방법 논문

형광 표지 된 나노 입자를 사용하여 쥐, 인간과 돼지 유래의 살아있는 세포에서 세포 내 유전자 발현의 검출

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DOI:

10.3791/53268

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2015년 11월 13일

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1Department of Cardiovascular Surgery, German Heart Center Munich, Technische Universität München, 2Institute for Medical Microbiology, Immunology, and Hygiene, Technische Universität München, 3Clinical Cooperation Groups: "Antigen-specific Immunotherapy" and "Immune Monitoring", Helmholtz Center Munich (Neuhererg), Technische Universität München, 4DZHK (German Center for Cardiovascular Research) – Partner site Munich Heart Alliance

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 원고는 살아있는 세포에서 직접 형광 표지된 나노 입자의 세포내이입 후 세포 내 유전자 발현을 검출할 수 있는 새로운 기술을 설명합니다. 이 방법은 세포의 조작을 필요로 하지 않으며 표적 유전자 또는 종에 대해 제한되지 않습니다.

초록

체세포를 유도만능줄기세포(iPS)로 재프로그래밍하는 것은 마우스, 쥐, 인간, 돼지 등을 포함한 다양한 포유류 종에서 성공적으로 수행되었습니다. iPS 클론의 검증은 주로 서로 다른 다능성 유전자의 내인성 발현의 검출에 의존합니다. 이러한 유전자는 대부분 세포핵에 위치한 전사 인자를 나타냅니다. 전통적으로 이들의 내인성 발현에 대한 증거는 세포 고정 후 면역조직화학적 염색에 의해 제공됩니다. 이 접근 방식은 추가 실험을 위해 검증된 클론을 보존하기 위해 이 초기 단계에서 각 클론의 복제 배양이 필요합니다. 본 프로토콜은 형광을 통해 살아있는 세포에서 직접 세포 내 유전자 발현을 평가할 수 있는 유전자 특이적 나노입자를 사용하는 접근 방식을 설명합니다. 나노 입자는 표적 mRNA에 상보적인 염기서열을 가진 포획 가닥에 결합된 중앙 금 입자와 담금질된 리포터 가닥으로 구성됩니다. 이러한 나노입자는 활발하게 세포내이입되고 표적 mRNA는 리포터 가닥을 대체한 다음 형광을 발하기 시작합니다. 따라서 특정 표적 유전자 발현을 현미경으로 직접 검출할 수 있습니다. 또한, 방출된 형광은 유세포 분석에 의해 특정 유전자를 발현하는 세포의 식별, 분리 및 농축을 가능하게 합니다. 이 방법은 표적 세포의 조작 없이 배양 중인 살아있는 세포에 직접 적용할 수 있습니다.

서론

2006 년, 새로운 접근 방식은 만능 상태로 체세포를 재 프로그래밍 설명했다. 가능한 리 프로그래밍의 배열 사전 선별 한 후 쥐과의 섬유 아세포가 성공적으로 유도 된 다 능성 줄기 세포 (IPS) 레트로 바이러스 형질 도입 및 네 개의 전사 인자의 과발현 소위 전환 될 수 인자 (인 Oct4, Sox2이, Klf4, C-Myc와 1). 이어서이 방법은 인간을 효과적으로 2, 3 원숭이, 쥐 4, 5 개, 양, 돼지 6 7 포함한 다른 포유류의 체세포를 이용하여 재현되었다. 또한, 프로토콜의 생략 또는 MYC가 8, 9를 발표 한 C-잠재적 발암 전사 인자를 교체를 수정했습니다.

관계없이 초기 프로그래밍의 성장 콜로니 진정한 능성이 힘들고 시간 소모적 인 작업을 확인하는 접근. 주요 단점이들 분석의 대다수가 살아있는 세포에서 수행 할 수 없다는 것이다. 이러한 OCT4, SOX2, NANOG 또는 REX1 설립 능성 인자 핵에있는 전사 인자를 나타내고, 그 검출은 RT-PCR 분석 (10)에 대해 면역 조직 또는 세포 용해에 앞서 세포의 정착이 필요 -. (12) 그 후,이 세포는 미래 손실 각 식민지의 복제 문화를 필요로하는 실험.

따라서, 살아있는 세포의 분화능을 분석하는 기술이 매우 바람직하다. 몇 가지 접근 방법은 참으로 막 기반의 항원에 대한 항체를 이용하여 살아있는 세포에서 직접 수행 할 수있다 (예를 들면. TRA-1-60, SSEA4) (12), 형광 특별히 배아 줄기 레이블을 알칼리 포스 파타 아제 (13) 또는 작은 분자를 감지하는 염료를보고 (들) 및 유도 만능 줄기 세포 (14). 그러나, 그럼에도 불구하고 항체는 세포에 악영향 각각 영향을 미칠 수있는 메트OD는 단일 다 능성 마커로 제한된다. 마지막으로, 형광 표지 분자는 살아있는 세포의 염색을 허용 헤어핀 구조, 듀얼 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 15을 설명 하였다. 이 접근법은 많은 유전자에 적용 할 수도 있지만, 기술은 성장 만능 콜로니에 해당되지 않는 단일 세포 현탁액의 nucleofection을 필요로한다.

몇 년 전에 유전자 특이 나노 입자는 인간 SKBR3 유방암 세포 (16)에 바이 빈 발현을 분석하기 위해 기술되었다. 이 원고는 금 나노 입자 복합체의 사용을 통해 라이브 ES 및 유도 만능 줄기 세포의 다 능성 마커를 감지하는 새로운 혁신적인 접근 방식을 설명합니다. 이러한 나노 입자는 상호 보완적인 RNA 서열과는 Cy3 표지 기자 가닥을 들고 결합 캡처 가닥 중앙 금 입자로 구성되어 있습니다. 기자 가닥의 형광 신호는 중앙 금 입자에 의해 급냉된다. 또한, 적절한나노 입자는 부정과 긍정적 인 컨트롤, 각각 (그림 1)을 제공하고 있습니다. (도 3) 애플리케이션에 대한 나노 입자는 단지 배지 (도 2)에 첨가하고, 엔도 사이토 시스를 통해 세포를 입력한다. 표적 RNA 발현되는 경우 그 다음 형광 신호를 발생 리포터 가닥 변위. 이 방법은 표적 세포 및 표적 유전자의 발현의 조작 생균 직접 형광 현미경 하에서 광학적으로 모니터링 될 수있는 필요로하지 않는다. 또한,이 기술은 IPS 세포의 경우 종간 원하는 표적 유전자에 적용 할 수 있고, 따라서 다양한 연구 분야에 사용될 수있다. 마지막으로, 유세포는 Cy3에 양성 세포의 식별 및 농축을 허용 분석한다.

프로토콜

미디어, 시약 및 세포 배양 조건 1. 준비

  1. 인간의 HEK 293 배아 신장 세포
    1. DMEM / 햄 F-12 배지에서 배양 HEK 293 세포 (CRL-1573, ATCC)을 5 % FCS, L- 글루타민 (2 mM)을하고, 페니실린 (100 U / ㎖) / 스트렙토 마이신 (100 ㎕ / ml)이 첨가.
    2. 세포 통로, PBS로 한 번 세포를 씻어 0.05 % 트립신 / EDTA를 추가하고 37 ℃에서 3 분, 5 % CO 2 품어. 15 ML 튜브에 세포를 전송은 1,200 RPM (300 × g으로)과에서 5 분 동안 원심 분리기는 새로운 T25 문화 플라스크에 약 5 × 5 세포를 전송합니다.
  2. 쥐 배아 섬유 아 세포 (MEFs에)
    1. 개별 6- 웰에 0.1 % 젤라틴 용액 1 ㎖를 첨가하고 1 시간 동안 실온 (RT)에서 배양한다. 실온에서 대기음 액체 저장 사용할 때까지.
    2. DMEM에서 배양 MEFs에 10 % FCS, L- 글루타민 (2 mM)을 L 글루코스 (4.5 g / l), 나트륨 피루 베이트 (1 mM)을하고, 페니실린 (100 U 보충 /젤라틴 - 코팅 된 6- 웰 플레이트에 ㎖) / 스트렙토 마이신 (100 μg의 / ㎖).
    3. 6 웰 플레이트에 MEFs에 배포하고이 합류 할 때까지 성장 할 수 있습니다. 2.5 시간이 세포를 체포하기위한 마이 토마 이신 (5 μg의 / ㎖)를 추가합니다. 대기음 매체는, 완전한 MEF 매체로 두 번 세포를 씻어 각 6 웰에 3 ㎖에게 MEF 매체를 추가합니다. 이 세포는 쥐와 돼지 만능 줄기 세포 피더 층의 역할을한다.
  3. 쥐의 ES 및 유도 만능 줄기 세포의 문화
    1. 15 % FCS, L- 글루타민 (2 mM)을 L 글루코스 (4.5 g / l), MEM 비 필수 아미노산 (1X), β 머 캅토 에탄올 (0.1 mM)을 가진 DMEM 배지를 보충, 마우스 ES 배지를 제조 및 백혈병 억제 인자 (1.000 U / ㎖).
    2. , 무 혈청 DMEM 한 번 성장 체포 MEFs에 6-우물을 씻어 2 ml의 마우스 ES 매체와 쥐의 유도 만능 줄기 세포 (합류 접시의 세포의 20 %)를 추가합니다. 매일 세척 세포는 한 번 무 혈청 DMEM와 2 ml의 신선한 마우스 ES 매체를 추가 할 수 있습니다.
    3. 세포 통로에 잘 무 혈청 DMEM에 한 번 각을 씻고, 0을 추가0.25 % 트립신 / EDTA와 37 ℃에서 3 분, 5 % CO 2 품어. 1,200 rpm에서 5 분 동안 15 ML 튜브, 원심 분리기로 전송 세포 (300 × g으로), 재현 탁의 500 μL 마우스 ES 배지에서 세포와 신선한 6 잘 2 ml의 마우스 ES 매체에 서스펜션의 100 μl를 추가 MEF 피더 층.
  4. 돼지의 문화는 세포를 유도 만능 줄기
    1. 돼지 만능 매체를 제조 보충 DMEM / 햄 F-12 배지 20 % 녹아웃 혈청, L- 글루타민 (2 mM)을 MEM 비 필수 아미노산 (1X), β 머 캅토 에탄올 (0.1 mM)을하고, 페니실린 (100 U / ㎖) / 스트렙토 마이신 (/ ㎖ 100 μg의). 2~3주 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 저장소를 통해 필터링합니다. 처음 사용시의 bFGF (10 NG / ml의 최종 농도)를 추가합니다.
    2. 무 혈청 DMEM / 햄의 F-12과 추가 1.5 ml의 돼지 만능 줄기 매체와 돼지 만능 줄기 세포 (합류 접시의 세포의 10 %)로 한 번 성장 체포 MEFs에 6-우물을 씻어. 무 혈청 DMEM에 한 번 매일 세척 세포 / 햄의 F-12 추가를 1.5 ml의 신선한 돼지 만능 줄기 매체.
    3. 해리 완충액 2.5 % 트립신, 콜라게나 제 IV (10 ㎎ / ㎖), 칼슘 - 무료 PBS로 녹아웃 혈청 (20 %) 및 CaCl2를 (1 mm)를 추가 제조 하였다. PBS로 두 번 세포를 세척하고 37 ℃에서 5 분, 5 % CO 2 분리 버퍼에 품어. 1,200 RPM (300 × g으로)에서 5 분 동안 15 ML 튜브, 원심 분리기에 세포를 전송합니다.
    4. 500 μL 신선한 돼지 만능 줄기 매체에서 돼지 만능 줄기 세포를 재현 탁하고 MEF 피더 층으로 신선한 6 웰에 1.5 ml의 돼지 만능 줄기 매체에 서스펜션의 50 μl를 추가합니다. 매일 세척 세포를 한 번 무 혈청 DMEM / 햄의 F-12과 추가 1.5 ml의 신선한 돼지 만능 줄기 매체.
  5. 인간 유도 만능 줄기 세포의 공급이없는 문화
    1. 4 ℃에서 기저막 제제를 함유 원래 바이알을 해동 또한 사용할 때까지 -20 ℃에서 얼음 - 냉각 된 무 혈청 DMEM / 햄 F-12-8 ㎎ / ㎖, 분취 저장 희석.
    2. 베이스의 나누어지는을 해동, 표준 막 4 ° C에서 제조하고 빙냉 무 혈청 DMEM / 햄 F12 (90 μg의 / ml)로 희석. 피펫 1 3cm 배양 접시에이 용액 ㎖의 전체 표면이 적용되도록 부드럽게 소용돌이 친다. 최대 일주일 동안 4 ° C에서 파​​라 필름 및 저장과 요리를 밀봉합니다. 세균 배양의 사용 전은 기저막 제제의 중합을 할 수 있도록 37 ° C에서 30 분 또는 RT에서 3 시간 동안 배양 접시.
    3. 요리에서 대기음 매체 기저막 제제로 코팅하고, 무 혈청 DMEM / 햄 F-12로 두 번 세척 하였다. 배양 접시와 인간 유도 만능 줄기 세포 (합류 접시의 세포의 10 %)에 1.5 ml의 E8 매체를 추가합니다. 매일 세척 세포를 한 번 무 혈청 DMEM / 햄의 F-12와 1.5 ml에 추가 신선한 E8 매체와.
    4. 세포 통로, PBS로 두 번 요리를 씻어 1 ml의 PBS / 0.5 mM의 EDTA를 추가합니다. 실온에서 5 분 동안 요리를 품어. 현미경으로 세포를 모니터링. 참고 : 식민지와 APPE을 모아 시작하면AR은 전송을위한 준비가되어 구멍이 있습니다.
    5. 액체를 대기음 부드럽게 피펫 팅 아래에 의해 세포를 1.5 ml의 E8 매체를 추가하고 분리합니다. 15 ㎖의 튜브에 세포를 전송, 1,200 RPM (300 × g으로)에서 5 분 동안 원심 분리, 500 μL E8 배지에서 재현 탁하고 기저막 제제로 코팅 신선한 배양 접시에 1.5 ml의 E8 매체 현탁액 50 μL를 추가 .

종 국경을 넘어 대상 시퀀스 2. 디자인

  1. 선택 기준 인간, 쥐 및 표적 유전자 (GAPDH, NANOG, GDF3)의 돼지의 cDNA 서열과 CLUSTAL 다중 서열 배열 분석을 수행한다.
    참고 :이 종 사이에 상동 서열을 나타냅니다.
    1. 다음과 같은 여러 정렬 설정 사용 (고정) 갭 페널티 (10), 갭 페널티 (변화) 5, 전이 가중치 0, 갭 분리 페널티 범위 (8), 지연 40 %의 정체성을, 반복의 최대 수는 3을 수행 할 수 있습니다.
  2. 프로브 설계 및 제조를위한 제조 업체 (재료의 표 참조)에 원하는 대상 시퀀스를 제출합니다.
    주 : 제조 업체는 기술을 원하는 순서의 호환성을 확인합니다. 원하는 서열이 호환성이없는 경우, 제조자는 다른 서열을 제시 할 것이다.
    1. 전위 캡처 가닥 서열의 27 bp의 길이를 가지고 사용될 수있는 상 동성 영역을 보장한다.
      참고 : 그것은 단지 실제 세포 실험 개별 시퀀스의 기능의 명확한 증거를 제공합니다으로 선택한 표적 유전자에 대해 서로 다른 캡처 가닥 여러 가지 나노 입자를 주문하는 것이 좋습니다. 세 가지 다른 나노 입자 NANOG 표현식을 평가하기 위해 시험 하였다하면서 따라서, GAPDH 및 GDF3위한 두 개의 서로 다른 서열을 평가 하였다. 그들의 위치와 정확한 서열은 다른 곳에서 17 발표되었다. 제조업체는 상업적으로 nanop 제조원하는 시퀀스 기사와 동결 건조 된 형식으로 제공합니다.

3. 나노 입자의에서 재구성 및 세포 배양에 추가

  1. 어둠 속에서 4 ° C에서받는 즉시 동결 건조 된 나노 입자를 저장합니다.
  2. 100nm의 최종 농도를 제공 50 μL 증류수를 첨가하여 나노 입자를 재구성한다. 일단 어둠 속에서 실온에서 저장 나노 입자를 재구성. 주 :이 조건 하에서 그들은 1 년 이상 안정하다. 4 ° C에서 재구성 된 샘플의 보관에 악영향 안정성에 영향을 미칠 수 있습니다.
  3. 적용 2 일 (HEK 293 세포) 또는 8 nM의 (IPS 및 ES 세포)의 농도로 PBS와 나노 입자 원액을 미리 희석. 참고 :이 농도는 배양 접시에 최종 농도보다 높은 20 배입니다. 배아 줄기 세포와 유도 만능 줄기 세포, 나노 입자의 400 오후 현미경으로 쉽게 검출 형광 신호를 유도. HEK 293 세포의 경우, AC100 오후 oncentration 충분하다.
  4. 24- 웰 함유 237.5 μL 완전한 세포 배양 배지로 미리 희석 나노 입자의 12.5 μL 피펫. 다양한 크기의 우물, 그에 따라 볼륨을 조정합니다. 나노 입자의 평등 한 분배를 보장하기 위해 신중하게 접시를 소용돌이. 가습 분위기에서 CO 2, 37 ℃에서 밤새 (O / N) 세포를 인큐베이션하고, 5 %.
  5. 형광 현미경 - 다음날은 546 나노 미터 (640 nm의 발광 575)의 여기 파장으로 특정 유전자를 Cy3의 형광을위한 세포 배양 분석. 주 : 세포 유형 및 목적 유전자에 의존 할 수있다 충분히 강한 형광을 얻기 위해 필요한 기간. 이들 실험에서, 이것은 프로브 (16) 및 도포 후 20 시간 사이에서 관찰되었다.

유동 세포 계측법 4. 확인을 Cy3의 긍정적 인 세포 집단

  1. HEK 293 또는 1.1 또는 섹션 1.3에 명시된 조건을 사용하여 뮤린 ES 세포, R 성장espectively. 이전 FACS 분석에 어느 날 ES 세포를 뮤린하는 293 세포 (그림 6A 참조) 400 오후를 HEK 서로 다른 농도로 GAPDH 특이 나노 입자를 추가 할 수 있습니다. 가습 분위기에서 CO 2, 37 ℃에서 세포 O / N을 부화 5 %.
  2. 형광 현미경 하에서 유전자 특이 Cy3에 대해 유도 된 형광 세포 배양 분석.
  3. 포인트 1.1.2에서 규정 된 HEK에게 293 세포를 분리합니다. 원심 분리기는 200 μL 빙냉 PBS / 0.5 % BSA / 2 mM의 EDTA (FACS 완충액)에 1.5 ㎖의 튜브에 넣고 재현 탁. 유세포 분석까지 얼음에 어두운 세포를 유지합니다.
  4. 포인트 1.3.3에서 규정 된 쥐의 배아 줄기 세포를 분리합니다. 원심 분리기 200 μL 얼음처럼 차가운 PBS / 0.5 % BSA / 2 mM의 EDTA에서 1.5 ML 튜브 및 재현 탁로 전송합니다. 유세포 분석까지 얼음에 어두운 세포를 유지합니다.
  5. 요오드화 프로피 듐을 세포 응집을 방지하고, 추가 30 μM 필터를 통해 세포를 누르면 (2 μg의 / ㎖ 최종 농도)을 2 분FACS 분석에 앞서 죽은 세포를 제외합니다.
  6. 먼저 FSC-A / SSC-부분 집합에 계층 게이트를 설정 Cy3에 양성 세포를 분석하기 위해, FSC-H / FSC-W-일부와 SSC-H / SSC-W 부분 집합. 세포 파편 흩어져되지 않은 세포를 제외 전방 및 측면 산란을 사용합니다. PE-텍사스 레드에 PE를 표시 자신의 프로피 디움 요오드 염색으로 죽은 세포를 제외합니다. 를 Cy3-PE 양성 세포에 대한 최종 정렬 게이트를 수행합니다 (그림 4).

결과

나노 입자를 사용하여 살아있는 세포에서 특정 유전자의 세포 내 발현의 검출을 확인하고 설정하는 첫 번째 시도에서 우리는 인간 HEK 293 세포에서 구조적으로 발현 하우스 키핑 유전자 (GAPDH)를 이용하여 파일럿 실험을 실시했다. 이 실험에서 사용 된 나노 입자의 농도는 제조자의 추천에 따라 선택되었다. O / N 항온 처리 (도 5a) 후 형광 현미경 하에서 볼 수 있었다 이들 세포에서 분명한 Cy3에 형광을 유발 100 μM의 최종 농도로 배양 배지에 GAPDH 특이 프로브의 첨가. 두 제어 결과를 입증하는 실험에 포함되었다. 하나의 제어는 리포터 가닥 포유류 또는 진핵 세포에서의 일치 서열이없는, 소위 "스크램블"나노 입자를 포함한다. "스크램블"나노 입자는 불특정 배경 fluorescen을 결정한다가능한 프로브 저하 또는 형광의 불완전 담금질에 의한 CE. 스크램블 프로브의 첨가는 무시할 만 한계 형광 신호 (도 5b)을 생산했다. 영구적으로 형광을 "이해"컨트롤은 다른 세포 유형에 따라 다를 수 있습니다 엔도 시토 시스에 의해 나노 입자를 포함하는 세포의 능력을 결정하는 데 도움이됩니다. 이들 양성 대조군 입자는 HEK 293 세포 (도 5C에게)에서 밝은 형광 신호를 생성. 따라서, 무시할 배경 신호에 세포 내 유전자의 특정 형광 신호를 기록하는 기술의 실현 가능성을 확인 하였다. 그것은 배경 신호 및 특정 형광의 차이는 시간이 지남에 따라 감소한다는 것을 언급해야한다. 특정 형광 점차 (그림 5D)를 페이드 동안 저하 또는 불완전 담금질을 조사 할 예정 배경 증가한다. 같은 GAPDH 특이 나노 입자가쥐, 돼지와 양의 기원 (17)의 차 섬유 아세포 문화에서 테스트되었습니다. 대상별 형광 가능성으로 인해 이러한 문화의 상대적으로 낮은 증식 용량, 오히려 약한 동안이 세포는 HEK보다 293 세포를 훨씬 더 높은 배경 신호를 생성한다.

파일럿 실험은 다른 종으로부터 유래 된 다 능성 만능에서 유전자 발현의 검출을 위해이 기술을 사용하도록 우리를 자극했다. 이러한 목적 및 NANOG GDF3은 다 능성 세포를 18로 표현 될 것으로 알려진 둘, 분석 하였다. Nkx2.5 심장 증강 유전자 변형 마우스 라인 (19)의 꼬리 끝 섬유 아 세포에서 파생 된 최초의 유도 만능 줄기 세포에서 조사 하였다. 강한 형광 신호가 모두 유전자를 얻었다 (도 6a)와, 스크램블 제어 무시할 Cy3에 대해 형광 (데이터는 미도시). 유사한 결과가 인간과 돼지의 만능 줄기 세포 (그림 6에 얻었다B와 C). 중요하게는, 형광 신호는 만능 콜로니로 제한하고, 마우스 및 돼지의 만능 (도 6a 및 C에서 화살표 참조) 급전 층으로서 사용되는 섬유 아세포 라벨 않았다. NANOG 유전자 발현 분석은 또한 실리코 예측하지 모든 시퀀스가 마지막 작동 "좋은"것으로 밝혀. 유사한 결과가 인간과 돼지의 기원 만능 줄기 세포에서 얻은 쥐의 유도 만능 줄기 세포에서 100 % 시퀀스 일치 (그림 6D).에도 불구하고 스크램블 제어에 필적 거의 형광 신호를 유도하지 NANOG - 특정 나노 입자의 세 가지 디자인 중 하나 이 프로브 (데이터는 미도시). 따라서, 나노 입자 하나 하나의 프로브 설계 기능을 미리 평가 될 필요가있는 동안 종 국경을 넘어 능성 유전자 발현을 검출하는데 사용될 수있다.

현장에서의 유망한 결과세포 배양 접시에서 살아있는 세포의 표지는 유동 세포 계측법에 의해 정량적으로 유전자 발현을 분석하기 위해 우리를 자극했다. 이를 위해서 GAPDH 특이 나노 입자는 표적 세포 집단 내의 표지 효율을 비교하기 위하여 293 개의 단일 층을 HEK 위해 그레이 디드 농도로 첨가 하였다. 형광 현미경에 의해 평가 된 바와 같이 강화 된 Cy3가 유발 형광 나노 입자를 수신하지 않은 세포에 비해 낮은 농도로 나타났다. 나노 입자의 농도 증가는 인 시츄 (도 7A)에 HEK 293 세포의 농도 의존적 명확 형광을 유도. 유세포 분석으로 이들 세포를 실시은 농도 의존적​​ 표지 효율을 확인 하였다. 나노 입자의 가장 높은 농도 (도 7B)인가시 Cy3에 양성 세포의 빈도는 현저히 (칠중 이상) 증가 하였다. Nkx2.5의 심장에서 추가 실험에서 배아 줄기 세포인핸서 트랜스 제닉 마우스 라인 (19)은 유동 세포 계측법에 의해 능성 유전자의 발현을 분석하기 위해 사용되었다. 긍정적 인 흡수 제어 400 μM의와 파일럿 실험은 현미경으로 명확하게 Cy3에 긍정적 인 라이브 ES 식민지를 산출하고 세포 계측법를 Cy3 양성 세포 (그림 7C)의 약 40 %를 감지 흐름. 대조적으로, 처리되지 않은 세포와 비교하여 양성 염색 스크램블 처리 된 세포의 약 0.1 % (데이터는 미도시). 마찬가지로 GAPDH, Nanog를 Gdf3 및 특정 나노 입자의 첨가는 세포 배양 접시에 각각의 콜로니에서 뚜렷한 형광 신호를 유도. 유동 세포 계측법에 의해 측정 GAPDH Cy3에 대한 양성 세포의 빈도는 둘 다 능성 유전자 (도 7C)을위한 본 필적 하였다. Nanog를 Gdf3하고 또한 다 능성 ES 세포에서 구조적으로 발현되는 것으로 생각 될 때,이 결과는 기대할 수있다. 따라서, 이러한 데이터 명확하게 INDI특정 유전자를 발현하는 세포는 흐름 세포 측정에 의해 식별 될 수 있다는 케이트 질적 및 상대적인 양에 의해 분석한다.

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그림 1 : 나노 입자의 구조의 개략도. 유전자 특이 나노 입자 (A)의 구조. (B) 스크램블 나노 입자 (음성 대조군). (C) 통풍 나노 입자 (양성 대조군). 와일리의 허가 재판, 람 등. 17에서 적응.

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그림 2 : 나노 입자의 응용 프로그램은 문화에서 셀 나노 입자를 적절히 희석 용액은 단순히 문화 매체에 분주합니다.. O 후 / N 보육 유전자 특이 형광 세포는 AF에서 볼 수 있습니다 luorescent 현미경.

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그림 3 :. 엔도 시토 시스를 통해 세포에 의해 나노 입자의 활성 통풍 관 (A) 세포는 적극적으로 엔도 시토 시스에 의해 나노 입자를 삼켜 (B) 목표 mRNA를 캡처 가닥에 결합하여 형광 기자를 변위..

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그림 4 : 유동 세포 계측법을위한 게이팅 전략. (A) 전략 쥐의 ES 세포에 대한 HEK 293 세포. (B) 전략. 데이터는 뮤린 ES 세포 HEK 293 세포 또는 장치 (2)를위한 장치 (1)를 이용하여 취득하고, 계속해서 소프트웨어 툴 (자재 표 참조)로 분석 하였다.

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그림 5 :. HEK 293 세포에서 GAPDH의 -expression 분석 GAPDH 특이 나노 입자 (100)시 (최종 농도)에있는 세포에 첨가하고 형광 O / N 배양 한 후 기록 된 (A) GAPDH 특이 나노 입자 (B.. ) 스크램블 (음성 대조군). (C) 통풍 관 (양성 대조군). (D) 스크램블 및 흡수 제어의 속도론. GAPDH 특이 형광 나노 입자를 첨가 한 후 지시 된 시간 점에서 측정 하였다. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다.

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그림 6 :. 다른 종의 400 오후 세포에 추가 된 NANOG 또는 GDF3을위한 나노 입자 특정 만능 줄기 세포의 다 능성 유전자 발현 분석 (최종 concentration) 및 형광 O / N 배양 한 후 기록 하였다. (A) 쥐 유도 만능 줄기 세포를. (B) 인간 유도 만능 줄기 세포를. (C) 돼지 만능 줄기 세포. (A)와 (C)에서 화살표 표지 된 섬유 아세포의 피더 층 세포를 나타낸다. 뮤린 만능 줄기 세포 (D) 형광 NANOG 설계 SF3 나노 입자를 첨가 한 후. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다.

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그림 7 : 나노 입자 레이블 라이브 세포 유동 세포 계측법에 의해 식별 할 수 있습니다. 유동 세포 계측법에 의해 결정 Cy3에 양성 세포 (A) 293 세포 나노 입자의 상이한 농도의 첨가 후 Cy3에 긍정적 HEK 현미경보기. (B) 주파수를 설정한다. (C) 뮤린 ES 세포 콜로니의 라이브 염색 Cy3에 포지티브 주파수의 결정 세포. 나노 입자를 첨가400 μM의 최종 농도. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다.

토론

본 작업은 직접 형광 현미경 하에서 다양한 histogenetic 원점과 다른 포유 동물 종으로부터의 생균의 세포 내 유전자 발현의 신뢰성을 평가할 수 형광 표지 된 나노 입자의 용도를 설명한다. 이 방법은 다른 게시 된 방법에 비해 몇 가지 장점이있다. 모든 연구원의 제는 표적 유전자 또는 세포 유형 중 하나에 대해 제한되지 않는다. 모든 항체 기초 검출 방법은 단일 에피토프에 한정되어있다. 형광 분자 표지는 또한 유전자의 광범위한 스펙트럼을 위해 설계 될 수 있지만,이 방법은 셀 및 후속 nucleofection (15)의 분리를 필요로한다. 대조적으로, 유전자 특이 나노 입자의 응용은 능동적으로 세포 내 이입에 의해 나노 입자를 삼키기 타겟 셀의 어떤 조작을 필요로하지 않는다. 후속 계대 동안 금 입자가 서서히 세포를 남겨 downstrea 배양에 사용될 수있다M 실험.

그럼에도 불구하고, 기술은 여전히​​ 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 일부 마커 인해 이러한 SSEA-1 또는 TRA-1-81 (20) 그들의 탄수화물 자연에 분명히 감지 할 수 없습니다. 현재, 나노 입자의 큰 배열은 상업적으로 사용할 수 있습니다. 이 입자는 세포 실험에서 그 기능에 대한 사전 테스트되었습니다. 본 연구의 목적은 종의 경계에 걸쳐 사용할 수있는 사용자 정의 프로브를 설계하는 것이 었습니다. 신규 표적 유전자 하나 프로브를 설계 할 때와 같은 방식에 따라 또는 경우에 실리의 기능을 프로브가 시험 관내에서 충분히 평가 될 필요가 있다고 예측 알아야한다. NANOG-SF1 한 쥐에서 일치하지 않는베이스와 돼지의 순서로 좋은 형광 신호를 생성하는 동안 서열 상 동성에 100 %의 상 동성을 보였다 NANOG-SF3 프로브는 전혀 작동하지 않았다. 또 다른 질문은 나노 입자의 효율적인 흡수를 의미한다. 입자는 입력엔도 시토 시스, 나노 입자 (21)의 크기에 의해 영향을 프로세스에 의해 세포, 세포 형 및 분화 상태 (22) 및 셀룰러 phago- 기능을 수행하고 23 macropinocytosis한다. 만족하는 형광 신호를 얻을 수 있도록 최적의 농도는 각각의 개별 애플리케이션 또는 세포주에 대해 시험 할 수있다. 이를 위해 첫 번째 실험은 항상 대상별하는 유전자 발현의 검출을 이동하기 전에 세포 종류와 배양 조건 내의 프로브의 적합성을 평가하기 흡수 제어 애플리케이션이 될 것이다.

신규 한 세포주에이 프로토콜을 적용하거나 세포 집단이 적당한 컨트롤 포함 때 중요한 포인트가 신뢰할 수있는 결과를 얻었다. 이제까지의 형광을 흡수 제어는 나노 입자의 농도가 표적 세포 집단에서 충분한 형광 신호를 유도 할 것이다 힌트를 제공 할 것이다. 형광 평가해야D 신호로 다음날 시간 17 사라질 것이다. 동시에 동일한 농도로 적용 진핵 게놈 대응없이 스크램블 제어 무시할 배경 신호를 유도한다. 제 3 제어로는 하우스 키핑 유전자의 특정 나노 입자 (예를 들어, GAPDH, β-액틴)를 사용하는 것이 좋습니다. 이들 나노 입자는 접근이 선택된 대상 세포 집단에서 특정 유전자의 발현을 검출하는데 사용될 수 양성 대조군으로 작용한다. 이러한 컨트롤이 판명되면 만족 한 다른 표적 유전자에 대한 특정 나노 입자를 사용하여 신뢰할 수있는 특정 형광 신호를 얻을 것으로 예상 할 수있다. 이들이 표적 서열 24를 하향 조절하는 것으로 나타났다로서 적용하는 나노 입자의 농도는 중요 할 수있다. 그러나,이 효과는 여기 (400 PM) 제시된 실험에 사용 된 농도보다 훨씬 높은 농도 (nM 내지 5)를 필요로한다. 이 농도 nanofla에​​서입술은 표적 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준 및 HEK293 및 뮤린 ES 세포 (17)의 증식을 저해하지 않는가 2nm만큼 높은 농도에 영향을 미치지 않는다. 또한, 전체 게놈 발현 분석, 유전자 발현의 25 현저한 변화를 보여주지 않았다. 따라서, 1 nm의 최대 농도에서 nanoflares은 중요한 부작용을 나타내지한다.

이 기술의 매우 유망한 응용 프로그램은 특정 유전자에 의해 표시되는 특정 세포 인구 레이블을 할 수있는 가능성이다. 최근, 유전자 특이 나노 입자가 성공적으로 선택적 라이브 심실 근세포 26 흑색 종 세포 (27)의 소집단 얼룩이 사용되고, 28 및 소뇌 세포 배양 29 단핵구. 이러한 형광 표시 세포 집단을 분류하고 생균 유동 세포 계측법에 의해 정제 할 수있다. 종양학 분야에서는 동물 모델에서 살아있는 전이성 종양 세포를 분리 상상할CEA의 발현, 유전자 또는 대상 구조를 촉진 가능성 전이의 검색을위한 가장 중요한 기준으로합니다. 최근 우리는 진정으로 재 프로그램 뮤린 만능 콜로니 검출 형광 강도 (17)에 기초하여 특이 Nanog를 반응계에서 나노 입자로 식별 될 수 있음을 보여 주었다. 따라서, 진정으로 재 프로그래밍 만능 줄기 식민지의 식별은 가장 유망한 식민지를 식별하기 위해 로봇 형광 검출 따기 장치를 사용하는 높은 처리량 플랫폼에서 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 특정 세포의 소집단을 선택하기 위해 많은 연구 분야에 적합한 것으로 나타나고는 높은 처리량 플랫폼에 나노 입자를 적용하는 것이 가능 보인다. 결론적으로,이 프로토콜은 생균 직접 세포 내 유전자 발현의 검출을 허용 형광 표지 된 나노 입자를 사용하는 신규 한 방법을 나타낸다. 이 기술은, 정화 확장하는 유용한 도구와 다른 특징이 될 수있다많은 연구 분야에서 드문 세포 개체군을이지는.

공개 사항

HL 무료 머크 밀리 포아의 나노 입자를 받았다. 다른 모든 저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

유세포 분석을 수행하는 데 탁월한 지원을 해주신 Lynette Henkel에게 감사드립니다. 원고를 비판적으로 읽고 도움이 되는 의견을 제시해 주신 Don Weldon 박사와 Victor Koong 박사(캘리포니아주 테메큘라)에게 감사드립니다. 이 연구는 독일 연구 재단의 보조금, KR-3770-7/1 및 KR-3770-9/1 (M. K.), Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Deutsche Stiftung für Herzforschung 및 Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie (M.-A. D.)의 보조금으로 지원되었습니다. 및 Deutsches Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A 및 DZHK B 14-013SE (M. K.).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
안정적인 글루타민을 함유한 DMEM/Ham의 F12 배지Biochrome GmbHFG4815
태아 송아지 혈청Life TechnologiesSV30160.03
페니실린/스트렙토마이신(100개)MilliporeA2213
피루브산나트륨(100개)Life Technologies11360-039
안정적인 글루타민을 함유한 DMEM 고포도당 Biochrome GmbHFG0435
Mitomycin CRoche10 107 409 001MEF의 세포 분열을 방지합니다
MEM 비필수 아미노산 (100x)Life Technologies11140-050
b-MercaptoethanolSigmaM3148
백혈병 억제 인자 (107 U/ml)MilliporeESG1107성장 인자, 분화 방지
0.25% 트립신/EDTA (1x)Life Technologies25200-056부착성 세포 배양을 분리합니다
녹아웃 혈청Invitrogen10828-028인간 및 돼지 iPS 세포 배양을 위한
보충제 bFGFPeprotech100-18B인간 및 돼지 iPS 세포를 위한 성장 인자
콜라겐분해효소 IVWorthingtonLS004188돼지 iPS 세포의 해리
EDTA 0.5 MInvitrogen15575-038
에서 인간 iPS 세포의 피더 없는 배양을 위한 배지
정의됨, 기저 준비막이라고 하는 인간 iPS 세포의 피더 없는 배양을 위한 효과적인 표면
EMD Millipore Corporation원고에서 나노 입자라고 하는 살아있는 세포에서 세포 내 유전자 발현의 항목 검출맞춤화
형광 현미경ZeissAxiovert 200M
HeraCell 150i CO2 인큐베이터Thermo Scientific51026282
젤라틴(돼지 껍질에서 추출)SigmaG6144MEF의 부착을 향상시킵니다. 표면 표면에
: Propidium iodide (1 mg/ml)SigmaP4864유세포 분석에서 죽은 세포 BD
FACS, Aria IlluBecton, DickinsonA4544그림 4의 장치 1
NaviosBeckman Coulter775213그림 4의 장치 2
FloJo vX 10.0.7r2유세포 분석 데이터 분석을 위한Treestar
은 쥐 ES 및 iPS 세포의 은 Matrigel Corning 354277 Matrigel Corning Matrigel SmartFlare Probes로 은 을 했습니다는 , , , (), , , 소프트웨어

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