β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

요약

β-barrel 외막 단백질(OMP)은 그람 음성 박테리아, 미토콘드리아 및 엽록체의 외막 내에서 많은 기능을 수행합니다. 여기에서 우리는 X선 결정학 또는 NMR 분광법에 의한 구조 결정을 위해 충분한 양의 β배럴 OMP를 생산하기 위한 프로토콜을 제시하여 구조 연구에서 알려진 병목 현상을 완화하기를 희망합니다.

초록

막 단백질은 세포에서 영양소 수송, 운동성, 신호전달, 생존 및 독성과 같은 중요한 기능을 수행하지만 알려진 구조의 ~1%에 불과합니다. 막 단백질에는 α나선과 β-배럴의 두 가지 유형이 있습니다. α나선 막 단백질은 거의 모든 세포막에서 찾을 수 있지만 β배럴 막 단백질은 미토콘드리아, 엽록체 및 그람 음성 박테리아의 외막에서만 찾을 수 있습니다. 일반적으로 막 단백질의 구조 연구에서 일반적인 병목 현상 중 하나는 분석을 위해 충분한 순수 샘플을 얻는 것입니다. 선호하는 β-배럴 외막 단백질(OMP)의 구조를 해결하는 데 관심이 있는 사람들을 돕기 위해 X선 결정학 및/또는 NMR 분광법에 의한 구조 결정에 유용한 수준에서 표적 β-배럴 OMP를 생산하기 위한 일반 프로토콜이 제시됩니다. 여기에서는 네이티브 발현과 봉입체로의 발현, 친화성 태그를 사용한 정제, 세제 스크리닝, 비셀 및 지질 입방상 기술을 사용한 결정화를 위한 구성 설계를 간략하게 설명합니다. 이러한 프로토콜은 테스트를 거쳐 그람 음성 박테리아의 대부분의 OMP에 효과가 있는 것으로 밝혀졌습니다. 그러나 특히 미토콘드리아와 엽록체에 대한 일부 표적은 발현 및 정제를 위해 다른 방법이 필요할 수 있습니다. 따라서 여기의 방법은 그람 음성 박테리아의 OMP와 관련된 대부분의 프로젝트에 적용할 수 있어야 하지만 정제된 샘플의 발현 수준과 양은 대상 OMP에 따라 다릅니다.

서론

β-배럴 OMPs은 미토콘드리아, 엽록체의 외부 세포막에서 발견, 및 그람 음성 박테리아 ^1-3 될 수있다. 그들은 α 나선 단백질와 유사한 역할을 제공하지만, 이들은 각 가닥은 속속들이 이웃하는 두 가닥에 연결되면서 8-26 역 평행 β 가닥 범위의 중앙 막 매립 β 배럴 도메인으로 구성된 매우 다른 스크롤을 (도 1 및도 2). β 배럴 영역의 처음과 마지막 스트랜드는 닫고 주위 막에서 β 배럴 영역을 밀봉한다 (미토콘드리아 VDAC 제외)를 역 평행 형태로 거의 독점적으로 서로 상호 작용한다. 모든 β 배럴 OMPs 이러한 루프 때때로 Neisserial의 트랜스페린 검색된 프로 바인딩 75 잔기로 대형 인 상태 리간드의 상호 작용 및 / 또는 단백질 - 단백질 연락처에 중요한 역할을하는 다양한 서열 및 길이의 세포 외 루프가TEIN A (TbpA) ^4. β-배럴 OMPs 또한 단백질의 기능적인 목적으로 도메인을 추가로 제공 N- 말단 또는 C- 말단 주변 세포질 확장 할 수 있습니다 (예를 들어, 아저씨 ^5-7, FadL ^{(10) 8,9,} FimD). β-배럴 OMPs 많은 종류의 ¹¹ 존재하지만,보다 일반적인 유형의 두 분야 (1) TonB 종속 운송 (2) autotransporters 덜 익숙한 사람들을 위해 예로서 아래에 설명되어 있습니다.

TonB 종속 전송기 (예를 들면, FEPA, TbpA, BtuB, CIR, 등) 영양 오기 필수적이며, A는 C 말단 β- 22 가닥 안에 꿰매 발견 ~ 150 개의 잔기로 구성된 N - 말단 플러그 도메인을 포함 배럴 도메인 외막 ⁽¹²⁾ (도 3)에 매립. 이 플러그 도메인 자유롭게 배럴 영역을 통과 기질을 방지하는 동안, 기판은 결합 플러그 내의 도메인 번째 형태 변화를 유도리드에서 (플러그 재 배열하거나 플러그의 부분 / 전체 배출에 의해 하나)를 페리 플라 즘으로 외부 막에 걸쳐 기판 운반을 용이하게 할 수있다 형성 기공합니다. TonB 종속 전송기는 이러한 인간 숙주 단백질 ^{4,13,14에서} 직접 철 같은 영양소를 납치 전문 운송을 진화 나이 세리아 뇌수막염으로 그람 음성 박테리아의 일부 병원성 균주의 생존에 특히 중요하다.

Autotransporters는에서 분비 또는 제시 중 하나 β-배럴 도메인 (ESTA와 ESPP와 같이 일반적으로 12 가닥)으로 구성 β-배럴 OMPs와 승객 도메인을 그람 음성 세균의 type V 분비 시스템에 속하고 있습니다 셀 ^{(15, 16)} (그림 3)의 표면. 이 β-배럴 OMPs는 종종 역할을하는 승객 도메인과 세포 생존 및 독성에 중요한 역할을 역할 중 하나 프로테아제, 어드, 및 / 또는 기타 EF 등fector 그 발병 기전을 매개.

이러한 X 선 결정학, NMR 분광법, 및 전자 현미경 (EM) 우리 차례가 외막에서 작동 정확히 해독하는데 사용할 수있는 원 해상도의 OMPs위한 모델을 결정하도록 허용하는 구성 방법. 이것은 귀중한 정보는 해당되는 경우 약물 및 백신 개발을 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 트랜스페린 결합 단백질 A (TbpA)은 나이 세리아의 표면 상에 발견하고 직접 인간 트랜스페린 결합하고 추출 자체 생존 철 수입 때문에 발병 요구된다. TbpA없이, 나이 세리아 인간 호스트로부터 철을 청소할 수 없으며 비병원성 렌더링된다. TbpA ^4에 결합 인간 트랜스페린의 결정 구조를 해결 한 후, 두 단백질이 관련된 얼마나 명확하게되었다 TbpA 어떤 영역의 상호 작용을 매개, TbpA 의해 철 추출 중요한 있었는지 잔기 및어떻게 하나 TbpA을 대상으로 나이 세리아에 대한 치료제를 개발하고 있습니다. 따라서, 생존 병인 그람 음성균에 β 배럴 OMPs의 중요성을 고려할뿐만 아니라 미토콘드리아, 엽록체 기능 및 추가 구조 막 단백질의 독특한 클래스에 대한 정보가 작동하는 시스템에 대한 필요 일반적으로 프로토콜은 표현 및 구조 방법에 의해 특성화에 대한 높은 수준의 목표 OMPs 정화의 전반적인 목표되게됩니다.

프로토콜

1. 복제 및 식

참고 : 구조 연구를 활성화하려면 고도의 정제 된 단백질의 충분한 양을 준비해야하며, 이것은 일반적으로 E.의 대상 β-배럴 외막 단백질의 복제 및 과발현 (OMP)로 시작 대장균 (그림 4). 지금까지 미토콘드리아 VDAC에 대한 그 구조를 포함한 모든 β-배럴 OMP 구조는, 세균 발현 된 단백질 ^(11)에서 유래되었다. 여기에서, 일반적으로 프로토콜은 관내 ¹⁷ 접힘에 대한 흠 기관에 복제 및 박테리아의 세포막에 직접 (1) 기본 표현 β-배럴 OMPs을 표현하고 (2) 표현되게됩니다.

1. 익스프레션 구조를 설계
   1. 구하거나 코돈 최적화 대상 OMP 유전자를 구입할 수 있습니다.
   2. 구매 또는 T7 발현 벡터 (I)는 주변 세포질 이행 시그널 서열을 함유을 구 N- 말단 6X 히스티딘 태그멤브레인 또는 (ⅱ) 시험관 접힘에 대한 봉입체에 표현을위한 주변 세포질 지역화 신호 순서없이에 생체 표현을위한 TEV 단백질 분해 효소 사이트 ^4,18,19.
      참고 : N- 말단 단백질 분해 효소 절단 6 배 또는 10 배 - 히스티딘 태그를 정화하기위한 쉬운 방법을 제공합니다. 수용성 단백질과 같이, 후속 태그 제거 친화력 태그 (히스티딘, 연쇄상 구균, GST 등), 친 화성 태그의 위치 및 프로테아제 부위의 포함 (TEV, 엔테로 키나제, 트롬빈 등)의 선택을 변경 .
   3. PCR은 발현 벡터에 적합한 프라이머 및 서브 클론으로 표적 서열을 증폭한다. 결찰 독립적 인 복제 (LIC) 서브 클로닝을위한 ^{20, 21} 또는 기존의 복제 기술 (제한 효소 / 결찰)를 사용합니다. 그러나, LIC 병렬 클로닝 다양한 구조 (잘림 태그 다양한 촉진제의 종류)의 수많은 허용 높은 처리량을 더욱 용이하게 할 수있다용이하게.
2. 생체 막 타겟, 식
   1. 신호 서열 대상 OMP 하류 클로닝 β 배럴과 프레임을 확인하기 위해 서열 분석을 사용하여 (즉, pelB,하는 OmpA) 식 구조물이다.
      주 : 신호 서열은 외막로 페리 플라 즘 이후 조립체에 대한 분비 초 translocon에 초기 체인을 지시한다.
   2. BL21 (DE3) 화학적으로 유능한 세포의 50 μL에 플라스미드의 1.0 μl를 피펫 팅에 의해 표현 박테리아의 표현 균주로 구조 변환과로 pipetting 아래로 부드럽게 섞는다. 30 분 동안 빙상에서 인큐베이션.
   3. 30 초 수조를 사용하고 1 분 동안 다시 얼음에 배치 42 ºC에서 열 펄스.
   4. 미리 예열 SOC 매체의 1 ML을 추가하고 벤치 탑 진탕 배양기를 이용하여 1,000 rpm에서 1 시간 37 ºC에서 흔들.
   5. 적절한 antibiot을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 셀 플레이트 (100) μLIC는 하룻밤에 37 ºC 반전 부화합니다.
   6. 단일 콜로니로 5 ㎖의 LB + 항생제 배양 접종하여 소규모 발현 테스트를 수행. 5-10 식민지에 대해 반복합니다.
      참고 때문에 β 배럴 OMP의 잠재적 독성 및 기저 발현 수준에 대한 의존도의 콜로니 간 변이 콜로니 때때로 관찰된다. 따라서, 여러 식민지를 선별하는 각각의 구조가 테스트되고 권장합니다. 삼각 플라스크를 당황 125 ml를 25 ml의 문화를 성장하는 작은 규모의 발현 테스트가 아닌 기존의 5 ml의 문화에 대해 제안한다. 이러한 조건들은 종종 더 큰 규모의 증가에 어떻게 될지 반영한다. 또한, 성공의 다양한 수준이 표적 단백질에 따라보고 된 이후, 배양 배지 (TB, LB,는 2xYT, M9 등)의 다양한 형태도 선별하는 것이 좋다.
      1. 0.6 ~의 OD ₆₀₀ 진탕 37 ºC에서 성장.
      2. 광고가 타겟 OMP의 발현을 유도딩 각 배양 튜브에 1 M 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 사이드 (IPTG)의 5 μL 및 추가 1-2 시간을 증가 할 수있다.
      3. 미세 원심을 사용하여 15,000 XG에서 1 분 동안 각 문화의 1 ㎖ (~ 0.6의 OD _600)을 원심 분리하여 모든 식민지에 대한 발현 수준을 비교합니다.
      4. 상층 액을 제거하고 1X SDS-PAGE 로딩 버퍼 200 μL의 세포를 재현 탁. 5 분 동안 100 ºC에서 가열 한 다음 원심 분리기 다시 5 분 동안 15,000 XG에.
      5. 10 % 겔의 각 웰에 20 ㎕를 피펫 팅에 의해 SDS-PAGE를 이용하여 샘​​플을 분석한다. 상수 200 V.에서 35 분 동안 젤을 실행
         참고 : 단백질 타겟이 제대로 접혀 여부되고 있는지 확인 할 수있는 것이이 시점에서 도움이 될 것입니다. 이는 종종 소규모 정제를 수행하여 열 또는 개선 가능성에 대해 분석하는함으로써 달성 될 수있다.
   7. 최고의 표현을 보여주는 식민지를 선택하고 매체의 12-24 L을 사용하여 대규모 발현을 수행.
      참고 : 기존의 방법은 일반적으로 0.6 ~의 OD ₆₀₀ 진탕 37 ºC에서 문화를 성장 후 적절한 유도와 유도 (즉, 0.1 IPTG에 대한 MM 또는 ~ 아라비 노스 0.2 %) 추가로 2-4 시간 동안 . 원하는 경우, 유도에 앞서 낮은 20 ° C로 온도를 감소시키고 유도 시간을 연장한다.
      1. 새는 표현 방법의 경우, 25 ml의 37에 문화를 접종 성장 ° C는 LB 배지에 OD ₆₀₀ ~ 0.6에 도달 할 때까지 적절한 항생제 (들)을 함유. 그런 다음, TB 매체 플러스 항생제 (들)의 열두 1 L 플라스크에 접종 1 ㎖를 추가하고 (3 일 ~) 포화 20 ° C에서 성장한다.
   8. 10 분 동안 6,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 수확.
   9. 정화 단계 2.1을 진행 또는 -80 ºC 장기 보존 용 액체 질소에서 세포 펠렛을 동결.
3. 체외 Refol에 대한 봉입체에 식땡땡
   1. 신호 서열을 포함하지 않는 발현 구조를 확인하기 위해 서열 분석을 사용한다. 신호 서열의 부재는 봉입체로 세포질에 축적 표적 단백질을 유도 할 것이다.
   2. 발현을위한 박테리아 발현 균주에 발현 구조체 변형. 봉입체의 발현을 위해, 가능한 독성 효과를 최소화하도록 유도 (즉, IPTG, 아라비 노스 등) 발현을 조절하는 것이 가장 좋다.
   3. 플레이트 (100)에 적절한 항생제를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 형질 전환 된 세포 및 μL ºC 반전 밤새 37 ℃에서 배양한다.
   4. 단일 콜로니로 5 ㎖의 LB + 항생제 배양 접종하여 소규모 발현 테스트를 수행.
   5. 2-4 추가 식민지 단계를 반복 1.3.4.
   6. 0.6 ~의 OD ₆₀₀ 진탕 37 ºC에서 성장.
   7. 1-2 시간 동안 적절한 유도로 유도한다.
   8. 모든 t에 대한 발현 수준을 비교그는 SDS-PAGE를 사용하여 분석에 의해 식민지 (단계 1.2.6 참조). 최고의 표현을 보여주는 식민지를 선택하고 매체의 12-24 L을 사용하여 대규모 발현을 수행합니다.
      1. 0.6-0.8의 OD _600에 37 ° C에서 세포를 성장하고 3-5 시간 동안 37 ° C에서 유도한다. 봉입체로 발현 모든 단백질 발현 실험에서와 같이, 표현의 다른 형태보다 더 강력한 반면, 발현은 성장 배지, 유도 시간과 유도 온도 및 유도제의 농도를 변화시킴으로써 향상 될 수있다.
   9. 10 분 동안 6,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 수확.
   10. 정화 단계 2.2을 진행 또는 -80 ºC 장기 보존 용 액체 질소에서 세포 펠렛을 동결.

2. 정화

1. 막 분수에서 격리
   주 : 수용성 단백질과는 대조적으로, 세포막 단백질은 지질 이중층에 포함되어 있으므로추가의 정제 및 분석 (그림 5) 그들을 추출 세제가 필요합니다. 다음 표현식하는 β-OMP 배럴의 정제의 첫번째 단계는 막 분획으로부터 추출된다.
   1. 5 ㎖ / g의 세포 페이스트의 비율로 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.4의 200 mM의 염화나트륨, 10 밀리미터의 MgCl _2를 50㎍ / ㎖ AEBSF, 5 μg의 / ㎖의 DNase I)에 재현 탁 된 세포.
   2. 를 Lyse 프랑스를 눌러 또는 셀의 균질화를 사용하여 세포. unlysed 세포 및 세포 파편을 제거하기 위해 4 ºC에서 30 분 동안 15,000 XG에서 분해 된 세포를 스핀.
   3. 4 ºC에서 1 시간 동안 고속 (200,000 XG)에서 다시 깨끗한 튜브와 원심 분리기에 뜨는을 전송합니다. 얻어진 펠릿은 관심의 단백질을 포함하는 막 분획이다.
   4. 막 분획은 먼저 막을 전사, 다운스 균질기를 사용하여 재현 탁하고 가용화 완충액 (50 mM의 KH ₂ PO _4의 pH 7.5, 200 mM의 염화나트륨을 첨가하는 20 mM 이미 다졸, pH를 8.0) (세정제없이 2 배 농도로 20g 세포 당 50 ㎖).
   5. 세제 (즉, N- 도데 실-β-D-말토 (DDM), lauryldimethylamine-N-산화물 (LDAO), n- 옥틸-β-D-글루 코피 라노 시드 트리톤 (OG)를, 작은 비커에 재현 탁 세포막을 붓고 추가 천천히 배 임계 미셀 농도 (CMC) ~ 최종 농도 X-100 등)를 포함한다.
   6. 1X 가용화 완충액의 최종 농도까지 물로 채우기. 표적 단백질은 막으로부터 추출 방법에 따라 쉽게 4 ºC에서 0.5-16 시간 동안 교반한다.
      주 : 세제 서서히 목적 단백질을 추출 막을 용해하는 데 사용된다. 이온 성 (SDS, 옥시 콜린 산), 비 이온 (Elugent, TWEEN, 트리톤 X-100, OG, DDM), 및 양쪽이 온성 (LDAO, CHAPS) : 여기에 사용할 수있는 세제의 3 종류가 있습니다. 정화 단계 동안 안정하고 단 분산 인 단백질 세제 착체 크게 막 단백질 crystallizat의 성공에 도움이 될이온. 세제, 자신의 특성, CMC 정보 및 막 단백질 및 기타 응용 프로그램의 정제에서의 사용에 대한 자세한 내용은 상업적 공급 업체 웹 사이트에서 찾을 수 있습니다.
   7. 4 ºC에서 1 시간 동안 300,000 XG에 가용화 샘플을 원심 분리기. 상층 액은 이제 세제 - 가용화 대상 β-배럴 OMP가 포함되어 있습니다.
   8. 아래에 설명 된대로 2.3 절을 진행합니다.
2. 봉입체에서 리 폴딩
   참고 : 체외 폴딩를 들어, 대상 β-배럴 OMP는 봉입체에 직접 표현된다. 여기서 하나의 장점은 이들 단백질을 높은 수준으로 생성 될 수 있다는 것이다. 그러나 단점은 리 폴딩은 종종 비효율적이며, 그 다음 한 폴딩 실험에서 변화한다는 것이다. 그럼에도 불구하고 성공적으로 구조 연구에 폴딩 된 단백질의 많은 사례가있다. 봉입체로 발현에 따라, 하나는 현재 리 폴딩 실험을 위해 봉입체를 분리해야에스.
   1. 당 용해 완충액에서 재현 탁 셀 (에 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 200 mM의 염화나트륨, 10 밀리미터의 MgCl _2를 50㎍ / ㎖ AEBSF, 5 μg의 / ㎖의 DNase I, 4 mM의 2- 머 캅토 에탄올 (BME)) (5 ㎖ g 셀 붙여 넣기). 를 Lyse는 프렌치 프레스, 초음파, 또는 셀 나이저를 사용.
   2. 4 ºC에서 10 분 동안 6,000 XG에 저속 회전에 의해 봉입체를 펠렛.
   3. 다운스 호모 게 나이저를 사용하여 1.0 M 우레아 25 ㎖에 재현 탁하여 봉입체을 씻으십시오. 4 ºC에서 10 분 동안 6,000 XG에서 저속 회전하여 다시 펠렛.
   4. 단계를 반복하여 필요에 따라 2.2.3.
   5. 10 mg의 최종 농도로 세척 봉입체를 재현 탁 / mL의 8.0 M 우레아 함유 완충액 (또는 6.0 M 구 아니 디늄 하이드로 클로라이드 (GdCl)) CMC 배 이상에서 플러스 세제 (즉, DDM 또는 LDAO).
      주 : 히스티딘 태그를 함유하는 세포막 단백질의 타겟을 원하는 경우, 고정화 된 금속 친 화성 크로마토 그래피 (IMAC) 정제는 CO 변성을 사용하여 수행 될 수있다2.3 절에 아래에 설명 된 것과 유사한 초기 단계로 (8.0 M 우레아 또는 6.0 M GdCl에서) nditions.
   6. 변성제가없는 버퍼에 투석하여 변성제를 제거 천천히 (야간)에 의한 접힘 반응을 수행합니다.
      참고 :이 작업을 수행하기 위해 투석 버퍼의 몇 가지 변경 사항이 걸릴 수 있습니다. 봉입체는 먼저 IMAC 컬럼에 결합되는 경우 여전히 천천히 변성제를 제거하는 버퍼를 교환하여 열 결합 동안 대안 적으로, 하나는 리 폴딩 반응을 할 수있다. 어느 경우에도,이 때문에, 세제는 목표 안정 있어야하는 세포막 단백질 인 것을 기억한다. 사용되는 세제 dialyzable 경우 또한, 그뿐만 아니라 투석 버퍼 (들)에 추가되어야한다.
   7. 4 ºC에서 1 시간 동안 200,000 XG에서 폴딩 샘플을 스핀. 상층 액은 폴딩 세제 - 가용화 대상 β-배럴 OMP가 포함되어 있습니다.
   8. 아래에 설명 된대로 2.3 절을 진행합니다.
3. I을 사용하여 정제MAC, 이온 교환 및 젤 여과
   참고 : 기본적으로 체외 방법을 사용하여 명시 적 또는 폴딩 여부 단백질을 가정하면, 히스티딘 태그로 설계되었습니다, 다음 고정화 금속 친 화성 크로마토 그래피 (IMAC)는 세제에 보관해야합니다 제외 히스티딘은, 수용성 단백질 태그 대부분을 같이 정제 수행 이후의 모든 버퍼는 가용화 안정 목표 β-배럴 OMP를 유지합니다.
   1. 1-5 ml의 IMAC 열을 준비 또는 포장 한 열을 사용합니다. 4 ° C에서 후속 크로마토 그래피 단계를 수행합니다. 물을 세척하는 것은 방부제의 모든 흔적을 제거합니다. 자동 정제 시스템을 사용하는 경우, 제조자의 지시에 따른 항목을 설치한다.
   2. IMAC 버퍼 A (50 mM의 K ₂ HPO _4의 pH 7.5, 200 mM의 염화나트륨, 0.1 % DDM) 및 IMAC 버퍼 B 250 ㎖ (50 mM의 K ₂ HPO _4의 pH 7.5, 200 mM의 염화나트륨, 0.1 % 500㎖의 준비 DDM, 1.0 M 이미 다졸).
      참고 : 내가 사용 될 수있는 다른 세제nclude Cymal-6 (0.05 %), 트리톤 X-100 (0.03 %) 및 ​​LDAO (0.05 %).
   3. IMAC 버퍼 A.의 10 열 볼륨을 사용하여 IMAC 열 평형
   4. 25 mM의 최종 농도로 단백질 시료에 이미 다졸을 첨가하고 혼합한다. 2 ml / 분에서 평형 IMAC 칼럼 상에 샘플을로드합니다. 을 통해 흐름을 수집합니다.
   5. 5 컬럼 부피 완충액 B를 사용하여 이미 다졸의 농도를 증가시키는 각으로 IMAC 컬럼 세척 (즉, 25 mm의 50 mm의 100 mm)이다. 2 ml의 분수에서 세척를 수집합니다.
   6. 5 컬럼 부피의 250 mM의 최종 농도를 갖는 샘플을 용리시킨다. 2 ml의 분획에서 용출 샘플을 수집합니다.
   7. 관통 흐름 분석하고 세척 분획 및 SDS-PAGE 분석을 사용하여 용출 분획은 280 nm에서 그들의 흡광도 (단계 1.2.6 참조). SDS-PAGE 분석에 의해 검증 된 바와 같이 타겟 β-OMP 배럴을 함유하는 분획을 풀.
   8. 풀링 된 샘플에 TEV 단백질 분해 효소를 추가하여 6 배 - 히스티딘 태그를 제거 (따라제조 업체의 프로토콜) 부드러운 락 4 ºC에서 하룻밤 배양한다.
   9. 쪼개진 태그 및 비 절단 샘플에서 (을 통해 흐름)의 슈팅이 골대 β-배럴 OMP를 분리하기 위해 다시 IMAC 칼럼 상에 샘플 / 단백질 분해 효소 솔루션을로드합니다. 흐름을 통해 태그를 부족한 절단 샘플을 포함합니다.
      참고 :이 또한 원하는 단백질 분해 효소를 제거 할 TEV-그의, 또한 비 분해성 6 배 - 히스티딘 태그 자체가 있습니다. 그렇지 않으면, 다른 방법은 분해 후, 프로테아제를 제거하는데 필요한 것이다.
   10. 선택적으로, 상기 샘플을 정화하는 이온 교환 크로마토 그래피를 수행한다. 열이 사용하는 모든 버퍼에 세제를 포함해야되고, 제조업체의 지침을 따르십시오.
   11. 결정화 준비 세제를 함유하는 완충액에 겔 여과 칼럼 상에 샘플을 로딩하기 위해, 결정화를 위해 사용되는 예 25 mM 트리스 - 염산, pH가 7.5, 200 mM의 염화나트륨, 1 % OG있다.
   12. 1 ml의 분수를 수집하고 USI 분석NG SDS-PAGE 분석 (참조 단계 1.2.6) 280 nm에서 자신의 흡광도를 기반으로. 280 nm에서의 흡광도와 풀 분획들은 표적 단백질을 포함하고있다. ~ 10 ㎎ / ㎖로 농축시킨다.
       주의 : 필요하다면, 적절한 폴딩 아래 설명 된대로 열 개질 성 분석을 사용하여 평가 될 수있다.
4. 열 수정 가능성 (Modifiability) 분석
   참고 OMPs 한 방법은 반 - 네이티브 SDS-PAGE ^(22)를 사용하여 열 개질 성 분석을 수행 할 수있다 정제 β 경통의 적절한 폴딩을 모니터링. 여기에, 제대로 접혀 밖 샘플은 일반적으로 다른 열 변성되는 것과 마이그레이션합니다. 이 속성은 OMPs 배럴 β에 고유 널리 막 단백질의 가족을 연구하는 데 사용됩니다.
   1. 이전 샘플의 제조에 겔 장치를 조립한다. 시작하려면 얼음 양동이에 버퍼 탱크를 배치하고 얼음으로 완전히 둘러싸고 있습니다. 홀더에 사내 캐스트 또는 상업적 기본 그라데이션 젤을 삽입하고 탱크에 넣습니다. t 채우기버퍼를 실행 감기 1 배의 MES 완전히 그가 탱크 (50 mM의 2- [N-모르 폴리 노] 에탄 설 폰산, 50 mM 트리스베이스, 1 mM의 EDTA, 0.1 % SDS, pH를 7.3).
   2. 피펫이 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 샘플 (10 ㎎ / ㎖)의 0.25 μL. '삶은'과 'RT'와 다른 하나 레이블.
   3. 각 샘플 버퍼의 9.75 μl를 추가하고 피펫으로 혼합한다. 두 샘플, 2 × SDS 로딩 완충액 (100 mM 트리스 - 염산, pH가 6.8, 2 % SDS, 블루 0.2 % 브로 모 페놀, 20 % 글리세롤)의 10 μL를 추가하고 부드럽게 피펫 팅하여 혼합한다.
   4. RT에서 'RT'샘플을 떠나는 동안 5 분 95 ºC의 '삶은'샘플을 끓인다. '삶은'샘플 간단히 스핀.
   5. 로드 미리 조립 된 천연 젤 위에 두 샘플의 20 μl를. 상수 150 V.에서 60 분 동안 실행하면 젤을 제거하고 결과를 시각화하기 위해 염색 용액에 담가.

3. 결정화

참고 : 모두의 결정화를 들어가용성 멤브레인 단백질 표적, 그것은 샘플 순도 및 안정성 (즉, 가장 세제 리간드 보조 인자 등)을 극대화하기 위해 표준 프로토콜이다. (1) 세제 (2) bicelle, (3) 지질 입방 상 (LCP) (도 6) ²³ : 일반적으로 세포막 단백질 타겟 결정화 현재 방법은 이중층 매립 단백질의 양친 매성의 요구 사항을 만족시키는 세 가지 방법을 포함한다. 나노 리터 결정화 로봇의 사용은 권장 할 때 가능한 구조 결정 (도 7)를 지원하기 위해 목표 도구의 주어진 샘플 볼륨에 대해 스크리닝 할 수있는 상태의 수뿐만 아니라, 이용하는 최근의 진보를 증가시키기 위해서이다.

1. 결정화 사용하여 세제
   1. ~ 10 ㎎ / ㎖ 농도로하는 세제 용해 단백질 샘플을 얻습니다. 선택적 deterg 감소는 3 %의 최종 농도에 샘플에 직접 첨가 1,2,3- heptanetriol 추가엔트 미셀 크기입니다.
   2. 분진 및 침전을 제거하기 위해 원심 0.22 μm의 필터를 사용하여 샘​​플을 필터.
   3. 결정화 로봇을 사용하여, 하나 매달려 상용화 96 웰 화면을 사용하거나 ~ 200 NL 단백질 샘플 ~ 200 NL 결정화 버퍼로 구성 방울 방울 증발 방법을 앉아 심사 넓은 매트릭스 결정화를 수행합니다.
   4. ~ 21 ° C에서 결정화 번호판을 품어. 실체 현미경을 사용하여 결정 성장을위한 주간 판을 검사합니다.
   5. 체계적인 방식으로 결정화 상태의 성분을 변화시켜 결정화 리드 최적화 (증가 / 염 또는 침전제 농도 완충액 pH, 배양 온도를 감소 및 / 또는 단백질 농도).
2. Bicelles을 사용하여 결정화
   참고 bicelle 기술의보다 상세한 데모 나란히 Ujwal 및 Abramson이 ^(24)에 의해 설명되었다.
   1. 준비 또는 3를 구입CHAPSO 2.8의 비율 : ²⁵ 발행 프로토콜에 따라 하나 DMPC 이루어진 5 % bicelle 혼합물. 다른 농도는 분석뿐만 아니라 다른 지질 및 계면 활성제, 필요에 따라 될 수있다.
   2. ~ 10 ㎎ / ㎖ 농도로하는 세제 용해 단백질 샘플을 얻습니다.
   3. 1 V / V : 4의 비율로 시작, 얼음의 bicelle 혼합물을 추가 (단백질 bicelle) (예를 들어, 단백질의 40 μL에 bicelle 혼합물의 10 μl를 추가하고 피펫으로 빠르게 혼합).
   4. 얼음 30 ~ 60 분에 품어.
      참고 : 단백질 : bicelle 솔루션은 구름 조금 남아 있어야하지만 종종 약간 불투명 설정할 수 있습니다. 단백질 그러나 : bicelle 솔루션은 유백색 나타내는 강수를 전환 한 후 다른 변수 (즉, 세제, 버퍼 등) 분석해야한다. 새로운 샘플, 일을 소규모 테스트 (8 ㎕의 단백질과 2 μL의 bicelles)의 경우 이전에 불필요한 샘플 손실을 방지하기 위해 확장에 안정성을 확인하는 것이 좋습니다.
   5. 결정화 로봇을 사용하여, 하나 매달려 상용화 96 웰 화면을 사용하거나 ~ 200 NL 단백질 샘플 ~ 200 NL 결정화 버퍼로 구성 방울 방울 증발 방법을 앉아 심사 넓은 매트릭스 결정화를 수행합니다.
   6. ~ 21 ° C에서 결정화 번호판을 품어. 실체 현미경을 사용하여 결정 성장을위한 주간 판을 검사합니다.
   7. 체계적인 방식으로 결정화 상태의 성분을 변화시켜 결정화 리드 최적화 (증가 / 염 또는 침전제 농도 완충액 pH, 배양 온도를 감소 및 / 또는 단백질 농도).
3. 지질 입방 위상을 사용하여 결정화 (LCP)
   주 : LCP 기술의보다 상세한 데모 나란히 리우 Cherezov ^{26, 27에} 의해 설명되었다.
   1. ~ 20 ㎎ / ㎖ 농도로하는 세제 용해 단백질 샘플을 얻습니다.
   2. 사전 따뜻한 모노​​ 올레에 ~ 40 ºC. 하중60 μl를 하나의 기밀 100 μL 주사기와 다른에 40 ㎕의 단백질 샘플로 모노 올레.
   3. 혼합 커플러를 사용하여 공기를 도입하지 않도록주의하면서 주사기를 연결합니다.
   4. 시료가 투광성 균질하게 될 때까지 완전히 다른 한 주사기로 혼합물을 밀어 주사기 플런저에 교대로 압력을 가하여 온화하게 혼합한다.
   5. LCP 방법을 위해 설계된 결정화 로봇을 사용하여, 100 NL 단백질 시료 750 NL 결정화 버퍼로 구성 방울과 샌드위치 스타일의 결정화 플레이트 (0.1 mm 우물 두께)로 시판되는 96 웰 화면을 사용하여 선별 넓은 매트릭스 결정화를 수행합니다.
      주 : 필요한 경우 드롭 비율은 조정될 수있다. 또한, 고체 커버 (즉, 유리 또는 두꺼운 플라스틱) 판의 처리로 방울 잘 대해 이동할 수 있도록하는 경향이 방울 멋지게보다는 박막을 지원하는 것이 좋습니다.
   6. 결정화 페이지를 품어하는 가를 ~ 21 ° C에서. 실체 현미경을 사용하여 결정 성장을위한 주간 판을 검사합니다.
   7. 체계적인 방식으로 결정화 상태의 성분을 변화시켜 결정화 리드 최적화 (증가 / 염 또는 침전제 농도 완충액 pH, 배양 온도를 감소 및 / 또는 단백질 농도).

결과

YiuR는 예 르시 니아 페스티에 대해 추정 백신 대상인 TonB 종속 철 수송한다. 원래는 마이크로 어레이 분석을 사용하여 확인 하였다. 여기서, X 선 결정학을 이용 YiuR의 구조를 결정하기 위해 수행 된 단계 (도 9)를 설명한다. 클로닝, YiuR의 DNA 서열 (마이너스 N 말단 신호 서열) PCR은 게놈 DNA의 증폭 및 TEV 단백질 분해 효소 사이트 다음에 N 말단 pelB 신호 서열 및 10 배 - 히스티딘 친 화성 태그를 함유하는 벡터에 서브 클로닝. 표현의 경우, YiuR 포함하는 플라스미드 ~ 0.5 _{(600) 중독에} BL21 (DE3) 유능한 세포와 5 ml의 스타터 문화를 성장하는 데 사용되는 하나의 식민지로 변신했다. TB 배지 750 ml를 함유 십이 플라스크는 스타터 배양액 1mL를 접종하고 (220 rpm에서 진탕) 20 ºC에서 3 일 동안 성장시켰다....

토론

β-배럴 OMPs는 세균, 미토콘드리아와 엽록체 그람 음성에 필수적인 역할을 제공하고 이러한 각각의 세포 기관의 외부 막에 필수적인 분자 메커니즘에 대한 풍부한 정보를 제공하는 구조 분석을위한 중요한 표적이다. 그러나, 구조 분석을 위해 충분한 샘플을 제조 항상 간단하지 않으며, 따라서, 일반적인 파이프 상세히의 결정 구조의 처리를 설명하는 구조 결정을위한 타겟 β 배럴 OMPs 충분한 양의 생산을 위해 제공된다. 이러한 프로토콜 테스트 및 그람 음성 박테리아에서 가장 OMPs 작동하는 것으로 확인되었지만, 그 한계는 표현과 정제를위한 다른 방법이 필요할 수 있습니다 특히 미토콘드리아와 엽록체에 대한 몇 가지 목표는, 거기에있다. 따라서, 여기에 방법은 대부분의 그람 음성 박테리아에서 OMPs을 포함 프로젝트, 아직 발현 수준에 적용해야정제 된 시료의 양 및 대상 OMP에 따라 달라질 것이다.

구조 연구를위한 β-배럴 OMPs의 발현에 대한 두 가지 일반적인 방법이있다 (1)...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PCR 열순환기	Eppendorf, BioRad-Media
Shaker	New Brunswick, Infors HT-UV-vis
분광계	Eppendorf-SDS-PAGE
결정화 로봇	TTP Labtech, Art Robbins-Any		가 여기에서 작동해야 합니다
		.
SDS-PAGE 및 네이티브 겔	BioRad, Life Technologies	4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)
AkTA Prime	GE	Healthcare-AkTA
Purifier	GE
	Eppendorf-Centrifuge
(low-medium speed)	Beckman-Coulter-Ultracentrifuge
(high 속도)	Beckman-Coulter-SS34
로터	Sorvall-Type
45 Ti 로터	Beckman-Coulter-Type
70 Ti 로터	Beckman-Coulter-Dounce
균질화	Fisher Scientific	06 435C
Emulsiflex	Avestin	-
투석 튜빙	Sigma	D9652
LCP 도구	Hamilton, TTP Labtech-VDX
24웰 플레이트	Hampton Research	HR3-172
샌드위치 플레이트	Hampton Research, 분자 치수	HR3-151, MD11-50 (MD11-53)
Grace 결정화 시트	Grace Bio-Labs	875238
HiPrep S300 HR 컬럼	GE Healthcare	17-1167-01
Q-Sepharose 컬럼	GE Healthcare	17-0510-01
결정화 스크린	Hampton Research, Qiagen, Molecular	Dimensions-Gas-tight
syringe (100 ml)	Hamilton