β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

Nicholas Noinaj; Stephen Mayclin; Ann M. Stanley; Christine C. Jao; Susan K. Buchanan

doi:10.3791/53245

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방법 논문

β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

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DOI:

10.3791/53245

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2016년 7월 4일

Nicholas Noinaj¹ , Stephen Mayclin² , Ann M. Stanley²^,³ , Christine C. Jao²^,³ , Susan K. Buchanan²

¹Department of Biological Sciences, Markey Center for Structural Biology, Purdue University, ²National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), National Institutes of Health, ³National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health

이 논문에서

요약

β-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of β-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

초록

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, α-helical and β-barrel. While α-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, β-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite β-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target β-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

서론

β-배럴 OMPs은 미토콘드리아, 엽록체의 외부 세포막에서 발견, 및 그람 음성 박테리아 ^1-3 될 수있다. 그들은 α 나선 단백질와 유사한 역할을 제공하지만, 이들은 각 가닥은 속속들이 이웃하는 두 가닥에 연결되면서 8-26 역 평행 β 가닥 범위의 중앙 막 매립 β 배럴 도메인으로 구성된 매우 다른 스크롤을 (도 1 및도 2). β 배럴 영역의 처음과 마지막 스트랜드는 닫고 주위 막에서 β 배럴 영역을 밀봉한다 (미토콘드리아 VDAC 제외)를 역 평행 형태로 거의 독점적으로 서로 상호 작용한다. 모든 β 배럴 OMPs 이러한 루프 때때로 Neisserial의 트랜스페린 검색된 프로 바인딩 75 잔기로 대형 인 상태 리간드의 상호 작용 및 / 또는 단백질 - 단백질 연락처에 중요한 역할을하는 다양한 서열 및 길이의 세포 외 루프가TEIN A (TbpA) ^4. β-배럴 OMPs 또한 단백질의 기능적인 목적으로 도메인을 추가로 제공 N- 말단 또는 C- 말단 주변 세포질 확장 할 수 있습니다 (예를 들어, 아저씨 ^5-7, FadL ⁽¹⁰⁾ ^8,9, FimD). β-배럴 OMPs 많은 종류의 ¹¹ 존재....