이 프로토콜은, 해부 실험 조작과 닭의 배아에서 문화 전체 망막 외식하는 방법을 설명합니다. 높은 성공률, 효능 및 재현성은 전기 및 / 또는 시약의 물질, 즉, 효소 억제제 플라스미드의 효과를 테스트하기 위해 필요할 때 이식편 배양 물은 유용하다.
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이 논문에서
요약
초록
망막은 개발 중추 신경계에 대한 좋은 모델입니다. OVO / 생체 내에서 실험 조작에 대한 눈의 큰 규모와 가장 중요한 것은 접근성은 닭 배아 망막 다양하고 매우 효율적인 실험 모델을 만든다. 닭 인공 망막은 주사 또는 일렉트로 포 레이션에 의한 오보 타겟팅하기 쉽지만, 망막 내의 시약의 정확한 농도 및 효과가 충분히 제어하는 것이 어려울 수있다. 이것은 눈 또는 물질의 요철 확산에서 정확한 주사 부위, 누설의 변화에 기인 할 수있다. 또한, 이러한 전기 천공 등 침습적 조작 후 기형 및 사망률의 주파수는 다소 높다.
이 프로토콜은 닭의 배아에서 전체 망막 외식을 배양하기위한 기술 비켜 예를 설명하고 시약에 망막의 제어 노출하는 방법을 제공한다. 프로토COL은 실험적으로, 해부 조작하고, 닭의 배아에서 문화 전체 망막 외식하는 방법에 대해 설명합니다. 이식편은 약 24 시간 동안 배양 될 수 있으며, 이러한 전기 천공과 같은 다른 조작을 실시한다. 주요 장점은 실험 배아의 생존 및 도입 시약의 농도가 다양하고 효과적인 농도를 결정하고 최적화하기 위해 제어 될 수 의존하지 않는 것이있다. 또한, 기술은 높은 실험 성공률과 함께 신속한 저렴하고, 그것을 재현 보장 결과. 그것은 비켜에서 수행 실험에 훌륭한 보완의 역할을 강조한다.
서론
망막은 중추 신경계의 일부이며 그 단순함과 잘 특성화 셀룰러 아키텍처, 중추 신경계 발달을 연구하기위한 인기있는 모델이다. 닭 배아의 눈은 배아의 나머지 부분에 비해 상대적으로 크다. 따라서 이러한 주사 또는 전기로 실험 조작에 대한 OVO에 쉽게 접근 할 수 있으며, 망막 세포와 생체 내에서 발생 생물학에 대한 지식을 얻을 수있는 훌륭한 도구 역할을한다. 실험 electroporations, 반복 주사, 또는 결합 된 실험 조작과 같은 침략 때 이러한 주요 장점에도 불구하고, 배아의 생존율이 낮을 수있다.
OVO에서 닭 배아에 DNA 플라스미드의 전기가 중요하고 잘 확립 된 기술 1입니다. 그것은 중앙 NERV에서 세포의 운명뿐만 아니라 신경 책자의 추적, 뉴런의 표시를 허용시스템의 OU하며 생체 내에서 단백질의 기능 분석 이소성 유전자 발현을 허용한다. 이 기술은 3 후뇌, 4 망막 신경 튜브 (2)의 연구에 사용되었다. OVO의 배아 망막의 전기는 생체 내 상황에 관련된 몇 가지 실험적인 어려움이있다. 태아의 뇌 폴딩으로 인한 눈의 위치, 중심에 비교적 가깝다.....
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프로토콜
이 프로토콜은 "비전과 안과 연구 협회의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 가이드"의 권장 사항에 따라 수행된다.
1. 계란 취급과 눈 모음
- 일주보다 더 이상에 대해 12 ~ 14 ℃에서 흰색 레그혼 계란을 저장합니다. 가능한 경우, 수정란을 저장하는 냉장 와인 쿨러를 사용한다.
참고 : 낮은 온도가 사망률을 증가하면서 높은 저장 온도, 태아의 이상 개발로 이어집니다. 확장 된 저장 시간은 사망률과 이상 발생시 모두 증가. - 부드러운은 24 시간 당 5 배의 주파수에서 락으로 37.5 ° C 계란 60 % 가습 계란 인큐베이터를 품어.
- 원하는 배아 나이에 계란 인큐베이터에서 배양 알을 제거합니다.
주 : 닭 배아의 연령은 인큐베이션 시간으로 결정되고, 배아 일 (E) 또는 단계로 표시된다 (세인트을), 햄버거 해밀턴 (12)에 의해 설명 된 발달 단계의 일련의 제조 방법. - 층류 후드에서 선택한 알을 놓습니다. 배아의 오염을 방지하기 위해 70 %의 에탄올로 달걀 껍질을 닦습니다.
참고 : 멸균 솔루션을 무균 상태에서 모든 절차를 실시 https://www.jove.com/science-education/....
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결과
이 프로토콜은 닭의 배아에서 전체 망막 외식의 준비 (그림 1A-F)과 배양에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 성공적으로 ST31에 ST20 (E3)의 배아에서 전체 망막 외식 (E7) 사용되어왔다.
전체 망막 이식편으로 플라스미드 DNA의 전기 망막 전구 세포의 표지 및 추적 또는 과발현 다른 유전자 생성물의 허용한다. 전기 실험의 경우, 색소 상피 신중 ST25 (E4 ½) 배아의 세포핵이 제거 된 눈에서 제거되었습니다. 전체 망막 이식편이어서 플라스미드 DNA 용액을 함유하는 큐벳에 넣고, 전극 (도 2A) 침지하고, 전류를인가 하였다. 배양 24 시간 후, GFP 양성 세포가 망막 손상 (도 2b)의 큰 부분에서 볼 수 있었다. 단면 처리 한 후, 단일 세포를 GFP + 쉽게 망막 apico - 기저 축 (FI 따라 검색된gure 2C). 전기 큰 .......
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토론
이 작품에서 해부, 전기 또는 화학 처리, 닭 배아에서 전체 망막 외식의 배양을위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 빠르고 용이하고 모두 높은 성공률을 허용하고 재현성 결과.
전체 망막 이식편의 전기 천공은 관심 유전자 구조를 발현하는 세포의 큰 영역을 생성한다. 올바르게 전극을 배치하고, 정의 된 플라스미드 DNA 농도 망막의 특정 부분을 노출시키기 쉽다. 이 접근법은 오보에 electroporations에 비해 일반적으로 더 높은 성공률과 망막에서 유전자 기능을 연구하기위한 신뢰할 수있는 방법을 허용한다. 전체 망막 이식편도 가능주는 화학 시약의 규정 농도를 함유하는 배지에 망막을 노출 할 수있다 신경 망막에서 시약의 균일 한 분포. 프로토콜 조합을 허용망막은 제 물질로 처리 한 다음 일렉트로되고먼트. 처리 및 제어 눈 모두 동일한 배아로부터 수집 될 수 있고, 독립적으로 처리 이.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond 및 St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1xPBS (태블릿) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10x DPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm 페트리 디쉬 | VWR | 734-0006 | |
| 100 μ l 피펫 팁 | VWR | 613-0798 | |
| 1.5ml 일회용 플라스틱 큐벳 | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24웰 플레이트 | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35mm 페트리 접시 | VWR | 391-1998 | |
| 70% 에탄올 | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 억제제 III | 217714 | Calbiochem | 300nM in 0.01% DMSO |
| 세포 배양 인큐베이터 | Thermo Forma | ||
| 해부 현미경 | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| 전극 | 플라티나, 맞춤형 | ||
| 전기 사각 포레이터 ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 영양소 혼합 | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| 냉동 매체 NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP 발현 DNA 플라스미드(pZG) | |||
| 가습 인큐베이터 | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| 인슐린 | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| 마운팅 매체 ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| 파라핀 필름 | VWR | 291-1214P | |
| 파라포름알데히드 | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way 임베딩 몰드 | 시그마 알드리치 | E6032 | |
| 페니실린 스트렙토마이신 | 생명 기술 | 15140-122 | |
| 포스포히스톤 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | 희석 1/4,000 |
| 플래티넘 전극 ("론델레"로 맞춤 제작) | Sargenta | 390-R (론델러) | Dia: 4mm, 0.1 mm 두께 |
| Platimun 전극 | Sonidel | CUY700P4L | Dia : 4mm |
| 폴리에틸렌 파스퇴르 피펫 | VWR | 612-2853 | |
| 로테이터 셰이커 | VWR | 444-2900 | |
| 작은 숟가락 | VWR | 231-2151 | |
| 설탕 | VWR | 443815S | |
| 화이트 레그혼 달걀 | 현지 공급 업체 | ||
| 와인 쿨러 | WineMaster 24, Caso, 베를린 독일 |
참고문헌
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
- Nakamura, H., Funahashi, J.
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