매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석법(MALDI-TOF MS) 및 분자 기술(16S rRNA 유전자 염기서열 분석)을 통해 일상적인 진단에서 희귀 박테리아 병원체를 식별할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표는 보다 정확하고 신뢰할 수 있는 데이터를 제공하는 두 기술의 조합에 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
특히 면역 환자에서 심각한 감염을 일으킬 것으로보고되고 있으므로, 충분히 설명 된 희귀 세균성 병원체가 있습니다. 대부분의 경우 보고서로 게시 대부분의 경우 단지 몇 데이터,에서, 감염원과 같은 병원균의 역할을 조사 할 수 있습니다. 따라서, 병원성 미생물의 특성을 명확하게하기 위해, 이들 박테리아의 다수를 포함 역학 조사를 수행 할 필요가있다. 균주의 확인은, 그들이 루틴 진단 (견고성) 취급하기 쉽고 경제적이어야 유효 명명법에 따른 정확성을 가지며, 이들은 비교 생성 할 : 이러한 감시 연구에서 사용되는 방법은 다음 조건을 만족해야 다른 실험실 중 결과. 일반적으로, 일상적인 환경에서 박테리아 균주를 식별하기위한 세 가지 전략이있다 같습니다 biochemica의 특성 1) 표현형 식별박테리아 L 및 대사 특성 2) 신규 프로테옴 기반 접근법으로서 16S rRNA 유전자 서열 3) 질량 스펙트럼 분자 기법. 질량 분석 및 분자 접근법 박테리아 종의 많은 종류를 식별하기위한 가장 유망한 도구이기 때문에, 이러한 두 가지 방법이 설명된다. 이러한 기술을 사용하여 진행 제한 및 잠재적 인 문제가 논의된다.
서론
일상적인 진단에 드문 병원체의 안전 확인은 고전 문화와 생화학 적 방법이 복잡하고 때로는 의심 있다는 사실에 의해 방해된다. 또한, 진단 미생물학 연구소는 자동화 된 시스템의 사용을 필요로 매일 수천에 수백에 이르는 병원균 다수, 처리한다. 높은 일일 처리량의 관리뿐만 아니라, 박테리아 종의 정확한 식별은 필요하다. 그들은 자신의 항균제 감수성 패턴에 차이가 있으므로 올바른 식별 적절한 항생제를 선택하는 중요한 정보 (예를 들어, 엔테로 종., 된 Acinetobacter 종.) 12,43와 임상의를 제공하기 때문에이 보증합니다.
자동 미생물 식별 시스템 (AMIS)는 박테리아 균주의 대사 특성을 특성화하기 위해 효소 반응의 표준 세트를 적용 13,15,16,26,27. 이러한 시스템에 사용되는 카트리지는 다양한 생화학 적 반응의 다수, 예를 들어, 52이 연구에 사용 된 AMI의 GN 카드 (47) 만 세균 제한된 전략이 허가 보안 ID를 이용하더라도. 또한, 데이터베이스, 고급 전문가 시스템은 명확 의학적 중요성 13,15,16,36의 관련성 관련성 세균의 검출에 초점을 맞추고있다. 널리 실험실에서 사용....
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프로토콜
세균 DNA의 추출 (1)
- PBS 용액의 조제
- 1.65 g을 플라스크에 2 HPO 4 × 2H 2 O, 0.22 g의의 NaH 2 PO 4 × 2H 2 O 및 8.80 g의 NaCl 나 무게 1,000 ML의 최종 볼륨에 증류수로 채운다. 7.4 pH를 조정합니다. 최종 사용하기 위해 박테리아 방지 (0.22 μm의) 필터를 통해 솔루션을 필터링 할 수 있습니다.
- DNA의 추출 그람 음성균
- 킬 적절한 배양 배지 (예를 들어, 컬럼비아 혈액 한천)에 환자 소재, 식별하고 잠재적 인 병원균을 격리 할 것.
- 순수 배양을 준비하고 순서 morphotype를 결정하고 순도를 확인하고 문화 (49)에 그람 염색을 수행합니다.
- 단일 세균성 식민지를 선택하고 1 ml의 PBS 용액을 포함하는 멸균 2.0 ml의 반응 관에 1 μl의 단일 사용 접종 루프로 전송합니다.
- thermomix이 현탁액을 품어10 분 동안 95 ° C에서 어. 부화 후, 실온으로 냉각 세균 추출물 (용해 된 DNA를 포함)을하자 하나 더 사....
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결과
MALDI-TOF MS는 소설, 미생물 일상적인 진단을위한 신속하고 저렴한 방법입니다. MALDI-TOF MS에 의해 세균 종 식별이 주로 리보솜 단백질뿐만 아니라 다른 "환경 조건에 의해 최소한의 정도에 영향을 집 유지 기능을 가진 매우 보존 된 단백질"로 구성 스펙트럼을 생산하는이 MMIS의 17 국지적 인 데이터베이스는 기준 스펙트럼의 큰 집합을 포함 거의 임상 분리에서 찾을 수없는 경우에도 박테리아가 안전하게 7,56,57를 식별 할 수 있습니다. 스코어 값은 식별 된 종의 신뢰성을 나타낸다. 2.300 위의 점수는 가능성이 매우 높은 종 식별을 나타내고, 2.000과 2.300 사이의 점수가 보안 종 식별을 표시하는 가능성 종 식별을위한 1.700과 2.000 스탠드 사이의 점수와 1.700 이하의 점수가 아닌 신뢰할 수있다. 둘 이상의 종의 경우 2.000 추가 TES 상기 점수로 식별되고TS는 적용 .......
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토론
MALDI-TOF MS 및 16S rRNA 유전자 서열은 모두 다른 박테리아의 다수를 식별 할 수있는 가능성을 제공한다. MALDI-TOF MS는 처리하고 세균 질량 스펙트럼의 대형 데이터베이스를 사용할 수있는 용이 한 빠르고 저렴한 방법입니다. 이러한 이유로, MALDI-TOF MS 희귀 세균성 병원균 17,20,39,51 집중 스크리닝 연구를 수행하기 위해 신속하고 비용 효율적이며 신뢰할 수있는 방법이다. 다른 표현형 식별 방법, 셍 등. 입증 비용 효율성 및 MALDI-TOF MS 59 탄의 속도로 MALDI-TOF MS를 비교하는 전향 적 연구에서 등. 자신의 실험실 환경에서 박테리아 식별을위한 시약과 노동 비용의 감소를보고 매년 62 56.9 %로. 이러한 비용 절감은 Gaillot 등의 등의 메모에 의해 지원된다. (28)
.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 Enno Jacobs 교수의 지속적인 지원에 감사드립니다.
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재료
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| QIAamp DNA Mini Kit (250) | Qiagen, Hilden, Germany | 51306 | |
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참고문헌
- Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. (2010).
- Ch. 5. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. 81-104 (2010).
- Adekambi, T., Drancourt, M., Raoul....
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재인쇄 및 허가
