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방법 논문

예 생체 내 창자 주머 니나는 위장 질환 모델에서 점막 투과성을 평가하는

21.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53250

⸱

2016년 2월 9일

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Science and Pharmacy, University of Newcastle

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 장 장벽 기능의 생체 외 모델로 절제된 장 조직 제제 또는 "장 주머니"의 사용을 설명합니다. 이 모델은 소화기 질환의 동물 모델에서 특정 장 부위에서 상피 장벽과 점액 겔 층 모두의 무결성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

상피 장벽 위장관 제 타고난 방어 선택적 작은 상피 걸쳐 분자와 거의 상피 고분자 전송 금지의 이동을 제한하는 하부 조직 구획 루멘으로부터 수송을 조절한다. 이 선택은 친 유성 분자 양쪽 정점 수용체 상피 단단한 접합부 단백질 복합체의 전송을 제한 점액 겔 층에 의해 결정된다. 상피 세포의 시험 관내 세포 배양 모델은 편리하지만, 모델, 그들은 부족한 미생물, 점액 젤, 상피 세포와 면역 체계 사이의 상호 작용의 복잡성. 한편, 사이트 특이성 표시없이 장내 흡수 또는 투과율의 생체 내 평가를 수행 할 수 있지만, 이러한 분석은 전체 위장관 흡수를 측정한다. 생체 외 투과 검정을 "장 주머니"를 사용하여; 장 사이트 특이성의 추가적인 장점으로, 전체 장 무결성 또는 특정 분자의 비교 수송를 측정하는 신속하고 민감한 방법입니다. 여기에서 우리는 투과성 연구를위한 장 주머니의 준비 및 명백한 투자율 (P 응용 프로그램)의 계산을 설명 장 장벽을 가로 지르는 분자. 이 기술은 평가 약물 흡수의 방법으로 사용할 수도 있고, 위장관 질환의 동물 모델에서의 지역 상피 장벽 기능 장애를 조사.

서론

위장관 장 상피 장벽 인간 성인 400 평방 미터로 추정 점막 표면적이다. 따라서, 지속적 미생물 섭취 약물, 영양분 및 박테리아 독소의 도전에 노출된다. 호스트는 허용 공생 박테리아 병원균 구분하지해야하지만 동시에 영양소 흡수를 허용하면서, 상피 장벽을 넘어에서 이러한 종의 분자 및 분비를 방지한다. 따라서, 장 상피 세포의 역할은 내강 내용 1 선택적 장벽으로 작용한다. 이 구성 적 및 유도 메커니즘이 이루어진 반응 시스템을 통해 생물학적 작용 점막 상피에서 타고난 방어 시스템에 의해 부분적으로 달성된다.

상피 장벽 기능의 상실은 위장관 질환의 특징 인 다수의 병리이다. 생체를상피 장벽 기능의 검사는 추적 분자의 구강 투여 이후 혈청 분석 (3)를 통해 평가 될 수있다. 그러나,이 기술은 장벽 기능 장애의 사이트에 같은 징후를 제공하지 않습니다. 생체 외 및 트랜스 웰 시스템 (3)를 사용하여 각각 챔버 4,5 Ussing transepithelial 저항의 생체 평가에서 일반적으로 상피 장벽 기능의 대리 지표로 사용하지만, 동물 모델 (6)의 기여 질병 생리학 부족합니다. 이 프로토콜에서는 다수의 레벨에서 점막 장벽 기능을 평가하는데 사용될 수있다 장 무결성 및 직접 지역화 평가 수 생체 조직 준비 모델을 설명한다. 중요한 것은,이 방법은 질환의 동물 모델에 적용 할 수 있거나, 또는 그의 약학 적 점막 방벽 기능 부전의 깊이 질의에서 허용하도록 조작 될 수있다.

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프로토콜

이 프로토콜의 모든 동물의 작업 절차를 승인 뉴캐슬 동물 윤리위원회의 대학 엄격하게 준수하여 수행됩니다.

악기, 문화 미디어와 요리 1. 준비

  1. 37 미리 따뜻한 미디어 199 (TC199) 또는 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM)는 미디어 기음. 사전 네이트 95 %, O2 / 5 % CO 2로 버블 링하여 매체. 매체가 7.3의 최종 pH가 있는지 확인합니다.
  2. 각 주머니 두 5cm 섹션을 절단하여 봉합을 준비합니다. 루프 닫히지 않은 매듭에 봉합.

2. 해부 및 위장관의 제조

  1. 안락사 전에 고체 음식을 12 시간 인출. 원하는 경우,이 기간 동안 영양 젤 보충에 동물을 배치합니다.
  2. 나트륨 펜토 바르비 과다 복용에 의한 쥐를 안락사 ([200 ㎎ / ㎏, 복강 내 주사) 기관 윤리 프로토에 따라 자궁 경부 전위 다음COLS는 복부와 흉부에 70 % 에탄올을 스프레이.
  3. 가위 사용하여 복부의 중앙에 수평 절개를하고 복막을 노출.
  4. 분리 유문 괄약근의 위의 상부 소장을 절단하고 항문에서 대장을 절단하여 위장관을 제거하기 위해 진행합니다. 부드럽게 장간막을 제거하기 위해 집게를 사용합니다. 미리 예열, 산소 매체의 창자를 놓습니다.
  5. 소장의 부분을 식별하는 투과성 (그림 1)에 대한 평가 및 장관의 나머지에서 무료로이 부분을 절단한다.
    1. 동물 사이의 일관성을 유지 위장, 십이지장 및 소장의 상대적인 부분을 측정하고, 맹장 및 결장 회장 상대적인 부분을 측정하기 위해.
    2. 조직 세그먼트를 선택하는 경우, 이러한 패치 파이어 등 점막 - 관련 림프 조직의 존재를 참고. 이러한 작은 끄덕임으로 식별 될 수있다루멘의 장막 측 ules.
    3. 1 ML의 주사기를 사용하여 부드럽게 예열 PBS (37 ° C)와 페트리 접시에 장 세그먼트의 내강 내용을 세척하십시오. 이 대변 내용에 폐기되거나 저장 될 수 -80 원하는대로 향후 분석을 위해 C를 °.

장내 주머 니나 3. 준비

  1. 시험 화합물 또는 분자의 300 μL 부피 1 mL를 주사기를 준비한다. 점막의 무결성, FITC - 덱스 트란 M.Wt.의 1 ㎎ / ㎖ 솔루션 4400이 사용될 수있다. 4,400-70,000 다에서 크기에 이르기까지 프로브가 증가 감도를 사용할 수있다. 안전하게 주사기에 작은 동물 혈관 카테터를 장착한다.
  2. 장 세그먼트의 오프닝에서 5cm 측정 및 세그먼트를 묶어 안전하게이 시점에서 봉합 루프로 마감했다. 조심스럽게 소장의 개구부 주위에 미리 연결 봉합 루프를 배치하고 무딘 카테터를 삽입합니다. 장 세그먼트를 확보 할 수 있도록 폐쇄 올가미를 당겨모든 용액을 주입 보장, 소장에 주사기에서 300 μl의 볼륨을 놓습니다.
  3. 동시에 장 낭의 폐쇄를 고정 봉합 올가미를 잡아 당기면서 부드럽게 카테터를 제거합니다. 소장에서 느슨한 장 주머니를 잘라 37로 예열 산소 매체의 20 ㎖로 가득 50 ML 원뿔 관에 배치 기음.

투수 4. 측정

  1. 가열 된 물을 욕조에 장 주머니를 포함 장소 원뿔 튜브는 37로 설정 기음. 0, 30, 60, 90 및 120 분의 시점에서, 각각의 인스턴스에 신선한 매체와 함께 100 ㎕의 부피를 대체하는 96 웰 플레이트 원뿔 튜브 및 전송에서 100 μL 샘플을 취할.
  2. 최종 샘플을 취한 후, 점막 표면을 노출시키는, 봉합사 시점과 세그먼트의 길이 아래로 열린 주머니를 잘랐다.
  3. 각 장 세그먼트의 길이 및 폭을 측정한다. 다목적 경우빨강, 스냅 -80에서 세그먼트 저장을 동결 분자 분석을위한 RNA 안정화 용액에서 단백질 또는 생화학 적 분석, 또는 대안 적으로, 상점에 대한 C를 °.
  4. 1 1 × 10 -6까지 FITC-태그 분자 로그 희석의 표준 곡선을 구축합니다.
  5. 형광 플레이트 리더에 FITC에 대한 측정 시료와 표준, FITC 여기 / 방출 / 519 내지 495 나노 미터.

각 개인 소장 골목에 대한 명백한 투수 5. 계산

  1. 초에 시간 단위로 변환합니다.
  2. 각 타임 포인트에 대한 누적 농도, Q를 계산할

    Q의 t = (C t의 *의 V r에) + (Q t 합 * V s의),     장소 :

    Q의 t = 시간 t에서 누적 농도
    C의 t = 시간 t에서의 농도
    수신 측에서 V의 R = 볼륨
    이전의 모든 Q의 t의 Q T는 합계 = 합계
    V S =볼륨 샘플링
  3. 플롯 시간 (T) 대 Q 및 기울기를 계산 : δQ / ΔT
  4. 명백한 투과성을 계산 (P 응용 프로그램)

    P 앱 = (δQ / ΔT) / (A * 공동), 장소 :

    조직의 면적 A =
    C 0 = 초기 농도

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결과

이 프로토콜은 위장 질환의 동물 모델에서 장 장벽 기능 지역적 변화를 조사하기 위하여 사용될 수있다. 위장관 (7)의 다양한 영역에서의 점막 표면에 걸쳐 paracellular 프로브의 유량을 측정함으로써, 상피 꽉 접합 무결성을 평가할 수있다. 또한, 크기 (도 2) 또는 소수성 (도 3), 상피 섭동의 정도 또는 점막 겔층의 무결성을 paracellular 프로브의 특성을 변화시킴으로써,도 측정 할 수있다. 더 큰 분자량 마커를 사용하는 등 transepithelial 전기 저항 (봉사자) 등의 전기 생리 측정에 의해 명백하지 않을 수 있습니다 신중한 변화를 감지, 점막의 paracellular 침투성의 더 민감한 심문을 허용하지만, 어떤 paracellular 전송을 허용하기에 충분하다 (그림 2). 뮤코샐 염증은 일반적으로 위에 놓 및 상피 인터페이스를...

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토론

여기서는 점막 장벽 기능 생체을 평가 단리 장내 주머니의 제조 상세한있다. 소장 SAC 제제는 주로 소장 전체 후보 약물의 흡수를 시험하는 제약 연구에서 사용되어왔다. 그러나 이러한 분석은 동일하게 장 질환의 연구를 위해 적합하다. 지역 및 투과성의 사이트에 특정 평가에 따라 크게 다를 수 있습니다 장 투과성은 소화 질환 점막의 무결성의 지역 중요성에 대한 이해를 할 수 있습니다. 분석은 강력하고 정확한 생리 학적 조건에서, 고립 된 조직은 최대 6 시간의 사후에 대한 실행 가능한 남아있다. 안락사 후, 티슈 제조 속도가 중요하며, 소장은 그 내용 플러시 가능한 한 신속하게 산소 매체에 전사한다. 동물들 사이의 일관성을 확보하기 위해서는 정확한 장 영역 identifi 것을 필수에드 (그림 1). 십이지장과 공장의 세그먼트가 뱃속에서 측정하는 동안 대장과 회장 세그먼트, 맹장에서 측정하는 것이 좋습니다. 다른 균주 또는 형질 전환 동물 모델이 커야하고 GITS 이상을 가질 수 있기...

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공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 National Health and Medical Research Project Grant APP1021582와 Sparke Helmore/NBN Triathlon and the Estate of the 故 Leslie Kenneth McFarlane이 후원하는 Hunter Medical Research Institute 보조금의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
데칸텔  비흡수성 실크 봉합사Braintree ScientificSUT-S 116
Media 199 (TC199) Life Technologies11043-023형광을 방해하므로 페놀 레드가 없습니다
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Life Technologies21063-045형광을 방해하므로 페놀 레드가 없습니다
N-아세틸시스테인Sigma Aldrich배지에서 10mM에서 사용
소동물 혈관 카테더: PhysiocathData Sciences International277-1-002
FITC-덱스트란 4,400MW시그마 알드리치FD-4
FITC-덱스트란 20,000MW시그마 알드리치FD-20
FITC-덱스트렌 70,000MW시그마 알드리치FD-70

참고문헌

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