Method Article

피더가없는 조건에 센다이 바이러스를 사용하여 인간 말초 T 세포로부터 유도 된 다 능성 줄기 세포의 생성

DOI:

10.3791/53225

⸱

November 11th, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Keio University School of Medicine, 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, Keio University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 재프로그래밍 인자를 포함하는 마트리겔 및 센다이 바이러스 벡터의 조합을 사용하여 공급자가 없는 조건에서 인간 말초 T 세포에서 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 생성하는 방법을 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

최근 iPSCs 회생 치료를위한 세포를 새로운 소스로서 주목 받고있다. 생성 iPSCs의 초기 방법은 침습적 조직 검사와 유전자의 레트로 바이러스 게놈에 삽입하여 얻은 피부 섬유 아세포에 의존하지만, 이러한 단점을 피하기에 많은 노력을 기울이고있다. 인간 말초 T 세포를 생성 iPSCs 고유 셀 소스이다. T 세포로부터 유래 iPSCs는 T 세포 수용체 (TCR) 유전자의 재 배열을 포함하고 항원 특이 적 T 세포의 근원이다. 또한, 게놈의 T 세포 수용체 재배치 개별 세포주 라벨 및 이식 공여자 세포를 구별 할 수있는 잠재력을 갖는다. iPSCs의 안전한 임상 적용의 경우, 유해한 제제에 새롭게 생성 iPSCs 노출의 위험을 최소화하는 것이 중요하다. 소 태아 혈청 및 피더 세포가 다 능성 줄기 세포 배양에 필수적인 하였지만, 이것은 위험을 줄이기 위해 배양 시스템에서 제거하는 것이 바람직하다예측할 수없는 병원성의. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 정의되지 않은 병원체에 iPSCs 노출의 위험을 줄이기 위해 센다이 바이러스를 사용하여 인간 말초 T 세포로부터 iPSCs를 생성하기위한 프로토콜을 확립했다. 센다이 바이러스를 처리하는 것이 적절한 바이오 레벨 장비가 필요하지만, 센다이 바이러스가 감염 게놈 삽입없이 T 세포를 활성화하면서도 고효율. 이 프로토콜에서는 활성화 된 T 세포 배양 및 센다이 바이러스의 조합을 이용하여 피더가없는 조건에서 인간 말초 T 세포로부터 iPSCs의 생성을 보여준다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

iPSCs는 재생 의학 1-3 세포의 획기적인 소스로 주목을 받고있다. 현재까지 iPSCs를 생성 다양한 방법들이 4,5보고되었다. 이들 중에서, 인간 T 세포로부터 생성되는 세포 iPSCs 때문에 샘플링 6-8의 덜 침습적 방법의 특별한 관심왔다. 또한 T 세포로부터 유래 iPSCs는 T 세포 수용체 (TCR) 유전자의 재 배열을 포함하며, 따라서 항원 특이 적 T 세포 9,10의 근원이다. 따라서, T 세포 유래 iPSCs를 생성 안전하게 재생 의학을 진행하는 데 유용합니다.

이 방법은 예측 불가능한 병원성의 위험을 감소시키는 개념에 기초한다. iPSCs의 안전한 임상 응용을 위해 그것을 11은 병원균에 대한 노출의 위험을 줄이는 것이 중요하다. 이미 다 능성 줄기 세포의 배양 많은 시스템에서, 소 태아 혈청과 피더 세포를 필수적 시약으로서 사용되어왔다12이야. IPSC 생성 예측할 병원성의 위험을 감소시키기 위해 그러나, 배양 시스템에서 이러한 두 시약의 제거가 바람직하다.

또한,이 방법은 환자와 피더 세포의 제조에서 힘드는 침습적 셀 샘플링을 피할 수있는 장점이있다. T 세포 유래 iPSCs 이미 질병 연구 (13, 14)에 성공적으로 사용 되었기 때문에,이 방법은 환자의 질환 별 iPSCs를 생성 적용 가능하고 유용하다.

유전자 차량으로 센다이 바이러스 (SEV) 벡터를 사용하여 T 세포의 리 프로그래밍 방법 중 고효율 7,16과 iPSCs를 생성 할 수있는 방법이다. SEV는 단일 - 가닥 RNA 바이러스이고, DNA 복제 단계가 필요하지 않기 때문에 또한, IPSC 세대에서의 사용은 숙주 게놈 17-19 속보 피한다. 따라서 혈청 FR에서 인간 말초 T 세포로부터 iPSCs를 생성하기위한 프로토콜을 확립EE 및 마트 리겔, mTeSR 매체의 조합을 이용하여 피더가없는 조건, SEV 벡터.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 활성화 된 인간 T 세포를 준비

  1. 정맥 천자에 의한 기증자 전체 혈액을 헤파린 10 ㎖를 수집합니다.
    1. 정맥 천자의 사전에 기증자의 동의를 얻습니다. 정맥 천자는 자격을 갖춘 숙련 된 기술자에 의해 수행되어야합니다.
    2. 멸균 장비와 다음 적절한 바이오 안전성 가이드 라인을 얻은 혈액 샘플을 처리합니다.
  2. 10 ml의 D-PBS로 전혈 헤파린 10 ml에 희석 (-).
  3. 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 15 ml의 피콜 용액 (피콜 - 페이크 PREMIUM)를 넣습니다.
  4. 단계 1.3에서 피콜 용액에 1.2 단계에서 제조 20 mL의 혈액 용액을 층을 포함한다. 전기 피펫을 사용하여, 혈액 솔루션은 튜브의 내부 벽을 따라 천천히 단계에서 1.2 실행을 준비 할 수 있습니다. 혈액 솔루션 및 피콜 용액을 혼합하지 않도록주의하십시오.
  5. RT에서 30 분 동안 400 × g에서 원심 분리한다. "느린"할 수있는 원심 감속 속도를 설정합니다.
    주 : 원심 분리 후, 흰색 얇은상부 층은 유백색 플라즈마 층과 하부 맑은 피콜 층 사이에 나타난다. 이 흰색 얇은 층은 단핵 세포가 포함되어 있습니다.
  6. 1 ml의 피펫 새로운 50ml의 원뿔형 튜브에 단핵 세포층을 전송. 피콜 솔루션을 포함하지 않도록주의하십시오.
  7. D-PBS를 추가 (-) RT에서 5 분 동안 200 × g에서 10 ㎖ 총 부피의 원심 분리에 단핵 세포.
  8. 상층 액을 버린다. 단핵 세포 및 실온에서 5 분간 200 × g에서 원심 분리기 (-) D-PBS의 10 ML을 추가합니다.
  9. 상청액을 폐기 회수 단핵 세포 KBM502 배지 1 mL를 넣어 혈구를 이용한 세포를 카운트. × 106 5 000 단핵구 적절한 분리를 Ficoll을 사용하여 전혈 헤파린을 10 ㎖로부터 얻을 수있다.
  10. D-PBS 중의 10 ㎍ / ml의 농도로 항 - 인간 CD3 항체 용액을 제조 (-). 서핑을 담가, 6 웰 플레이트에 항 인간 CD3 항체 용액을 첨가각각의 ACE 아니라, 적어도 30 분 동안 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양 접시.
  11. 각 웰로부터의 항 인간 CD3 항체 용액을 제거하고, D-PBS로 한번 세척 (-) 세포를 파종 직전.
  12. KBM502 매체에 항 인간 CD3 항체 - 코팅 된 6- 웰 플레이트에 2.5 × 105 세포 / ㎠의 밀도로 190 단계에서 제조 된 시드 단핵 세포. T 세포가 포화 상태에 도달 할 때까지 변화없이 배지를 3-7 일 동안 5 % -CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양한다. 이 기간에있어서 T 세포가 모두 부착 된 현탁 세포이다.

SEV 벡터 2.을 감염 인간 T 세포

  1. 3-7일 배양 한 후, 피펫으로 매체를 기존에 활성화 된 T 세포를 수집합니다. 실온에서 5 분 동안 200 × g에서 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기로 전송합니다.
  2. 상층 액을 제거하고 1 ml의에게 신선한 KBM502 매체를 추가 할 수 있습니다. 세포를 세어 1 접시입니다.5 × 106 세포를 항 CD3 항체 - 코팅 된 6- 웰 플레이트의 각 웰에 (2 ㎖ KBM502 신선한 배지에서).
  3. 얼음에 OCT3 / 4-SEV / TSΔF, SOX2-SEV / TSΔF, KLF4-SEV / TSΔF 및 c-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF의 SEV 솔루션을 녹여.
  4. OCT3 / 4-SEV / TSΔF, SOX2-SEV / TSΔF, KLF4-SEV / TSΔF 및 c-MYC (HNL)를 포함 SEV 솔루션을 추가 -SeV / TS15ΔF 개별적으로 우물에 감염 다수의 각 (MOI) 추가로 24 시간 동안 5 %-CO 2 배양기에서 37 ° C에서 10 품어의.

3. 인간 T 세포에서 SEV 벡터를 제거

  1. 24 시간 감염 후, 피펫에 감염된 세포를 수집합니다. 부착 된 세포가있는 경우, 그들은 쉽게 반복 상하 피펫 팅 그들을 분리 할 수​​있다. 실온에서 5 분 동안 200 × g에서 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기로 전송합니다.
  2. SEV 벡터를 포함하는 상층 액을 제거하고, 2 ml의에게 신선한 KBM502 매체를 추가 할 수 있습니다. EAC에서 Replate 세포우물의 시간. 추가로 24 시간 동안 5 % -CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양한다.

마트 리겔 계층 4. 시드 세포

  1. 4 ℃에서 (본 연구에 사용 된 특정 브랜드 자재 목록 참조) 및 DMEM / F12 배지 10 ㎖에 0.2 ㎖에 용해 해동 행렬 겔 기저막 매트릭스 용액을 제조 하였다.
    참고 : 매트릭스 겔 (이 연구에서 사용 된 특정 브랜드에 대한 자료 목록을 참조하십시오 것은) 4 ° C에서 완전히 해동하는 O / N을 해동 할 필요가있다. 사용 직전까지 얼음에 보관하십시오.
  2. 100-mm 접시에 접시 당 5 ㎖ 접시 기저막 매트릭스 용액과 세포를 파종 전에 적어도 30 분 동안 RT에서 떠난다. 적어도 두 개의 100-mm의 요리는 하나의 실험이 필요하다.
  3. , 피펫 팅에 의해 SEV 감염된 세포를 수집 실온에서 5 분 동안 200 × g에서 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기로 전송.
  4. 상층 액을 제거하고 1 ml의에게 신선한 KBM502 매체를 추가 할 수 있습니다. CE의 수를 계산혈구를 사용 LLS, 단계 4.2 및 플레이트 제조 100-mm 접시에서 기저막 매트릭스 용액을 제거 1 × 105 1 × 106 세포를 100-mm 기저막 매트릭스 피복에 (10 mL의 신선한 mTeSR 매체) 그릇. 마지막으로, 식민지 쉽게 포착되는 플레이트를 사용합니다.
  5. 5 %-CO 2 배양기의 O / N 37 ° C에서 접시를 품어.
  6. 10 매체를 변경 ml의 매일 mTeSR 매체를 살.
    참고 : 감염 후 약 20-30일 밀접 배아 줄기 세포 (는 ESC)를 닮은 식민지를 나타납니다.

5. T 세포에서 파생 된 iPSCs를 확장

  1. 4 ℃에서 (본 연구에 사용 된 특정 브랜드 자재 목록 참조) 및 DMEM / F12 배지 10 ㎖에 0.2 ㎖에 용해 해동 행렬 겔 기저막 매트릭스 용액을 제조 하였다.
  2. 플레이트 (1) 6 웰 플레이트에 웰 당 기저막 매트릭스 ml의 용액에 실온에서 떠나식민지를 따기 전에 적어도 30 분.
  3. mTeSR 매체 20 μL로 96- 웰 플레이트를 웰 당 채우기.
  4. 20 μL 피펫을 사용하여 실체 현미경 아래는 ESC를 닮은 식민지를 선택합니다.
    참고 : 그림 1B와 같이는 ESC와 iPSCs의 식민지는 원형과 평면이다.
  5. 단계 5.3 mTeSR 매체로 채워진 96 웰 플레이트에 전송 선택 식민지.
  6. 200 μL 피펫을 사용하여 실체 현미경 아래에 작은 덩어​​리로 식민지를 깨고 아래로 피펫 조심스럽게 각 웰에 mTeSR 매체의 200 μl를 추가합니다. 5.2에 잘 준비에서 기저막 매트릭스 솔루션을 제거하고 mTeSR 매체 2 ㎖와 기저막 매트릭스 코팅 6 웰 플레이트 잘 하나에 각 식민지를 넣어 당 잘.
  7. 2 매체를 변경 ml의 매일 mTeSR 매체를 살.

6. T 세포에서 파생 된 iPSCs 유지

T 세포 유래 iPSCs은 유지 될 수있다인간 및 인간 iPSCs는 ESC와 동일한 기술을 사용하여 저장된다. IPSC 식민지가 성장하면, 동일한 절차를 반복하여 큰 요리로를 확장합니다.

  1. 모든 1-2일 mTeSR 매체를 변경합니다.
  2. 식민지가 합류 될 때마다 5~7일, 인간 iPSCs 및 제조업체의 지침에 따라 인간는 ESC를 위해 분리 솔루션을 사용하여 통로 세포.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜을 이용하여, 사용자가 안정되게 인간 말초 T 세포로부터 iPSCs를 생성 할 수있다. . 몇 구절 후 검출되지 않았다 여러 기증자의 경우와 SEV 사이에 세포 재 프로그래밍의 효율성의 0.005 % (16) 그림 1A는 T의 생성을위한 프로토콜의 개략적 인 세포가 유래 보여줍니다 - SEV 및 마트 리겔와 T 세포에서 IPSC 세대는 약 0.002이 %가 나타났다 마트 리겔과 mTeSR 매체를 이용하여 공급 장치가없는 상태에서 iPSCs. 약 20~30일 SEV와 감염 후, IPSC 식민지들은 ESC 식민지와 같은 형태 (그림 1B)에 의해 인식됩니다. 면역 형광 염색법은 전형적인 만능 세포 마커의 발현 공개 (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4는, TRA-1-60 및 TRA-1-81) T 세포 유래 iPSCs에서이 피더없는 조건 (그림 1C)에서 생성됩니다.

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도 1 (A) : 본 연구에서 피더가없는 조건 하에서 재 프로그래밍 T 세포에 대한 프로토콜의 개략도. (B) : 공급 장치가없는 상태에서 채혈 후 하루 27 전형적인 ESC와 같은 IPSC 식민지. (C). T 세포 유래 iPSCs에서 ALP 염색과 분화능 및 표면 마커에 대한 면역 형광 염색 (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60 및 TRA-1-81)의 공급이없는 조건에서 생성 하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 matrigel, mTeSR 배지 및 SeV 벡터의 조합을 사용하여 무혈청 및 피더가 없는 조건에서 인간 말초 T 세포로부터 iPSC를 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. iPS세포의 임상 적용을 위해서는 iPS세포를 안정적으로 생성하기 위한 프로토콜과 세포 샘플링을 위한 덜 침습적인 방법을 갖추는 것이 중요합니다. 마트리겔과 mTeSR 배지의 조합으로 iPSC를 생성하는 것은 녹아웃 혈청 대체(KSR) 배지 및 피더 세포를 사용한 것보다 낮은 재프로그래밍 효율을 보였지만, 이 조합은 기증자로부터 iPSC의 안정적인 생성을 달성합니다16. 안정적인 iPSC 생성과 덜 침습적인 세포 샘플링은 iPSC 생성을 위한 기증자 수를 늘릴 수 있다는 장점이 있습니다.

마이너스 가닥 RNA 바이러스인 SeV 벡터는 숙주 게놈에 통합되지 않습니다. 따라서, 종양 형성의 위험은 재프로그래밍 인자 유도 단계에서 피할 수 있다20-24. 또한 피더 층 대신 정의된 배양 배지와 마트리겔의 조합을 사용하는 피더 프리 조건을 통해 알려지지 않은 외인성 요인에 노출될 수 있는 잠재적 위험을 최소화할 수 있습니다. 이러한 기술의 융합은 재생 의학을 위한 덜 침습적이고 안전한 iPSC 기술을 제공합니다16.

이 프로토콜의 중요한 단계는 인간 T 세포를 활성화하는 단계(1단계)와 SeV 벡터로 감염시키는 단계(2단계)입니다. SeV 감염 후 최적의 시간에 배양 접시에서 ESC 유사 콜로니가 얻어지지 않은 경우 다음을 고려해야 합니다. 첫째, T 세포의 최적 활성화가 SeV 감염에 중요하기 때문에 T 세포 활성화 전 단핵 세포의 합류는 적절하지 않을 수 있습니다25,26. 단핵 세포의 밀도가 너무 높으면 세포 사멸이 발생하여 T 세포의 적절한 활성화를 방해합니다. 단핵 세포의 밀도가 너무 낮으면 T 세포의 적절한 활성화와 증식도 방해합니다. 따라서 단핵 세포의 융합성을 확인하고 그에 따라 조정해야 합니다. 둘째, SeV 벡터의 용량이 충분하지 않을 수 있습니다. iPSC 콜로니의 유도 효율은 바이러스의 용량에 따라 다릅니다6. SeV 감염 후 ESC 유사 콜로니가 관찰되지 않으면 바이러스 용량을 MOI 15-20까지 늘리는 옵션을 고려해야 합니다. iPSC 콜로니 분화의 징후가 관찰되면 배지가 변경되는 빈도는 격일로 증가하거나 콜로니가 클 때 매일 증가할 수 있습니다.

이 프로토콜의 제한 사항은 이 방법이 바이러스가 없다는 것입니다. 세포 재프로그래밍용 SeV는 쉽게 상용화되지만 사용자는 적절한 생물안전 수준에 따라 장비를 준비해야 합니다. 통합이 없는 iPSC를 생성하는 또 다른 방법으로, 에피소좀 벡터는 지금까지 사용되어 왔다27-29. 에피솜 벡터는 생물학적 안전성이 낮은 장비와 함께 사용할 수 있지만 에피솜 벡터는 매우 낮은 속도로 숙주 게놈에 삽입될 수 있습니다. 따라서 SeV를 사용할 때와 같이 이식유전자의 소실을 확인하기 위해 추가 검사가 필요합니다.

이 기술이 동물 유래 제품과 절대적으로 자유롭지 않다는 또 다른 한계가 있습니다. matrigel, 항-CD3 mAb, 해리 용액 및 SeV 용액과 같은 일부 기질은 동물성 제품에서 파생되므로 이종 병원균을 옮길 위험이 있습니다. 그러나 배양 시스템에서 동물 유래 기질의 감소는 위험이 낮기 때문에 iPSC 기술의 임상 적용에 의미가 있습니다.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 더 경쟁 또는 공개의 이익 충돌이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 기술 지원을 의학의 게이오 대학에서 요시코 미야케, 사야카 Kanaami, Chihana 후지타, 미호 야마구치, 나츠코 Henmi 및 레이 오노 감사합니다. 이 작품은 부분적으로 건강 연구 성과의 실용화를 촉진하기 위해 R & D 시스템 지원 프로그램, 및 재생 의학의 실현을위한 고속도로 프로그램에 의해 투자되었다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ficoll-Paque PREMIUMGE Healthcare17-5442-02
정제 NA/LE 마우스 anti-human CD3BD Pharmingen555336
소 알부민 분획 V 용액Gibco15260-037
mTeSR1 매체 키트STEM CELL5850사용 전 실온에서 데우
기 분해 용액ReproCELLRCHETP002
D-PBS(–)Wako045-29795
SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0DNAVECDV-0303c사용 전 얼음에 해동
100-mm 조직 배양 접시Falcon353003
96-웰 조직 배양 플레이트Falcon353078
6-웰 조직 배양 플레이트Falcon353046
15  ml 원심분리기 튜브Greiner Bio-One188271
50  ml 원심분리기 튜브Greiner Bio-One227261

References

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