AC-6 공급 시스템을 사용하여 일반 림프 전구 세포에서 쥐 형질 수지상 세포의 체외 세대

요약

이 연구에서는 Flt3 리간드가 있는 상태에서 AC-6 공급세포와 공통 림프구 전구세포를 공동 배양하여 pDC를 효율적으로 생성할 수 있는 체외 배양 시스템을 제시합니다.

초록

형질 수지상 세포 (올라가고은) 내가 감염 또는 염증 반응 동안 응답 활성화 (IFN-1) 생산 세포를 인터페론 강력한 유형입니다. 불행하게도, PDC 기능의 연구는 림프 기관에 낮은 주파수에 의해 방해하고, 체외 DC 생성을위한 기존의 방법은 주로 올라가고 이상 CDCS의 생산을 선호. 여기에 우리가 효율적으로 체외에서 일반적인 림프 전구 세포 (CLP를)에서 올라가고을 생성하는 독특한 접근 방식을 제시한다. 특히, 프로토콜은 골수로부터 CLP를 정화 및 FLT3 리간드의 존재하에 γ 조사 된 AC-6 피더 세포와 공동 배양함으로써 PDCS를 생성하는 방법을 자세히 설명했다. 이 문화 시스템의 고유 한 특징은 CLP를가 AC-6 세포 아래 마이그레이션 및 조약돌 영역 형성 세포, PDC의 확장을위한 중요한 단계가 될 것입니다. 형태 학적으로 별개의 수지상, 즉 올라가고 및 CDCS는 7 조성 후 약 2 주 생성 된최적 조건 하에서 0-90%의 PDCS. 일반적으로이 방법에 의해 생성 PDCS의 수는 대략 CLP를 시딩 수의 100 배이다. 따라서, 이것은 견고 이들 세포의 발달 및 기능에 추가 연구를 용이하게하기 위해 필요한 PDCS의 다수를 생성되는 신규 한 시스템이다.

서론

수지상 세포 (DCS)는 면역 반응 ^1을 제어하는데 중요한 역할을 전문 항원 제시 세포이다. DC가 이종 있지만, 그들이 대체로 두 집단으로 분류 될 수 있고, 종래의 DC (CDCS) 및 형질 수지상 (PDCS) ^2,3-. 림프 기관 외에 CDCS 및 PDCS 또한 폐, 소장, 피부 ^(2)를 포함한 조직에서 발견된다. CDCS 및 올라가고의 형태는 수상 돌기 모양의 돌기보다 형질 세포가 같은 것을 올라가고의 모양을 나타내는 CDCS으로 다르​​다. 또한, 일반적인 마우스 DC 마커, CD11c 양성은 더 높게 올라가고보다 CDCS에 표현된다. 올라가고 ^2보다 MHC 클래스 II의 높은 수준과 보조 자극 분자를 표현 둘 CD24 ⁺ CDCS, ^- CDCS와 CD11b를 ^- 또한, CDCS는 더는 CD11b ⁺ CD24로 나눌 수 있습니다. 성숙한 PDCS는 반면에, 선택적 Siglec-H 및 BST2 ^4를 발현하는 것으로 나타났다. 에프unctionally, CDCS는 올라가고보다 제시 세포보다 항원은; 그러나 올라가고 내가 바이러스 감염이나 염증 자극 ^5시 인터페론 유형의 광대 한 양을 생성 할....

프로토콜

C57BL / 6 야생형 마우스 국립 실험 동물 센터 (NLAC), 대만에서 구입 하였다. 모든 마우스는 사육 및 특정 병원균이없는 상태에서 유지되었다. 프로토콜 및 동물 사용 절차를 검토하고 의학의 국립 대만 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (허가 번호 : 20120075)에 의해 승인되었다. 또한, 연구진은 실험을 수행하는 동안 동물에 고통, 고통, 또는 고통의 가능성을 줄이기 위해 모든 노력을했다. 장갑을 착용하는 동안 설명하는 모든 절차는 실온에서 수행되었다.

AC-6 피더 세포의 제조 (1)

주 : AC-6.21 (AC-6 짧은) (I. 와이즈맨, 스탠포드 대학에서 제공) 기질 세포 라인 ^{(18)하는 것은} RPMI에서 유지되어야는 15 % 열 - 불 활성화 된 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충. 피더 세포의 역할을하기 위해, AC-6 세포-γ 조사 3,000 방사선 (30Gy) 자신의 확산을 방지하기 위해 공동 문화 전에 일일와 있습니다. 참고 일그들의 통로 번호가 20 인 경우에 AC-6 세포는 유지 보수시 혼잡 방치하면 자신의 분화 지원 능력을 상실하는 경향이있다, 또는.

1. 워시 AC-6 세포는 한 번에 1 ml의 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)와 열망에 의해 DPBS를 제거합니다. AC-6 37 ....

결과

4-6x10 ⁷ BM 세포의 총 일반적으로 대퇴골 한 6 ~ 8 주령, 야생형 C57BL / 6 마우스의 경골에서 격리됩니다. CLP를 밖으로 정렬하려면, 총 BM 세포는 혈통 마커 (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b를, GR-1, Thy1.1, NK1.1, TER119 및 MHC-II), 안티에 대한 PE - 복합 항체로 염색 -c-KIT-를 PerCP / Cy5.5, 안티 무서-1-FITC, 안티 - M-CSFR-APC 및 항 IL-7Rα-PE / Cy7는 분석하고 세포 분류기로 분류. CLP에 대한 선별 전략은 그림 1에 나타낸다. 일반적으로, 5 × ⁴ CLP를 한 C57BL / 6 마우스에서 얻을 수 있습니다. 더 CLP를 얻으려면 3-4 생쥐로부터 BM 세포를 결합 할 수 있고, 프로토콜이 정렬되기 전에 적절하게 조정.

5.9x10 ⁶ AC-6 피더 세포와 50.......

토론

여기에서 우리는 CLP를 소수의에서, 특히 체외 배양 수지상의 강력한 생성을위한 시스템 및 올라가고을 설명합니다. 이 배양 시스템의 고유성은 피더로서 AC-106 세포, 간질 세포주의 이용에 기인한다. 이 방법은 예컨대 IL-7, SCF, M-CSF 및 FL ^20뿐만 아니라 사이토 카인을 제공하기 위해 도시 한 내용뿐만 아니라, 필요한 세포 간 접촉 ^(21)은 DC 개발을 지원한다. AC-106 세포는 여러 선조 ^{8,16,22에서} 시험 관내 DC 개발 연구를 용이하게하기 위해 이전에 사용되어왔다. 우리는 CLP를 PDCS로부터의 효율적인 분화를 지원하는 AC-6 피더 세포의 최적의 농도를 시드하는 것이 중요하다는 것을 발견. 특히, PDC 개발에 적합 다음날, 포화 상태에 5.9x10 12 웰 플레이트 결과 ⁴ γ-조사 AC-6 세포를 파종. 낮은 AC-6 세포 밀도 (3.9x10 ⁴ / 웰 12 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
안티-마우스 Ly6g/Ly6c (PE), 클론 RB6-8C5	Biolegend	108408	리니지 마커
안티-마우스 NK1.1 (PE), 클론 PK136	Biolegend	108708	리니지 마커
안티-마우스  CD11b(PE), 클론M1/70	Biolegend	101208	리니지 마커
안티 마우스 CD19(PE), 클론 eBio1D3	Biolegend	115508	리니지 마커
안티 마우스 B220(PE), 클론 RA3-6B2	Biolegend	103208	리니지 마커/FACS
안티 마우스 CD3(PE), 클론 17A2	Biolegend	100308	리니지 마커
안티 마우스 CD8a(PE), 클론 53-6.7	Biolegend	100707	계통 마커
안티 마우스 MHC-II(PE), 클론 NIMR-4	Biolegend	107608	라이니지 마커
안티 마우스 Ter119(PE), 클론 TER-119	Biolegend	116208	라이니지 마커
안티 마우스 Thy1.1(PE), 클론 HIS51	eBioscience	12-0900-83	리니지 마커
안티 마우스 M-CSFR(APC), 클론 AFS98	Biolegend	135510	FACS
안티 마우스 c-Kit (PerCP / Cy5.5), 클론 2B8	Biolegend	105824	FACS
안티 마우스 Sca-1 (FITC), 클론 D7	Biolegend	108106	FACS
안티 마우스 IL-7Ra (PE / Cy7), 클론 A7R34	Biolegend	135014	FACS
안티 마우스 CD11c (PerCP / Cy5.5), 클론 N418	Biolegend	117328	FACS
안티 마우스 CD11b (FITC), 클론 M1 / 70	Biolegend		101206 FACS
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