여기에서는 신경 줄기세포에 대한 세포 자율 및 비자율적, 틈새 의존적 효과를 별도로 분석할 수 있는 성인 심실-심실하 신경인성 틈새에서 신경 줄기 세포 및/또는 인접한 뇌실막 세포의 장기 유전자 변형을 위한 렌티바이러스 입자의 사용을 기반으로 하는 절차를 설명합니다.
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방법 논문
신경의 분석을위한 성인 마우스 V-SVZ에서 세포의 안정적이고 효율적인 유전자 변형 줄기 세포 자율 및 비 자치 효과
이 논문에서
요약
초록
상대적으로 대기 체세포 줄기 세포는 대부분의 성인 조직에서 평생 세포 재생을 지원합니다. 성인 포유류 뇌의 신경 줄기 세포는 두 가지 특정 신경 인성 틈새로 제한됩니다 해마의 치아 이랑과 심실-뇌실 영역의 subgranular 영역, 측면의 벽 (V-SVZ는 subependymal 영역 또는 SEZ라고도 함) 심실. 장기 줄기 세포에서 원하는 유전자의 발현 및 유래 자손 결과 성체 줄기 세포 집단에 대한 생체 내 유전자 전달 전략의 개발 (즉, 포유 동물의 뇌들)은 현재 생물 의학 및 생명 공학 연구에서 중요한 도구이다. 여기서, 직접 생체 내 방법은 정맥 주사에 의한 세포주기 독립적 감염 V-SVZ 틈새 고도로 전문화 cytoarchitecture 활용 성인 마우스 V-SVZ 세포의 안정한 유전 적 변형을 위해 제공된다. 구체적으로는, 현재 프로토콜을 포함V-SVZ 자체 하나에 특정 유전자의 발현 카세트를 인코딩 빈 정맥 주사 (제어) 또는 정맥 주사의 주입은 뇌실막의 타겟팅, 생체 내 틈새에있는 세포의 모든 유형의 타겟팅, 또는 측면 뇌실 루멘으로,이야 세포 만. 발현 카세트는 허용, 또한 정맥 주사에 의해 코딩되는 형질 세포 및 형광 단백질의 게놈 내로 통합되는 표지화 된 세포 및 세포 자율 및 비 - 자율 틈새 의존적 효과 분석 형질 세포의 검출 그들의 자손.
서론
뮤린 심실-뇌실 영역 (V-SVZ)는 선조체 대향 뇌실의 벽에서 매우 활성 종자 영역 인 후각 망울의 지속적인 생산 전구 세포 복제 및 분화 결과 연속 처리 (OB )의 interneurons 및 뇌량의 희소 돌기 아교 세포 (1). , 성상 세포 항원 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)을 표현하고 같은 네 스틴, Id1을 같은 세포 마커 줄기, 이러한 세포의 평생 세대는 신경 줄기 세포 (또한 B1 세포라고 NSCs을)이 지역의 존재에 의해 지원 될 것으로 보인다 및 Sox2이 2. B1 세포가 교통 전구를 증폭 전사가 Dlx2 요인 표현 (TAP) 세포 (C 세포) 생성 GFAP 발현 (말초없는 호 메오 박스 2) Ascl1 (포유류 achaete-schute 동족체 1) 그들이 야기하기 전에 신속하게 몇 번 분할 마이그레이션 neuroblasts (세포) 또는 oligodendroblasts 3. prolif 새로 생성하는 다각적 neuroblasts는 세분화 및 차별화 된 억제의 interneurons으로 사구체 층에 통합 OB에 주동이의 철새 스트림 (RMS)을 형성, 전방으로 이동한다. 이주 젊은 oligodendroblasts는 로컬 분할 또는 성숙 myelinating의 희소 돌기 아교 세포 1,4로
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프로토콜
윤리 선언문 :이 프로토콜은 유럽 지침 63분의 2,010 / EU 준수 발렌시아 대학의 동물 관리 지침을 따른다.
연구를 표시 생체에 대한 LV의 1 세대 (그림 1a 참조)
주의 : 여기에 설명 된 절차에 따라서 생물 학적 후드에서 다음의 모든 절차를 수행, 바이오 안전성 레벨 2입니다. 이 연구 담당자가 적절하게 자격을 갖춘 모든 절차 훈련 있는지 확인. 가운, 이중 장갑과 적절한 눈 보호를 포함한 개인 보호 장비를 착용 할 것. 마지막으로, 철저하게 (70 % 에탄올, 10 % 표백제 및 / 또는 고압 증기 멸균으로 닦아) 승인 된 시설의 소독 방법에 따라 바이러스에 접촉되었을 수있는 모든 도구와 표면 오염을 제거.
- 인간 배아 신장 293T 세포에 LV의 생산
- 형질 전환을위한 순수한 DNA를 준비하여이 프로토콜을 시작합니다. 준비 및 이중 협동 학습 대학원 각 플라스미드를 정제ient 원심 분리 또는 독소없는 DNA를 산출 다른 상업적으로 이용 가능한 열 방법. 이 프로토콜에서 우리는 전송 벡터 플라스미드 pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre을 사용했다. 추천 코어 포장 플라스미드 pMDLg / pRRE을하고 pRSV.REV하고 플라스미드 pMD2G
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결과
LV - 매개 유전자 전달 시스템은 증식, 이동 및 분화 중에 그들의 추적 및 유전 적 변형을 허용 성인 마우스 V-SVZ 세포의 생체 내 전달에 장기간 사용할 수있다. 감염과 표현은 매우 효과적이며, 기자가 포함의 식으로 다른 감염되지 않은 세포들 사이를 쉽게 구별 할 수있는 다수의 세포를 얻을. 우리는 지금까지 보편적으로 발현 포스 포 키나제 프로모터에 의해 구동 GFP 형광 리포터 형질 세포를 시각화했지만, 다른 리포터 나 표지 단백질이 또한 사용될 수있다. 우리는 일상적으로 대신이 강한 형광 신호를 산출으로 기자 방출의 직접 검출에 의존 GFP에 대한 항체를 사용합니다. 또한, 뇌 신선한 해부 및 정착에 몰두하지만, 훨씬 더 나은 결과를 transcardial 관류에 의해 얻어진다 될 수있다.
정제, 농축 벡터 주식은 내가 천천히입니다줄무늬와 한계에 V-SVZ에 정위지도하에 njected (도 2a, b)에 나타낸다. 두 .......
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토론
정맥 주사는 성인의 유전자 변형 NSCs의 16, 18에 대한 다른 바이러스 시스템에 비해 중요한 장점을 제공합니다. V-SVZ 틈새 시장에 렌티 바이러스의 정위 배달 레이블 만 세포를 대상으로 여러 세포 분열, 또는 레트로 바이러스 후 희석 등의 BrdU의 같은 다른 일반적으로 사용되는 방법의 한계를 극복 B1-NSCs을 나누어 자주 추적하는 효율적인 방법을 나타냅니다 즉, 응용 프로그램의 순간에 확산된다. 정맥 주사는 함께 아데노 바이러스와 독립적으로 순환 상태의 세포를 감염시킬 수 이것은 성인 NSCs의 16, 18과 같이, 같은 뇌실막 세포로하지주기를 수행하거나 상대적으로 정지하고, 따라서 거의 분열하지 세포에 특히 적합하다. 유전자가 안정적으로 통합 고효율 형질 도입 된 세포 및 그 자손의 형태 학적 특성을 표현할 수있게된다.
NSCs의는 이웃 세포와 고도로 전문화 된 틈새에 숨겨된다등의 뇌실막 또는 혈관 세포뿐만 아니라 자신의.......
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공개 사항
모든 조작은 바이오 안전성 수준이 방에서 이루어졌다. 동물 프로토콜은 발렌시아 대학의 윤리위원회의 승인과 유럽 지침 63분의 2,010 / EU 준수 모든 있었다되었다.
감사의 글
우리는 MJ 팔롭의 도움말 및 대학교 드 발렌시아의 SCSIE의 기술 지원을 인정합니다. 우리는 또한 도움이 의견과 원고의 논의 안토니아 Follenzi 감사합니다. 그 산탄데르 대학교 글로벌 사업부를 통해 방코 산탄데르에 의해 재단이 보틴,에 의해 Generalitat 발렌시아 (Programa PROMETEO, ACOMP 및 ISIC)과 Ministerio 드 Economìa y를 Competitividad에서 보조금을 지원하는 경우 (MINECO : SAF2011-23331, CIBERNED 및 RETIC 수컷 매) . 이 작품은 또한 (260511- MINECO과 유럽 연구위원회 (ERC) 2012-STG에서 BFU2010-21823 및 RETIC 수컷 매 보조금 지원 PD-HUMMODEL AC BM-P)이다. MINECO의 스페인 FPI의 교제를받는 사람이다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Part 1: Generation of LV for in vivo delivery. | |||
| Equipment: | |||
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XL-100K | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW-28 | |
| Ultracentrifuge 로터 | Beckman Coulter | SW-55 | |
| 초원심분리기 튜브 | Beckman Coulter | 358126 | 25 mm x 89 mm |
| 초원심분리기 튜브 | Beckman Coulter | 326819 | 13 mm x 51 mm |
| 초원심분리기 어댑터 | Beckman Coulter | 358156 | |
| 6웰 플레이트 | SPL | PLC-30006 | |
| 24웰 플레이트 | SPL | PLC-30024 | |
| 10 cm 접시 | SPL | PLC-20101 | 100 x 20 스타일 |
| FACS 튜브 | Afora | DE400800 | 12 mm x 75 mm, 5 ml |
| 컵 멸균 FACS 필터 | BD | 340626 | 30 µ m |
| 니트로 셀룰로오스 필터 | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μ 엠 |
| 플로우 사이토미터 | BD | LSR Fortessa | 블루 레이저 488 nm |
| Steritop 필터 | Biofil | FPE-204-500 | 0.22 & 마이크로; m |
| 시약: | |||
| pMDLg/pRRE 플라스미드 | Addgene | #12251 | 코어 패키징 플라스미드 |
| pRSV.REV 플라스미드 | Addgene | #12253 | 코어 패키징 플라스미드 |
| pMD2G 플라스미드 | Addgene | #12259 | 봉투 플라스미드 |
| pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre 플라스미드 | Addgene | #12252 | 전달 벡터 플라스미드 |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowest | L0101-500 | HeLa 세포 배양용 |
| Iscove의 변형된 Dulbecco's Medium | Life technologies | 12440-053 | 293T 세포 배양을 위한 |
| Tris-EDTA (TE) | Tris-HCl (시그마, T5941), 0.1 mM EDTA (시그마, E5134), pH 7.6, DNAse/RNAse-free, 0.2 &마이크로; m, 멸균 여과 | ||
| 2x HBS | 0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM 무수 Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (바람직하게는 MilliQ가 아님). NaOH 용액(Calbiochem, 567530)으로 pH를 7.0으로 조정합니다. | ||
| 소 태아 혈청 (FBS) | Biowest | S181B-500 | 100x 원액, 10x 최종 농도에서 HeLa 및 293T 배양 배지를 준비하는 데 사용됩니다. |
| 글루타민 | 시그마-알드리치 | G7513-100 | 원액은 6mM의 최종 농도에서 HeLa 및 293T 배양 배지를 준비하는 데 사용됩니다. |
| 나트륨 피루브산 | Life technologies | 11360-039 | 100mM의 원액, 1mM의 최종 농도에서 HeLa 및 293T 배양 배지를 준비하는 데 사용됩니다. |
| GlutaMAX Supplement | Life technologies | 35050-061 | 최종 농도 1%에서 293T 배양 배지를 준비하는 데 사용됩니다. |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 시그마-알드리치 | P4458 | 원액에는 페니실린 5,000단위/ml와 스트렙토마이신 5mg/ml가 함유되어 있습니다. HeLa 및 293T 배양 배지를 최종 농도 1%로 준비하는 데 사용됩니다. |
| 트립신-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | 페놀 레드는 2.5g의 돼지 트립신과 0.2g의 EDTA 4Na/L HBSS를 함유 |
| 인산염 완충 식염수 (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | 염화칼슘 및 염화마그네슘 미포함, 10x, 액체, 멸균 여과, 세포 배양에 적합. 세포 배양 등급의 물에서 1x PBS를 준비하는 데 사용되는 원액. |
| 폴리브레네(헥사디메트린 브로마이드) | 시그마-알드리치 | H9268 | 파우더. dHO |
| 파라포름알데히드 EM 등급 16% | EM Sciences | 15710 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Part 2: 특별 경제 구역 또는 외측 심실에 LV의 스테로택시 주입.< | |||
| strong>Equipment: | |||
| Vernier stereotaxic instrument | NeuroLab, Leica | 39463001 | http://www.leicabiosystems.com/ |
| Cunningham mouse and neonatal rat adaptor | NeuroLab, Leica | 39462950 | |
| 주사기 홀더 | KD Scientific | KDS-311-CE | |
| 33 게이지 주사기 | Hamilton | P/N 84851/00 | #85RN |
| 전기 드릴 | 파인 사이언스 툴 | 98096 | |
| 열 담요 | Ufesa | AL5512/01 | 230-240 V, 100-110 W, C_AL01 |
| 면도기 | 자타 | MP373N | 모델: 뷰티, 3V, 300mA, HT-03형. |
| 시약: | |||
| Medetomidine | Esteve | DOMTOR | 1 mg/ml의 Comercial solution. |
| 케타민 | Merial | Imalgene 500 | 50 mg/ml에 Comercial 해결책 |
| 메데토미디나/케타민 혼합물 | 0.2mg/ml 희석의 최종 농도에서 메데토미딘과 식염수 용액에서 15mg/ml의 최종 농도로 케타민의 작업 혼합물을 준비합니다. 마취제로 사용, 체중 kg 당 0.5-1 mg 메데토미디나와 체중 kg 당 50-75 mg 케타민의 최종 농도를 얻기 위해 볼륨을 주사 | ||
| Butorphanol | Pfizer | Torbugesic | 재고 용액. 식염수에서 1 mg / ml의 진통제로 사용됩니다. |
| Atipamezole | Esteve | Antisedan | 5 mg/ml의 재고 용액, 마취에서 벗어나기 위해 식염수에 0.5 mg/ml의 최종 농도로 사용됩니다. |
| 0.9% 식염수 Braun | 13465412 | ||
| Histoacryl | Braun | 1050052 | 피부 접착제 |
| 하이드로겔 | 클리어 H2O | 70-01-5022 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | 11 cm x 21 cm |
| Bleach/Virkon | Dupont | ||
| Surgical marker pen | Staedler | 313-9 | 퍼머넌트 루모컬러 |
| 안과 윤활제 | SICCAFLUID | 0.5g/dosis, 카보머 974P | |
| 포비돈-요오드 | 베타딘 | 694109.6 | 10% 포비돈-요오 |
| Name | Company> | >카탈로그 번호 | Comments |
| Part 3: Histological analysis. | |||
| 장비: | |||
| 자동 연동 펌프 | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07524-55 | Masterflex L/S 가변 속도 이코노미 드라이브, 1.6-100rpm, 230V |
| 펌프 헤드 | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-07518-00 | 정밀 튜빙용 Masterflex L/S Easy-Load 펌프 헤드; PSF 하우징, CRS 로터 |
| 실리콘 튜브 | Cole-Parmer Inst. Co. | HV-96410-16 | 플래티넘 L/S 16 |
| 두피 정맥 세트 | Vygon V-green | 70246.05T | 25 G, 30cm 튜브 길이 |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| 컨포칼 현미경 | Olympus | FluoView FV10i | |
| 핫 플레이트 | Tehtnica | SHP-10 | |
| 시약: | |||
| 인산염 완충액 (PB) | 0.2 M PB : 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) 및 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, pH를 7.2-7.4로 조정 | ||
| 파라포름알데히드(PFA) | Panreac | 141451.1211 | 매번 신선하게 준비합니다. dH2O를 최대 55&ndash까지 가열; 60 > C: 흄 후드에 놓인 핫 플레이트를 사용하여 PFA 분말을 붓고 저으면서 8% 용액을 얻습니다. 용액은 PFA가 쉽게 용해되지 않기 때문에 탁한 흰색입니다. 용액이 제거될 때까지 1N NaOH를 한 방울씩 첨가합니다. 식히고 Whatman 종이를 걸러내고 0.2M PB의 등가 부피를 추가합니다. |
| dH2O | |||
| 초강력 접착제 | LOCTITE | 의 | |
| 아지드화나트륨 | Panreac | 122712.1608 | |
| 글리신 | 시그마-알드리치 | G7126-100 | |
| 일반 염소 혈청 | Millipore | S30-100 | |
| 트리톤 X-100 | 시그마-알드리치 | T9284 | 세정제 |
| Anti-GFP rabbit 항체 | ROCKLAND | 600-401-215 | 1:500 희석에서 사용 |
| Alexa Fluor 488 당나귀 Anti-Rabbit IgG (H+L) 항체 | 분자 프로브 | A-21206 | 1:750 희석에서 사용 |
| 6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | 형광 핵 염색. ddH2O에서 2mg/ml로 사용합니다. 4°C에서 어두운 곳에 보관하십시오. |
| Fluoromount-G | EM Sciences | 17984-25 | 형광 제제용 마운팅 매체 |
참고문헌
- Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Adult neural stem cells bridge their niche. Cell Stem Cell. 10 (6), 698-708 (2012).
- Silva-Vargas, V., Crouch, E. E., Doetsch, F. Adult neural stem cells and their niche: a dynamic duo during homeostasis, regene....
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