 제품을 얻을 수있다. 한편, 거의 또는 전혀는 RT-PCR 산물 때문에 바이러스 RNA 분리 또는 부적절한 RT-PCR 성능 중에 우발적으로 RNase 오염 증폭 될 것이라고 예상.

다음으로 중요한 단계는 partial- 또는 전장 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 비교적 간단한 절차 BAC에 JEV의 cDNA의 클로닝 및 변형 예이다. ^(69)도 3을 함유하는 BAC 클론의 정제를위한 대표적인 결과를 나타낸다 CSCL-EtBr이 기울기에 밴딩으로 JEV SA ₍₁₄₎ -14-2의 전체 길이의 cDNA.이 실험에서, 401,700 × g에서 16 시간 동안 원심 분리 후, 두 개의 별개의 대역, 즉, E. 상기 대장균 염색체 DNA 및 아래 수퍼 코일 BAC 플라스미드 DNA는, 장파 자외선 하에서 관의 중간에서 볼 수있다. 하부의 BAC DNA 밴드의 최소 부피 (~ 400 μL)을 조심스럽게 튜브의 측면에 주사기로 구멍을 파고에 의해 수집 하였다. 그 후, EtBr로는 부탄올 추출 BAC DNA로부터 추출하고 EtBr이없는 BAC DNA는 에탄올 침전에 의해 농축시켰다.

마지막 단계는 허용 세포에 RNA 형질 전환 (그림 4) 후 전체 길이 SA ₍₁₄₎ -14-2 BAC (PBAC / SA ₍₁₄₎ -14-2)에서 체외에서 전사 합성 RNA를 특정 감염의 결정이다. 3 '단계 1에서, 전체 길이의 선형화 SA ₁₄ -14-2의 cDNA :이 단계는 세 개의 순차적 인 단계를 포함-end 바이러스 게놈 (도 4a)의; 2 단계, 실행 - 오프 전사 (그림 4B)에 의해 선형화 된 cDNA의 합성 RNA를 생산; 그리고 3 단계의 RNA 합성 (도 4C)로 형질 BHK-21 세포에서의 재조합 바이러스의 구조. 실험적으로, PBAC / SA ₍₁₄₎ -14-2의 두 개의 독립적 인 클론 XbaI으로 내가 소화와 선형화 및 XbaI으로 나는 분해에 의해 생성 된 네 개의 염기 5 '오버행을 제거하기 위해 MBN 처리 하였다. 선형화 BAC에 에탄올 침전,이어서 페놀 - 클로로포름 추출하여 정리 하였다. 두 개의 정제 BAC에의 선형화는 0.8 % 아가 로스 젤 (그림 5A)에 증명되었다. 페놀 - 클로로포름 추출은 선형화 된 BAC에가의 RNase가없는 것을 확인하기 위해주의 깊게 수행해야합니다. 두 개의 선형 BAC에 각각 M ⁽⁷⁾ G (5 ') PPP의 존재 SP6 RNA 중합 효소를 사용하여 결선 전사 cDNA를 템플릿으로 제공 (5') 캡 유사체. 합성 RNA를의 무결성을 기준 1킬로바이트의 DNA 사다리 (그림 5B)와 함께, 0.6 % 아가 로스 젤에있는 두 개의 전사 반응 혼합물의 분취 량을 실행하여 나타내었다.이 간단한 분석에서, 주요 저명한 RNA 밴드는 언제나 마이그레이션 3킬로바이트 아래의 DNA 밴드를 참조하고 날카로운 것으로 나타났다. 그러나, RNA는 동일한 겔에 도말 외관이 저하 것이다.

감염성 중심 분석은 합성 RNA는 감염성의 비를 결정하기위한 금 표준이다. 이 분석은 (3 × ¹⁰⁵ 세포 / 웰) 나이브 BHK-21 세포를 함유하는 6- 웰 플레이트에서 10 배 희석 한 일렉트로 세포의 분취 량을 시드, RNA 샘플을 BHK-21 세포를 electroporating, 아가 로스 오버레이에 의해 이루어졌다 세포 단층 상. 4 일 동안 배양 한 후, 생존 세포는 포름 알데히드로 고정하고, 크리스탈 바이올렛의 염색olution는 세포 (도 6A)에 전달되는 감염성 RNA 분자의 수에 대응 감염성 센터 (플라크)의 수를 정량화한다. 시험 관내 전사에 사용되는 cDNA의 템플릿이 아닌 감염성 것으로 입증 되었기 때문에, 전사 반응 혼합물의 분취 량 ^(27)은 직접적으로 전기 천공을 위해 사용 하였다. 전기는 RNA 형질에 대한 선호되는 방법입니다; 대안 적으로,이 RNA를 DEAE 덱스 트란과 양이온 성 리포좀을 사용하는 다른 방법에 의해 형질 전환 될 수있다. RNA의 전기 천공은 매우 효과적이지만, 전기 펄스의 "아크"를 염 전기 반응이나 전기 천공 큐벳 재사용되는 경우 존재하는 경우에 드물게 발생한다. RNA 형질 감염된 세포에서 바이러스 단백질의 발현을 방지 NS1 토끼 항혈청 (도 6b)을 사용하여 면역 형광 분석법에 의해 검사 하였다. RNA 형질 감염된 세포의 상청액에 축적 된 바이러스 입자의 제작했다플라크 분석 (그림 6C)에 의해 alyzed. 이러한 실험의 결과는 cDNA를 합성 유래의 RNA가 재조합 바이러스의 높은 역가를 생성 허용 BHK-21 세포에 감염임을 분명히 보여준다.

올리고 뉴클레오티드	시퀀스 (5 '3')	위치 (B)	극성
1RT	TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT	2578-2603	안티센스
1 층	aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT	1-22	감각
1R	attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT	2532에서 2553 사이	안티센스
2RT	TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA	5975-6000	개미ISENSE
2 층	aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT	1800에서 1821 사이	감각
2R	attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC	5929-5950	안티센스
3RT	ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT	9426-9451	안티센스
3 층	aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT	5500-5521	감각
3R	attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT	9380-9401	안티센스
4RT	AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA	10952-10977	안티센스
4 층	aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA	9200-9221	감각
4R	attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC	10956-10977	안티센스
SP6F	cataccccgcgtattcccac 고마워		감각
SP6R	ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa	1-14	안티센스
F1F	aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG	1-17	감각
F1R	TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA	638-662	안티센스
X1F	CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG	8403-8427	감각
X1R	AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC	9120-9148	안티센스
X2F	GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT	9120-9148	감각
X2R	cacgtggacgagggcatgcc tgcag		안티센스
ROF	CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC	10670-10694	감각
ROR	agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC	10954-10977	안티센스
JEV 시퀀스는 대문자로 표시하고, BAC 시퀀스는 소문자로 표시됩니다. B 염기 위치는 JEV SA (14) -14-2 (GenBank 액 번호 JN604986)의 전체 게놈 서열을 의미한다.

표 1 : cDNA 합성, PCR 증폭, BAC 및 돌연변이 유발을 위해 사용 된 올리고 뉴클레오티드.

그림 1.0; 전략 BAC으로 JEV SA ₍₁₄₎ -14-2의 전체 길이의 cDNA의 건설을위한 JEV의 입자 바이러스 RNA의 (A)를 분리.. JEV SA ₁₄ -14-2의 게놈 RNA의 개략도가 도시. 바이러스 게놈 전체를 덮는 (B) 네 개의 중첩 된 cDNA 단편의 합성 (F1 내지 F4). PBAC / F4에 PBAC / F1 키를 생성 BAC 벡터에 네 개의 중첩 된 cDNA 조각의 (C) 서브 클로닝. 체외에서 결선 전사 복제 된 cDNA의 (D) 수정. PBAC / F1 ^SP6는 바이러스의 5'- 말단의 상류 SP6 프로모터 서열을 포함 PBAC / F1의 유도체이다. PBAC / F3 ^KO로 자동 점 돌연변이 (T → ^9134, 별표)를 포함 PBAC / F3의 유도체이다. PBAC / F4 ^소유주는 바이러스 3'- 말단의 하류 인공 XbaI으로 나는 실행 오프 사이트를 포함 PBAC / F4의 유도체이다. (E 강한>) 전체 길이 SA ₍₁₄₎ -14-2 BAC 조립 (PBAC / SA ₍₁₄₎ -14-2). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

JEV SA ₁₄ -14-2의 전체 길이 게놈 RNA 걸친도 네 중첩 된 cDNA 단편의 합성 2 (F1 내지 F4). 네 개의 RT-PCR 산물은 0.8 % 아가 로스 겔에서 전기 영동에 의해 평가된다. M, 1킬로바이트의 DNA 사다리. 네의 cDNA 조각의 예상 크기는 젤 이미지의 맨 아래에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

/ftp_upload/53164/53164fig3.jpg "/>
JEV의 전장 cDNA SA ₁₄ -14-2 함유 BAC도 3의 정제. BAC 플라스미드는 E.로부터 단리 SDS-알칼리 용 균법에 의해 대장균 DH10B은 더욱 협동 학습-EtBr이 구배 밴딩 그래피. 16 × 76mm 밀봉 폴리 프로필렌 튜브를 사용하여 협동 학습 - EtBr이 경사의 예는 것입니다 발표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

JEV SA ₍₁₄₎ -14-2 cDNA를 BAC 조립 전체 길이에서 감염성 바이러스의 회복 그림 4. 개요. cDNA를 템플릿 () 선형화. JEV 혈중 알코올 농도가 절단되는 전체 길이XBA I 및 MBN로 처리 하였다. RNA 전 사체의 (B)를 합성. 선형화 된 cDNA를 m ⁷ G (5 ') PPP (5')의 캡 유사체의 존재하에 SP6 RNA 중합 효소로 전사된다. 합성 JEVs의 (C) 복구. 시험 관내 전사의 RNA를 합성 바이러스의 높은 역가를 생성하는 전기에 의해 BHK-21 세포로 형질 전환된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

cDNA를 템플릿으로 전체 길이 JEV의 혈중 알코올 농도를 사용하여 시험 관내 전사에 의해 그림의 RNA 5. 합성을. 선형화 된 전체 길이 JEV BAC, PBAC / SA ₍₁₄₎ -14-2의 (A) 세대. PBAC의 두 개의 독립적 클론/ SA ₍₁₄₎ -14-2 (Cl.1과 c12에)는 MBN과 XbaI으로 내가와 소화 및 후속 처리로 선형화된다. 선형화의 BAC는 0.8 % 아가로 스겔 전기 영동에 의해 검사된다. 결선 전사에 의해 합성 RNA를 (나) 생산. 두 개의 선형 BAC에 각각 SP6의 RNA 중합 효소 실행 - 오프 전사의 템플릿으로 사용됩니다. 두 전사 반응의 분취 량은 0.6 % 아가 로스 젤에서 실행됩니다. M은 1킬로바이트 DNA 사다리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

전체 길이 JEV의 BAC 및 합성 바이러스의 회복 전사 합성 RNA를 그림 6. 특정 감염. BHK-21 세포 FR 유래 RNA 전 사체와 (모의) 일렉트로 - 모의 또는 일렉트로 있습니다전장 JEV의 BAC (Cl.1 및 c12에)의 두 개의 독립적 인 클론의 각 OM. (A) RNA의 감염. 세포는 아가로 오스와 겹쳐 및 사후 형질 사일에 크리스탈 바이올렛으로 염색된다. 감염성 RNA는 세포 (좌측 패널)에 전기 천공 감염성 RNA의 양을 추정하기 위해 감염성 센터 세이에 의해 결정된다. 또한, 전염성 센터의 대표 이미지 (오른쪽 패널) 표시됩니다. (B) 단백질 발현. 세포 4- 웰 챔버 슬라이드에 배양했다. 20 시간 후 - 형질 감염 (HPT)에서 RNA-일렉트로 세포에서 바이러스 성 단백질 발현은 일차 항 NS1 토끼 항혈청과 이차 Cy3가 접합 된 염소 항 - 토끼의 IgG (적색)를 이용하여 면역 형광 분석법에 의해 분석된다. 핵은 4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (파란색)으로 대조된다. 면역 형광 이미지는 해당 미분 간섭 콘트라스트 이미지 상에 오버레이된다. (C) 바이러스 수율. 세포를 배양하고 1 아르50mm 배양 접시. 22, 40 HPT에서 RNA-일렉트로 세포의 배양 상층 액에 축적 감염성 비리의 생산은 플라크 분석에 의해 조사한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

현재의 프로토콜은 성공적으로 두 개의 서로 다른 균주 (CNU / LP2 ^(27)와 사 ₍₁₄₎ -14-2 ²⁸⁾ JEV, 그 기능 cDNA를 입증했다 구축 할 본질적으로 어려울 수있는 플라 비 바이러스의과에 대한 전체 길이 감염의 cDNA 클론을 생성하는 데 사용 된 때문에 숙주 세포 독성 및 클로닝 된 cDNA의 유전 적 불안정성 전파 ^{8,74-76을이} 프로토콜은 세 개의 주요 구성 요소가 포함됩니다. 고성능 역 전사 효소를 사용하여 바이러스 RNA의 충실한의 cDNA 복사본의 합성 / 증폭을 최대화 먼저 / DNA 중합 효소; 둘째로, 마지막으로 전체 길이의 cDNA 조립 공정 초기에 서브 클로닝 된 cDNA로부터 매우 낮은 카피 수의 벡터에서 BAC (미발표 데이터) 서열을 함유하는 독성 바이러스 E-PRM 코딩 영역 ^{74,77,78 클로닝;} 그리고 세 번째, 분명히 더 큰 DNA의 INSE을 용인 120-350킬로바이트, ^19-21의 평균 크기의 외래 DNA를 수용 할 수있는 클로닝 벡터의 혈중 알코올 농도를 이용하여보다 RTS는 다른 복제 벡터를 않습니다. 이 복제 방법은 다른 많은 포지티브 - 가닥 RNA 바이러스, ~ 10 내지 32 KB의 큰 RNA 게놈을 가진 특히 일반적으로 적용 가능할 것이다. 게놈은 숙주 세포 변이가 단백질로 번역되는 바이러스 성 mRNA의 작용 때문에 감염성 cDNA를 클론의 발생은, 특히 포지티브 - 가닥 RNA 바이러스에 대해, RNA 바이러스에 대한 역 유전학 시스템을 개발에서 중요한 단계이다. 따라서, 바이러스 복제는 감수성 숙주 세포에 유래하는 cDNA 게놈 길이의 RNA 분자의 도입에 의해 개시 될 수있다. 감염성 JEV의 cDNA 클론의 가용성 재조합 DNA 기술과 결합 될 때, 이러한 유전자 발현 ^73,79과 게놈 복제로서, 분자 수준에서 바이러스 생활주기의 다양한 양상의 이해를 증가 하였다. ^{63, 64이} 또한, 전체 길이의 cDNA 클론 JEV 바이러스 백신은 ^28과 유전자 전달 벡터의 개발을위한 가치있는 도구임이 입증되었다. ^{80, 81}

모든 포지티브 - 가닥 RNA 바이러스와 같이, 고도로 감염성 RNA를는 시험 관내에서 합성 될 수있는 JEV위한 안정적인 기능의 cDNA를 구축 여러 중요한 단계가있다. 이상적으로, 전체 길이의 cDNA 클론으로부터 전사 된 RNA를 합성의 순서는 바이러스 게놈 RNA 바이러스 RNA 복제의 개시에 필요한 특히 5'- 및 3'- 말단의 서열과 동일해야 . ^60-62 현재 프로토콜에서, 인증 된 5'- 및 3'- 말단 마지막 하류를 바이러스 게놈의 제 아데닌 뉴클레오티드 상류의 SP6 프로모터 서열을 배치하고 고유 인공 XbaI으로 I 제한 부위의 위치에 의해 보장 된 각각 바이러스 게놈의 티민 염기. XbaI으로 I-선형화와 MBN 처리 cDNA를 TE의 결선 전사에 의해 생산 된 정통 5 '및 3'끝과 합성 RNA를 출장mplate M ⁽⁷⁾ G (5 ')를 준비하는 SP6 RNA 중합 효소 PPP (5') 캡 아날로그를 사용하여. 이 프로토콜은 여러 가지 방법으로 변형 될 수있다. 그것은에없는 경우 시험 관내 전사를 들어, 다른 박테리오파지 RNA 폴리머 라제 (예, T3 또는 T7)이 그것의 잘 정의 된 프로모터 서열과 함께 사용될 수있다. ^(27)를 결선 부위로서, 다른 제한 사이트를 이용할 수있다 선형화 된 cDNA에서 바이러스 게놈과 경우 합성 RNA는 본격적인 3 '끝으로 끝납니다. 합성 RNA는 그 3 '말단에 서너 바이러스 무관 뉴클레오티드를 포함하는 경우 3'- 말단의 염기 서열의 중요성은 RNA 감염성의 ~ 10 배 감소에 의해 입증되었다. 시험 관내 전사 반응에 ^(27), 두 M ⁽⁷⁾ G (5 ') PPP (5')와 M ⁽⁷⁾ G (5 ') PPP (5') G 캡 아날로그 5 바이러스의 후반 장소하지만 관련이없는 여분의 G 염기 상류 잘 동일하게 사용할 수 있습니다 '-end하지만추가 감염 또는 합성 RNA의 복제를 변경하지 않습니다. ⁽²⁷⁾ 또한, DNase의 I 소화에 의해 RNA 전 사체로부터의 cDNA 템플릿의 제거가 RNA의 감염 테스트를 위해 필요하지 않다 cDNA를 템플릿 자체는 감염되지 않기 때문에. ⁽²⁷⁾

BAC 기술은 이제 긍정적 인 가닥 RNA 바이러스, 즉, 두 JEVs, CNU / LP2 ^(27)와 사 ₍₁₄₎ -14-2 ²⁸ (게놈 크기, ~ 11킬로바이트)의 소수에 대한 감염의 cDNA 클론을 구성에 적용되었습니다; 두 뎅기열 바이러스, BR / 90 ^(26)와 NGC ²⁹ (11 ~ KB); 소 바이러스 성 설사 바이러스, SD1 (12 ~ KB)을 ²⁵ 개의 전형적인 돼지 열 바이러스, C 및 패더 (12 ~ KB) ²⁴ 국경 질환 바이러스, Gifhorn의 (12 ~ KB) ²⁴ 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 , PL97-1 / LP1 (15 ~ KB) ³⁰ 전염성 위장염 바이러스, PUR46 - MAD (~ 29킬로바이트) ¹⁶ 고양이 전염성 복막염 바이러스,DF-2 (~ 29킬로바이트) ³² 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스, 우르 바니 (30 ~ KB) ⁹ 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스, EMC / 2012 (30 ~ KB), ^(17)과 인간 코로나 바이러스, OC43 (~ 31킬로바이트) ^31의 cDNA 건설 BAC에 사용의 주요 이점은 대형, 1 또는 2 복사본 BAC 플라스미드의 유전 적 안정성이 높은 것이다.; 그러나, 극히 낮은 카피 수의 본질 때문에 BAC DNA의 염색체 DNA를 호스트에 대하여 BAC의 DNA의 순도가 감소 그에 매우 낮은 수율, 또한 큰 단점이다. 현재 프로토콜에서, BAC DNA의 수율은 E. 성장에 의해 극대화 대장균 DH10B는 영양이 풍부한 매체는 2xYT에 / 감염성 BAC의 PBAC와 SA ₍₁₄₎ -14-2을 바꾸었다. 이러한 노력에도 불구하고, 평균 수율은 ~ 15 μg의는 2xYT 국물 500ml의에서 BAC의 DNA이다. 또한, BAC DNA의 순도는 정제를 위해 가장 CSCL-EtBr을 밀도 구배 원심 분리를 이용함으로써 달성된다오히려 일반적으로 사용되는 컬럼 기반의 플라스미드 분리보다. 그러나, 명심하는 것이 중요하다 BAC 변환 된 E. 이 복제 된 cDNA의 유전 적 안정성을 위태롭게 할 수 있기 때문에 대장균이 자라다하지 말아야하며, 더 높은 성장이 반드시 더 큰 수익률 또는 더 높은 순도의 BAC DNA로 이어질하지 않습니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 JEV에 대한 BAC으로 유 전적으로 안정된 전체 길이 감염의 cDNA 클론의 건설 및 전파를위한 최적화, 효율적이며 능률적 인 방법, 절차는 한 번 실질적으로 불가능하다고 생각. 이 같은 클로닝 전략은 또한 다른 많은 양 가닥 RNA 바이러스에 적용될 수있다. 일반적으로, 감염의 cDNA 클론 바이러스 복제 및 병인에 생물학적 기능을 연구하는 바이러스 RNA 게놈에 돌연변이 (예를 들어, 삭제, 삽입, 및 점 돌연변이)의 다양성을 소개 할 수있게. 이 cDNA를 기반​​ 역 유전학 시스템으로 개발할 수있게하고 TESt 백신 및 특정 관심 포지티브 - 가닥 RNA 바이러스의 병원성 인자 (들)를 치료 표적 후보. 또한, 이러한 감염성 cDNA의 기술은 또한 생물 의학 연구에 많은 응용 관심 외래 유전자 (들)을 발현 할 수있는 바이러스 벡터로 이용 될 수있다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
<강한>1. 분자 클로닝
2xYT Broth	Sigma-Aldrich	Y2377
[3H]UTP	PerkinElmer	NET380250UC	방사성
50ml 튜브	Thermo Scientific (Nalgene)	3114-0050
250 ml 병	Beckman Coulter	356011
Agarose	Lonza	50004
아가로스 (낮은 융점)	생명 기술 (Invitrogen)	16520-100
AvaI	뉴잉글랜드 BioLabs	R0152S
AvrII	뉴잉글랜드 BioLabs	R0174S
BamHI	뉴잉글랜드 BioLabs	R0136S
BsiWI	뉴잉글랜드 BioLabs	R0553S
BsrGI	새로운 잉글랜드 BioLabs	R0575S
부탄올	피셔 사이언티픽	A399-1
Cesium Chloride	Fisher Scientific	BP1595-1
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
클로로포름	Sigma-Aldrich	C2432	발암성
DE-81 여과지	GE Healthcare Life Sciences	3658-023
dNTP mix	Life Technologies (Invitrogen)	18427-088
E. 대장균 DH10B	Life Technologies (Invitrogen)	18297-010
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
에탄올	Sigma-Aldrich	E7023
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E7637	독성 및 고변이원
필터 컬럼 (Plasmid Maxiprep Kit)	Life Technologies (Invitrogen)	K2100-26
빙하 아세트산	Sigma-Aldrich	A6283	자극성
글루코스	Sigma-Aldrich	G5400
글리코겐	Roche	10901393001
고화질 DNA 중합효소	New England BioLabs	M0491S
이소아밀 알코올	시그마-알드리치	I9392	가연성
이소프로판올	Amresco	0918	Flammable
LB Broth	Life Technologies (Invitrogen)	12795-027
리튬 클로라이드	시그마-알드리치	L9650
라이소자임	Amresco	0663
마그네슘 클로라이드	시그마-알드리치	M8266
M-MLV 역전사 효소	라이프 테크놀로지스 (인비트로겐)	18080-044
녹두 뉴클레아제	뉴잉글랜드 BioLabs	M0250S
바늘 (18G, 20G)	BD	305196, 305175	생물학적 위험(날카로운 물건 폐기물)
NotI	New England BioLabs	R0189S
올리고뉴클레오티드	통합 DNA 기술	맞춤형 올리고뉴클레오티드 합성
PacI	뉴잉글랜드 BioLabs	R0547S
pBeloBAC11	New England BioLabs	ER2420S (E4154S)
페놀(완충	Life Technologies(Invitrogen)	15513-039	독성 및 고부식성
페놀:클로로포름:Isoamyl Alcohol	Life Technologies(Invitrogen)	15593-031	독성 및 부식성이 높은
페놀:Guanidine Isothiocyanate	Life Technologies(Ambion)	10296-010	독성, 부식성, 그리고 자극성
Pme I	New England BioLabs	R0560S
칼륨 아세테이트	Amresco	0698
RNase Inhibitor	Life Technologies (Invitrogen)	10777-019
rNTP 세트	GE Healthcare Life Sciences	27-2025-01
밀봉 가능한 폴리프로필렌 튜브 (16 × 76 mm)& 주의;	벡크만 쿨터	342413
SfiI	뉴잉글랜드 BioLabs	R0123S
Sma I	뉴잉글랜드 BioLabs	R0141S
아세트산나트륨	시그마-알드리치	S2889
도데실황산나트륨	Amresco	0227
수산화나트륨	시그마-알드리치	S5881
SP6 RNA 중합효소	New England BioLabs	M0207S
스핀 컬럼 (플라스미드 Miniprep Kit)	Life Technologies (Invitrogen)	K2100-11
주사기	HSW NORM-JECT	4200.000V0
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202S
Tris	Amresco	0826
tRNA (yeast)	Life Technologies (Invitrogen)	15401-011
엑스바이	New England BioLabs	R0145S
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
2. 세포 배양
Alpha Minimal Essential Medium	Life Technologies (Gibco)	12561-049
원뿔형 튜브 (50 mL)	VWR	21008-242
크리스탈 바이올렛	Sigma-Aldrich	C0775
배양 접시 (150mm)	TPP	93150
큐벳 (2mm 갭)	하버드 기기	450125
소 태아 혈청	Life Technologies (Gibco)	16000-044
포름알데히드	Sigma-Aldrich	F1635	독성 및 발암성
글루타민	Life Technologies (Gibco)	25030-081
Minimal Essential Medium	Life Technologies (Gibco)	61100-061
페니실린/스트렙토마이신	Life Technologies (Gibco)	15070-063
염화칼	Sigma-Aldrich	P3911
인산칼륨 일염기	Sigma-Aldrich	P9791
6웰 플레이트	TPP	92006
염화나트륨	Sigma-Aldrich	S3014
인산나트륨 이염기성	Sigma-Aldrich	S3264
트립신-EDTA (0.25%)	Life Technologies ( Gibco)	25200-056
비타민	시그마-알드리치	M6895
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
3. 장비
Agarose 젤 전기영동 시스템	Mupid	MPDEXU-01
CO2 인큐베이터	Thermo Scientific	Heracell 150i
데스크탑 원심분리기	Thermo Scientific	ST16R
Electroporator	Harvard Apparatus	ECM 830
Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld)		UVP UVGL-58
탁상용 원심분리기	Beckman Coulter	368826
Thermocycler	Life Technologies (Applied Biosystems)	GeneAmp PCR System 9700
Vortexer	과학 산업	G-560
수조	Jeio Tech	WB-10E