대장 줄기 세포 돌연변이의 정량화

Summary

우리는 생쥐를 잠재적인 DNA 손상 물질에 노출시킨 후 체세포 결장 줄기 세포 돌연변이의 재현 가능한 측정에 대해 상당한 개선을 보고했습니다.

Abstract

줄기 세포의 돌연변이를 측정 할 수있는 능력은, 화학 물질은 잠재적으로 암을 초래할 돌연변이를 유도 할 수 있다면, 어느 정도에 중요한 세포 집단의 정량화 할 수있는 강력한 도구이다. 상기 X 연결된 글루코스 -6- 포스페이트 탈수소 효소 유전자의 줄기 세포 돌연변이를 정량화하기 위해, 효소 분석의 사용은 이전에보고 된 바있다. ^(1)이 방법을 산출하는 반응 혼합물과 절개 된 조직의 동결 절편과 배양의 준비가 필요 세포가 기능적 글루코오스 -6- 인산 탈수소 효소 (G6PD) 효소를 생산하는 경우 청색. 그렇지 않은 경우, 셀은 하얗게. 우리는 폴리 비닐 알코올 대신에, 최적의 절단 온도 화합물 OCT () 매체를 이용하여 반응 혼합물을 수정했다. 이는 pH 측정을 용이 G6PD 염색 성분 가용화를 증가시키고 G6PD 효소의 확산을 제한한다. 돌연변이가 줄기 세포에서 발생 함을 입증하기에, 전체 토굴은 G6PD 효소가 부족합니다활동. 줄기 세포 비호에만 G6PD 표현형 돌연변이 토굴에서 자손 모두 G6PD 효소 활성이 결여된다. 줄기 세포의 변이를 식별하는 지하실, 연속 4 인접 동결 절편 (레벨) 7 μm의 두께로 절단 하였다. 인접 컷의 제조 방법은이 같은 변이 토굴 인접한 부분에서 관찰되기 때문에 토굴 완전히 돌연변이 된 형태를 제공한다. 50 ㎛의 간격이었다 조직 샘플과 슬라이드는 마우스 당> 10 ⁴ 지하실의 합계를 평가 제조 하였다. 돌연변이 빈도는 치료 그룹의 야생형 (청색) 소낭의 숫자로 ÷ 관측 돌연변이 (흰색) 소낭의 수이다.

Introduction

대장 암은 DNA를 손상시킬 수 환경 에이전트 및식이 구성 요소에 대한 노출을 포함하고 (예를 들어 APC)를 종양 억제 유전자에 돌연변이를 암 유전자에 체세포 돌연변이를 활성화 (예를 들어, 베타 카테닌) 또는 비활성화 생산하는 것으로 생각됩니다. 그러나, 이들 임계 돌연변이 결장 줄기 세포에서 발생하는 것으로 가정한다. 인해 대장 상피의 고유 토굴 아키텍처, 이는 대장 암 발생과 관련된 화학 물질에 동물을 노출 한 후 결장 줄기 세포 돌연변이를 측정 할 수있다. 돌연변이가 토굴 내의 모든 세포에 존재하므로 여러 X-연결 효소는, 줄기 세포에서 발생하는 돌연변이에 대한 지표 역할을 할 수 있습니다.

이전에, 절차는 마우스에서 결장 종양을 유도 화학 또한 X 결합 글루코오스 -6- 인산 탈수소 효소 (G6PD) 유전자 돌연변이 분석을 통하여 대장 체세포 줄기 세포 돌연변이를 생성하는 것이 입증 된 문서. ^1-3방법은 임의의 선택 압력없이 결장 줄기 세포 무작위 체세포 돌연변이의 빈도를 정량화. 절차는 처리 및 제어 생쥐로부터 결장 냉동 미 정착 부의 생산 G6PD 기능적 활성을 생산 세포의 결여 소낭의 식별을 포함한다. , 흰색으로 보이는 이러한 돌연변이 지하실은 돌연변이는 돌연변이 G6....

Protocol

실험 절차 및 동물의 윤리적 인 대우는 피츠버그 IACUC 대학 (프로토콜 # 1104674)에 의해 승인되었다.

G6PD 염색 혼합물 1. 준비

참고 : 다음과 같이 각 시약의 최종 농도가 있는지 확인; 5 mM의 글루코스 -6- 포스페이트 (G6P); 2 mM의 NADP, 5 밀리미터의 MgCl _2, 0.35 mM의 1- 메 ​​톡시 -5- methylphenazinium 메틸 설페이트 (MMPMS) 및 0.8 mM의 NBT. 초기 농도가 40 ㎖의 최종 부피에 대해 유도 된 각 시약 ^1,8,9. 솔루션 갓 준비하고 매일 사용되었다.

1. 50 ML 튜브에 10월 매체의 35 ml의 200 mM의 pH 7.4의 인산염 완충액 (PB) 2 ㎖를 추가하고 격렬하게 흔들어. 이 솔루션은 ~ pH가 7.4 인 산도 용지 확인합니다. 그렇지 않으면하는 솔루션을 버린다.
2. 61 mg을 200 mM의 G6P PB 0.94 ㎖에 용해하고, 추가 61 mg을 200 mM의 NADP PB 0.94 ㎖에 용해시키고, 41 mg의 0.96의 MgCl ₂ ml의 100 mM이 PB에 용해시켰다. pH가 있음을 재확인 ~ 7.4 재치시간의 pH 종이. 하지 ....

Results

동물에 결장 줄기 세포 돌연변이를 측정 할 수있는 능력은 암 유발에 돌연변이를 상관하는 유일한 방법을 제공한다. 일반적으로, 그것은 암화 과정에서 중요한 단계는 종양 유전자 돌연변이의 활성화 및 / 또는 종양 억제 유전자를 불 활성화 돌연변이가 포함한다고 가정한다. 우리는 PBS 200 μL 또는 PBS 200 μL 10 ㎎ / ㎏ AOM과 C57BL / 6 마​​우스를 주입. AOM은 공지 결장 발암 물질이다. 콜론은 줄기 세포의 돌연변이 분석 하였다 구십일에서 ^5-7. 이번에는 줄기 세포가 완전히 토굴을 채울 수 있도록 요구하고, G6PD를 생성하지 않는 전체 크립트 줄기 세포 돌연변이로 식별 크립트 때만. 완전히 돌연변이 지하실의 예는 그림 2에 나타내었다. 그림은 동결 절편의 준비에서 발생하는 지하실의 수직 및 수평 두 개의 서로 다른 방향을 보여줍니다. 수평 측면도을 제공한다 세로보기는 지하실의 장축을 찾고있다. 외침술잔 세포에서 점액 생산으로 인해 일부 흰색과 푸른 .......

Discussion

종종 유전자 독성 화합물의 효과는 DNA를 수정하는 능력에 의해 결정된다. 이 작업은 일반적으로 조직을 분리하고 DNA 부가 물의 글로벌 레벨을 측정하여 수행됩니다. AOM, 이것은 결장 O ⁶ -methylguanine 부가 정량 포함한다. 이러한 줄기 세포의 틈새와 같은 특정 유형의 세포 내에서의 손상에 대한 이러한 접근 정보를 이용하여, 손실된다. 부가 물 중 일부분 결국 고정 돌연변이로 변환되기 때문에, 또한, DNA 부가 물 돌연변이와 동일하지 않다. ¹² 우리 재현성 그리피스에 의해 기재된 초기 방법에 따라 결장에 줄기 세포 돌연변이를 정량화하기 위해 본 명세서 내용을 제공 등. ¹ VanNorden에 의해 개발 G6PD 염색을 기준으로합니다. ^4,8,9,13,14

정량 결과를 생성하는이 효소 조직 화학 방법에 대한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 하나는 조직의 절편이다.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약
니트로블루, 테트라졸륨
NADP
포도당-6-인산
1-메톡시-5-메틸페나지늄, 메틸설페이트
디메틸포름아미드
인산염 완충액(pH 7.4
최적 절삭 온도 컴파운드(OCT)
장비
광 현미경 5 메가 픽셀 카메라
cryostat
따뜻한 방이 장착되어 있습니다