방법 논문

빠른 현장에서 하이브리드

DOI:

10.3791/53165

⸱

2015년 9월 23일

 ,  ,  , 
1Ross University School of Veterinary Medicine, 2Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 파라포름알데히드 접두사가 붙은 뇌에 이상적인 빠르고 단순화된 현장 혼성화 방법을 설명하므로 신선한 냉동 조직을 사용하는 동안 장기간의 복잡한 단계의 필요성을 줄입니다. 이 방법은 쥐에서 세로토닌 5-HT2A 수용체 유전자 htr2a의 식별을 사용하여 검증되었습니다.

초록

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3,4-Methylenedioxymethamphetamine(MDMA, 엑스터시) 독성은 급성 세로토닌(5-하이드록시트립타민, 5-HT) 증후군으로 인해 세로토닌 mRNA 발현에 부위 특이적 변화를 일으킬 수 있습니다. 이 가설은 세로토닌 5-HT2A 수용체 유전자 htr2a를 검출하기 위해 현장 혼성화를 사용하여 테스트할 수 있습니다. 과거에는 방사성 리보프로브를 사용하는 이러한 절차가 수행하는 데 며칠이 필요한 복잡한 작업 흐름과 RNase가 없는 환경에서 유지되는 신선한 냉동 조직을 사용해야 하는 추가 어려움으로 인해 어려웠습니다. 최근에는 짧은 올리고뉴클레오티드 프로브의 개발로 제자리 혼성화 절차가 단순화되고 실험실에서 더 널리 사용할 수 있는 파라포름알데히드 접두사가 붙은 뇌 절편을 사용할 수 있게 되었습니다. 여기에서는 접두사가 있는 뇌 조직에 비방사성 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 연구에 사용된 혼성화 프로브에는 dapB(디하이드로디피콜리네이트 환원효소를 암호화하는 박테리아 유전자), ppiB(펩티딜프롤릴 이소머라제 B를 암호화하는 하우스키핑 유전자) 및 htr2a(5-HT2A 수용체를 위한 세로토닌 유전자 암호화)가 포함됩니다. 이 방법은 비교적 간단하고 저렴하며 재현 가능하며 완료하는 데 2일도 채 걸리지 않습니다.

서론

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세로토닌 (5-하이드록시트립타민; 5-HT) 증후군은 항우울제1와 같은 5-HT 촉진 약물에 의해 발생하는 급성 신경 질환이며, 레크리에이션 목적으로 MDMA를 사용하는 상황에서도 발생한다2. 급성 증후군과 관련하여 발생하는 기분 변화, 학습 및 기억력 결핍의 원인이 되는 분자 메커니즘은 잘 알려져 있지 않다3,4. In situ hybridization은 단일 세포 수준에서 잠재적으로 발현되는 특정 mRNA의 검출 및 정량화를 가능하게 하는 강력한 연구 도구입니다. in situ hybridization을 수행하는 일반적인 방법은 관심 유전자를 특이적으로 혼성화하는 방사성 표지 리보프로브를 사용하는 것입니다. 그러나 주요 단점은 이 방법이 복잡하고 시간이 많이 걸리는 프로브 준비 및 혼성화 단계뿐만 아니라 RNase가 없는 환경에서 유지되는 신선한 냉동 조직에 대한 접근이 필요하다는 것입니다5,6.

올리고뉴클레오티드 프로브는 리보프로브에 필요한 것보다 더 짧은 RNA 단편을 혼성화하기 위해 최근에 개발되었습니다7. 또한 프로브는 특이성8을 희생하지 않고 낮은 백그라운드 신호를 생성합니다. 이 새로 개발된 프로브 기술은 면역세포화학 실험실에서 일반적으로 사용할 수 있는 파라포름알데히드 접두사가 있는 뇌 조직에서 in situ hybridization에 사용할 수 있습니다.

여기에서는 파라포름알데히드 접두사가 붙은 쥐의 뇌에서 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 현장 교잡을 위한 프로토콜을 설명하고 그 결과를 신선 냉동 뇌에서 언급된 것과 비교합니다5,6. 이 프로토콜은 MDMA 물질 남용이 뇌의 5-HT2A 수용체 유전자 htr2a mRNA의 변화를 일으킨다는 가설을 테스트하는 데 사용됩니다. MDMA 처리로 절차를 시작한 후 동물의 파라포름알데히드 조직 관류, thr2a 프로브의 현장 혼성화 및 데이터 분석이 이어졌습니다. dapB(디하이드로디피콜리네이트 환원효소를 암호화하는 박테리아 유전자)는 음성 대조군으로, ppiB(펩티딜프롤릴 이소머라제 B를 암호화하는 하우스키핑 유전자)는 양성 대조군으로 사용됩니다.

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프로토콜

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아래에 설명 된 동물 사용 절차는 동물 용 의약품의 로스 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)와 플로리다 애틀랜틱 대학에 의해 승인되었다. 멸균 기술과 장갑이 필요하지만이 프로토콜을 사용하는 동안의 RNase없는 환경이 필요하지 않습니다.

1. 준비

  1. 조직 준비와 절편
    1. 세 그룹으로 무작위로 쥐를 할당 :,, SAL / 접두사 및 / 3,4-methylenedioxymethamphetamine 접두사 신선한 / 식염수 (0.9 % NaCl을 SAL) (MDMA를 표 1에서 자세한 내용을 참조).
    2. 2 시간 간격으로 SAL 및 MDMA 그룹, 복강, 각각 1 ㎖ / ㎏ SAL 및 10 ㎎ / ㎏ MDMA의 세 가지 용량을 관리합니다. 동물 6 일 동안 치료 살아남을 수 있습니다.
    3. 7 일에, 5 mg의 조합에 100 ㎎ / ㎏ 케타민을 관리 / 복강 깊은 마취에 대한 쥐 (에 자일 라진을 kg 즉, 각막 깜짝 및 타 손실김정일이) 반사 신경을 꼬집어.
    4. 신선한 / SAL 그룹의 경우, 신속하게 쥐 목을 벨과 (기준 5에서 세부 사항을 참조) 신선한 뇌 테스트 뇌를 제거합니다.
    5. SAL / 접두사와 접두사 / MDMA 그룹의 경우, 흉골 약 10 -12 cm 따라 절단을 한 후 흉골의 끝을 노출.
    6. 지혈제와 흉골의 끝을 잡고 날카로운 가위로 양쪽 측면 다이어프램을 절단 한 후 폐에 갈비와 병렬을 통해 위로 잘라.
    7. 한 손으로, 작은 집게로 마음의 복부 끝을 잡고. 다른 한편으로, 18 G 주사기 바늘 좌심실 피어스 (빙냉 SAL과 파라 포름 알데히드 및 용기 연동 펌프에 Y 자형 실리콘 호스와 연결되어 바늘 어댑터 측에 유의 참조 기준 9).
    8. 유량 (~ 5 ml / 분)의 중간 수준에서 SAL 펌프를 켜고 반환 CIRC의 탈출을 할 수 있도록 집게로 우심방에 구멍위험률. 30 분 동안 SAL 관류를 유지한다.
    9. 중간 수준에서 파라 포름 알데히드 펌프를 켜고 얼음처럼 차가운 4 % 파라 포름 알데히드는 30 분 동안 동물을 관류 할 수 있습니다.
    10. 관류 악기를 제거하고 동물의 목을 벨. 두개골의 정중선을 통해 절단 후 전방을 확인하고 두개골 캐비티 (10)를 노출하는 두개골 플랩.
    11. 두개골 캐비티에서 주걱으로 뇌를 제거하고 25 ml를 4 % 파라 포름 알데히드를 포함하는 50 ML의 원심 분리기 튜브에 두뇌를 놓습니다. 24 시간 동안 4 ºC 냉장고에서 파라 포름 알데히드 함유 튜브 내 뇌를 유지합니다.
    12. 3 일 4 ºC에서 30 % 자당 용액 25 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 원심 분리 튜브로 이동 뇌. 마지막으로, 사용까지 -80 ° C에서 비닐 봉지 내 뇌를 저장합니다.
    13. 내장 미디어 척에 두뇌를 탑재하고 -26 ºC의 온도에서 저온 유지 장치에 뇌가 포함 된 내장 미디어를 동결. 신선한 동결을 잘라n 개의 20 μm의 섹션으로 뇌와 10 μm의 섹션으로 뇌를 파라 포름 알데히드는-접두사. 섹션에 슬라이드를 터치하여 RT 현미경 슬라이드에 섹션을 전송합니다.
    14. 공기 건조 4 시간 동안 실온에서. 사용까지 -80 ° C에서 꽉 밀봉 된 봉투에 섹션 슬라이드를 저장합니다.
  2. 탈수
    1. -80 ° C의 냉동고에서 슬라이드를 타고 1 ~ 3의 시험에 섹션을 할당합니다 HT2A, ppiB (양성 대조군) 또는 dapB (음성 대조군); 마크와 공 펜 라벨 섹션 (연필을 사용하지 마십시오). 5 분 동안 실온에서 100 % 알코올에 슬라이드를 담근다. 흄 후드에서 5 분 동안 슬라이드를 건조.
  3. 전처리
    1. 피펫 슬라이드 부분에 전처리-1 시약 20 μL (알칼리 포스 파타 아제의 불 활성화). 수분 트레이 선반 레일에 슬라이드를 배치 (트레이 반응 solutio로부터 증발을 방지하기위한 높은 습도를 유지하는 덮개로 덮여 있음에 유의N).
    2. 조심스럽게 10 분 동안 저속으로 수평 통에 습기 트레이를 흔들. 2 분 동안 두 번 증류수 (DDH 2 O)로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. (파라 포름 알데히드 고정에 의한 가교 결합의 파괴) -2- 전처리 시약을 150 ㎖을 함유하는 200 ml의 비이커에 슬라이드를 담근다. 100 ºC (RNA 구조 (11)의 열 - 유도 복원)에서 5 분의 총 슬라이드를 끓인다.
    3. 2 분 동안 DDH 2 O로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. 5 분 동안 100 % 알코올에 슬라이드를 놓습니다. 흄 후드에서 5 분 동안 슬라이드를 건조. 조직 섹션에서 선택된 영역 주위에 원을 그릴 소수성 펜을 사용하여 (예를 들어, 그림 2에 설명 된대로 시상과 시상 하부를 포함한 비 대뇌 피질의 구조).
    4. 피펫 전처리-3 시약 선택한 각 영역 (프로브 침투의 증가)의 10 μL, 그리고 뚜껑 수분 트레이 커버. 하이브리드 오븐에서 트레이를 배치수평 교반기 장착 40 ºC 오븐 온도를 설정; 부드럽게 30 분 동안 트레이를 흔들. 2 분 동안 DDH 2 O로 두 번 슬라이드를 씻으십시오.

2. 하이브리드 및 증폭

  1. 피펫 선택된 영역에 각각 htr2a, ppiB 및 dapB 프로브 시약 10 μL,,. 시약의 증발을 방지하기 위해 뚜껑 수분 트레이 커버. 부드럽게 저속으로 설정 수평 진탕 기에서 흔들어. 2 시간 동안 오븐에서 40 ºC에서 슬라이드를 배양한다.
  2. 2 분 동안 세척 버퍼로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. 피펫 선택한 각 지역의 증폭-1 시약 10 μL, 흔들어 30 분간 40 ºC에서 슬라이드를 품어.
  3. 2 분 동안 세척 버퍼로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. 피펫 선택한 각 지역의 증폭-2 시약 10 μL, 흔들어 15 분 40 ºC에서 슬라이드를 품어.
  4. 두 번 W 슬라이드를 씻으2 분 동안 세척 버퍼 번째. 피펫 선택한 각 지역의 증폭-3 시약 10 μL, 흔들어 30 분간 40 ºC에서 슬라이드를 품어.
  5. 2 분 동안 세척 버퍼로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. 피펫 선택한 각 지역의 증폭-4 시약 10 μL, 흔들어 15 분 40 ºC에서 슬라이드를 품어.
  6. 2 분 동안 세척 버퍼로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. 피펫은 각각의 선택된 영역 상에 증폭 -5- 시약 10 μL, 진탕​​하고, 30 분간 RT에서 슬라이드를 배양한다.
  7. 2 분 동안 세척 버퍼로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. 피펫 선택한 각 지역의 증폭-6 시약 10 μL, 흔들 실온에서 15 분 동안 슬라이드를 품어. 2 분 동안 세척 버퍼로 두 번 슬라이드를 씻으십시오.

3. 신호 감지

  1. 각 선택 영역에 레드 시약의 피펫 10 μL은 (시약 레드-B와 레드의 혼합물이 1:60 비율로 내가 사용되어야합니다mmediately). 실온에서 수평 통에 습기 트레이에 슬라이드를 삽입하고 10 분 동안 저속으로 부드럽게 흔들어.
  2. 10 분 동안 (DDH 2 O)로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. 15 분 동안 오븐에서 60 ºC에서 슬라이드를 건조. 5 분 흄 후드에서 크실렌의 슬라이드를 놓습니다. 피펫 (20) 선택한 각 지역에 크실렌 기반 설치 미디어의 μL 및 커버 슬립 커버.

4. 이미지 캡처

  1. 4 × 20 × 대물 렌즈의 배율 선택 영역 (예, 시상 하부는, 1과 3도)의 디지털 현미경 사진을 가져 가라. 이미지 파일을 저장합니다.

5. 이미지의 입자 분석

  1. 드래그하여 주 ImageJ에 창에 이미지 파일을 놓습니다. 메뉴 표시 줄로 이동하여 '이미지'를 선택, 다음 드롭 다운 메뉴에서 '형식'을 선택하고 '8 비트'를 선택합니다.
  2. 선택한 다음 '의 Thr를 선택,'조정 'eshold은 '대화 상자를 엽니 다. 원치 않는 배경이 제거되도록 대화 상자에서 낮은 바 값을 조정합니다. 다음 두 번째 대화 상자를 엽니 다 '입자 분석'을 선택, 메뉴 표시 줄로 이동하여 '분석'을 선택합니다.
  3. (10)에서 입자 크기를 설정, 다음 '쇼 개요'를 선택하고 '결과 표시'와 '요약한다'상자를 선택합니다. 마지막으로, 대화 상자에 입자 데이터를 볼 수있는 '확인'을 클릭합니다.

6. 스프레드 시트 계산

  1. 엑셀 시트에 데이터를 입력하고 기준으로 SAL 그룹에 입자의 수​​를 평균. 각 섹션의 백분율 레벨을 계산하고 그에 따라 그래프 (도 4)를 만든다.

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결과

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올리고 뉴클레오티드 RNA 프로브 (<25 NT)를 사용하여, 하이브리드는 파라 포름 알데히드 - 접두사 및 냉동 뇌에서 준비 시상 하부 세포에서 빨간 점으로 검출 할 수있다. htr2a mRNA의 분자 (실선 화살표로 표시됨) 일부 셀에 존재하는, 그러나 기타 (개방 화살표). 우리는 파라 포름 알데히드 접두어 및 냉동 조직 (도 1) 사이에 차이가없는 것을 관찰했다. 성공적인 하이브리드는 육안 (그림 2)에 의해 처음으로 평가 될 수있다. 우리는 dapB 프로브와 하이브리드 (원 표시) 선택된 영역이 육안 (도 2A-B)에 보이는 신호를 표시하지 않은 것으로 나타났다. 대조적으로, ppiB 프로브와 하이브리드 영역은 균일하게 조사 영역 (도 2C-D)에 걸쳐 분산 신호를 보여 주었다. htr2a 테스트 중에, 신호는 화살표로 나타낸 특...

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토론

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in situ hybridization 테스트의 주요 관심사 중 하나는 RNase 효소로 인해 RNA 보존에 사용되는 적절한 기술을 선택하는 것입니다. 이러한 효소가 결과에 영향을 미칠 수 있는 세포와 환경에 널리 존재한다는 것은 잘 알려져 있습니다. 그러나 효소 활성은 조직을 드라이아이스/알코올 용액에 넣음으로써 빠르게 구별할 수 있습니다5,12. 리보프로브13를 사용한 혼성화에는 빠른 보존이 중요하지만 올리고뉴클레오티드 프로브의 실험 조건에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 이 연구에서 우리는 얼음/알코올 용액에 빠르게 보존된 파라포름알데히드 접두사가 붙은 신선한 뇌와 사이에 차이가 없음을 발견했습니다. 이는 파라포름알데히드 접두사가 붙은 뇌 RNA가 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 혼성화의 품질에 유의미한 영향을 미치지 않았음을 시사합니다. 접두사가 붙은 뇌는 신선한 뇌에 비해 쉽게 절편되기 때문에 이 프로토콜은 혼성화 테스트를 ...

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공개 사항

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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

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본 연구는 NIH 보조금 (R15DA029863)에 의해 지원되었다, 플로리다 애틀랜틱 대학의 학부 연구 보조금 (M30014) 및 동물 용 의약품의 연구 보조금의 로스 대학. 우리는이 일을 위해 (±) 3,4-methylenedioxymethamphetamine (± MDMA)를 제공하는 국립 약물 남용 연구소 (락빌, MD)에 감사의 말씀을 전합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
RNAscope 음성 대조군 프로브-DapB고급 세포 진단, INC310098
RNAscope 전처리 4고급 세포 진단, INC320046
RNAscope 2.0 HD 시약 키트 - 빨간색고급 세포 진단, INC310036
RNAscope 프로브 - Rn-Ppib고급 세포 진단, INC313921
쥐 Htr2a고급 세포 진단, INC300031
CryostatLeicaCM 1850
수평 셰이커VWR88032-088
하이브리드화 오븐Thermo Fisher Scientific222000
Superfrost Plus 현미경 슬라이드Fisher Scientific12-550-15
소수성 펜벡터H-4000
현미경OlympusProvis AX70

참고문헌

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  2. Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA. Heart Lung. 43, 117-119 (2014).
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  17. Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action. Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).
  18. Reneman, L., et al. The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human. 26, 387-396 (2002).

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