신경생물학에서는 인간 뉴런에서 생체 내에서 일어나는 일에 대한 번역 모델 역할을 하는 신뢰할 수 있고 복제 가능한 체외 시스템을 보유하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포를 in vitro 응용 프로그램에 사용할 수 있는 생존 가능한 뉴런으로 배양하고 분화하는 방법을 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
인간 질병에 대한 번역 모델을 제공하는 적절한 생체 내 및 체외 시스템을 갖추는 것은 신경 생물학 및 신경 과학 연구의 필수적인 측면입니다. 신경생물학에 사용되는 전통적인 체외 실험 모델에는 쥐와 생쥐의 1차 신경 세포 배양, 쥐 B35 및 마우스 Neuro-2A 세포를 포함한 신경모세포종 세포주, 쥐 PC12 세포 및 단기 슬라이스 배양이 포함됩니다. 많은 연구자들이 이러한 모델에 의존하고 있지만 인간 구성 요소가 부족하고 관찰된 실험 효과는 각 종에만 국한될 수 있으며 인간에서 동일하게 발생하지 않을 수 있습니다. 또한 이러한 세포는 뉴런이지만 불안정한 핵형을 가질 수 있어 유전자 발현 연구 및 세포 신호전달에 대한 재현 가능한 연구에 사용하는 데 문제가 있을 수 있습니다. 따라서 인간의 신경 질환에 대한 보다 일관된 모델을 개발하는 것이 중요합니다.
다음 절차는 염색체가 안정적인 인간 신경모세포종 세포주인 SH-SY5Y를 분화하여 균일하고 생존 가능한 인간 신경 배양을 얻기 위한 따르기 쉽고 재현 가능한 방법을 설명합니다. 이 방법은 앞서 설명한 여러 방법1-4를 통합하고 배지에서 혈청을 순차적으로 제거하는 것을 기반으로 합니다. 타임라인에는 점진적인 혈청 결핍이 포함되며, 세포 외 기질 단백질과 신경 영양 인자(neurotrophic factor)가 도입되었습니다. 이를 통해 뉴런은 분화할 수 있고 상피 세포는 선택되어 균질한 뉴런 배양이 가능합니다. 대표적인 결과는 SH-SY5Y 신경모세포종 세포가 초기 상피와 같은 세포 표현형에서 보다 광범위하고 분지된 신경 표현형으로 성공적으로 분화되었음을 보여줍니다. 이 프로토콜은 후속 생화학 및 분자 분석에 사용할 수 있는 균일한 신경 배양 집단을 생성하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공하며, 이는 연구자에게 인간 감염 및 질병에 대한 보다 정확한 번역 모델을 제공합니다.
서론
시험 관내 모델 시스템에 사용하는 능력은 크게 신경 생물학 및 신경 과학 분야를 강화하고있다. 배양 세포가 감염 질병의 병리를 이해하고, 예비 약물 시험 평가를 수행하는 단백질의 기능 및 분자 기전 특정 현상을 특징 효율적인 플랫폼을 제공한다. 신경 생물학에서 세포 배양 모델의 주요 유형은 쥐 B35 세포 5 신경 2A 마우스 세포 6, 랫트 PC12 세포는 7 쥐 및 신경 아세포종 세포주 유래의 주요 신경 배양 물을 포함한다. 이러한 세포주의 사용이 크게 필드 진행 하였지만, 비 - 인간 세포 및 조직 처리와 연관된 여러 교란 요인이있다. 인간과 비교했을 때 이러한 이해 종 특이 대사 과정의 차이, 질병 증상 및 발병 기전의 표현형을 포함한다. 이 점에 유의하는 것이 중요하다설치류 모델 제약 경로는 설치류와 인간 사이에서 보존되는 8-11 이해 중요성 강조 마우스 및 인간의 유전자 발현 및 전사 인자 신호 사이에 상당한 차이가 다시한다. 기타 N-테라 -2- (NT2) 인간 기형 암종 세포주 유도 성 및 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 포함한 인간 신경 세포 라인의 사용을 채용 하였다. 이 세포주는 체외 인간의 시스템에 대한 좋은 모델을 제공합니다. 그러나, ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 일반 고려 사항
- 필요한 시약의 목록을 재료 / 장비의 표를 참조하십시오. 엄격한 무균 조건 하에서 모든 단계를 수행합니다.
- FBS를 포함하는 모든 미디어 준비에 대한 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (hiFBS)를 사용합니다. 열 - 불 활성화, 10 분마다 반전, 30 분 동안 56 ° C에서의 FBS 50 ㎖ 분취 량을 따뜻하게 (또한하기 표 1 참조).
주 : FBS가 열 불 활성화없이 사용하는 경우에는, 상피 같은 표현형 SH-SY5Y 세포의 배양에 걸쳐보다 빠르게 진행한다. - 사용하기 전에는 미디어가 따뜻하게 모든 단계 전에 적절한 산도 균형을 설정하는 인큐베이터에서 평형 수 있습니다. 예를 들어, 매체의 50 ㎖ 완전히 평형을 약 1 시간 소요 (pH가 7, 37 ° C, 5 % CO 2).
주 :이 프로토콜은 트립신 처리하고 다시 도금 될 편미분 SH-SY5Y 세포를 필요로하는 두 단계의 분리 방법을 사용한다. 이것은 스트레스이러한 매우 깨지기 쉬운 세포에 대한 처리. 따라서, 최소의 시간 트립신에 세포를 배양 중요하다. 이것은 여전히 접시에 부착 된 상피 - 유사 세포를 떠나, 신경 세포의 특혜 리프트 오프 (....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
현재, 이러한 흡수되어 최적 바이러스 2와 같은 획일적 인 SH-SY5Y 세포는 중요한 미분화 세포가 부족할 수 인간 뉴런 27-36, 표현형 및 기능에 대한 모델로서 사용되는 신경 생물학 및 neurovirology 분야의 많은 경우가있다 정확한 해석을 위해 필요한. 이 체외 신경계를 SH-SY5Y 세포를 사용하거나 다른 어떤 경우에는, 세포가 적절하게 생체 내에서 뉴런에서 발생 될 것인가의 최상의 표현 된 데이터를 획득하기 위하여, 신경 세포로 분화되는 것이 중요하다. 이후 생화학 및 이미징에 사용할 수 있습니다 십팔일 내에서 매우 실용적, 균질, 차별화의 연결을 문화 위의 프로토콜 금리는 분석한다. 미분화 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포는 (그림 2A) 외측으로 연장 다수의 짧은 프로세스와 대형 평면, 상피 같은 표현형을 보여 분화 된 세포 동안들 주변의 세포 (그림 2B)에 연결하는 여러.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
위의 프로토콜은 균일하고 가능한 인간의 신경 세포 문화를 생성하는 간단하고 재현성있는 방법을 제공한다. 이 프로토콜은 기술과 각각의 모범 사례를 서술하는 데 몇 이전에 발행 된 방법 1-4과 목표를 통합하는 방법을 사용합니다. SH-SY5Y 세포의 분화는 점진적으로 혈청 부족에 의존; 레티노 산, 향 신경성 인자 및 세포 외 기질 단백질의 첨가; 시리얼 분할 차별화 성숙한 부착 뉴런 선택합니다. 이 세포주는 현탁과 부착 세포의 이종 집단으로 시작한다. 이 프로토콜은 계대 또는 매체 변경 전에 PBS 세척 원천으로 두 집단을 유지하는 것을 목표로하지만, 부유 세포의 일부 손실이 데드 상피 세포의 제거를 허용 할 필요가있다. 제시된 방법은 실험을위한 차별화 된 인간의 SH-SY5Y 신경 세포의 균일 한 인구를 생성합니다.
인접 해 있지만R 에이전트 또는 콜린성 아드레날린 표현형 16,17 뉴런으로의 분화를 유도하는 데 사용될 수 RA의 사용.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
SH-SY5Y 분화를 위한 조건을 최적화하는 데 Yolanda Tafuri의 기여와 이 작업을 시작한 실험실의 Lynn Enquist 박사의 지원에 감사드립니다. Y. Tafuri는 그림 3에 표시된 이미지를 제공했습니다. 이 작업은 NIH-NIAID ViPR(Virus Pathogens Resource), MLS 및 L. Enquist(Bioinformatics Resource Center) 및 MLS(K22 AI095384)의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| B-27 | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | 준비에 대해서는 Table 1를 참조하십시오 |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10 μ g)/B3795 (5 μ g) | |
| 준비 dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | <>표 1<> 참조 |
| 준비 DMSO | ATCC | 4-X-Minimum | |
| Essential Medium Eagle (EMEM) | Sigma | M5650-Fetal | |
| Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | 준비는 표 1 참조 |
| GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061-Glutamine | |
| Hyclone | SH30034.01-Potassium | ||
| Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | 준비는 표 1 참조 |
| MaxGel 세포외 기질(ECM) 용액 | Sigma | E0282 | 프로토콜 |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049-Penicillin | |
| /Streptomycin (Pen/Strep) | Life Technologies | 15140-122-Retinoic | |
| acid (RA) | Sigma | R2625 | C 이 시약은 빛에 민감하기 때문에 |
| SH-SY5Y 셀 | ATCC | CRL-2266-0.5 | |
| % 트립신 + EDTA | Life Technologies | 15400-054-Falcon | |
| 35mm TC 접시 | Falcon (코닝 브랜드) | 353001 | - |
참고문헌
- Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
- Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
