방법 논문

교 모세포종에 대한 면역 적격 동물 모델의 생물 발광 영상

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DOI:

10.3791/53287

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2016년 1월 15일

 ,  ,  , 
1Department of Neurological Surgery, University of California San Francisco, 2Department of Neurological Surgery, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 3Biochemistry and Molecular Genetics, Northwestern University Feinberg School of Medicine

이 논문에서

요약

GL261 신경교종 세포는 교모세포종의 유용한 면역 역량 동물 모델을 제공합니다. 이 프로토콜의 목표는 생체 내 생물 발광 이미징을 사용하여 두개내 종양 성장을 모니터링하기 위한 적절한 기술을 시연하고, 종양 면역학 연구를 위한 루시페라제 변형 GL261 세포의 유용성 및 교모세포종 치료를 위한 면역 요법 접근법을 검증하는 것입니다.

초록

일반적으로 보고되는 인간 신경교종 이종이식 동물 모델과는 대조적으로, GL261 쥐 신경교종 이종이식은 인간 질병의 거의 모든 관련 임상 및 조직학적 특징을 요약합니다. GL261 세포를 syngeneic C57BL/6 마우스에 두개내로 이식하면 이 모델은 온전한 면역 미세환경을 유지하는 추가적인 이점이 있습니다. GL261 세포에서 루시퍼라아제의 안정적인 발현은 두개내 종양 성장에 대한 비침습적이고 비용 효율적인 생물 발광 모니터링을 가능하게 합니다. GL261 세포에서 루시페라아제 발현이 종양 성장 특성, 종양 세포 면역조절 사이토카인 발현, 면역 세포의 종양 내 침투 또는 두개내 종양을 보유한 동물의 전체 생존에 영향을 미치지 않는다는 것을 최근에 입증했습니다. 따라서 GL261 루시페라제 신경교종 모델은 새로운 화학요법 및 면역요법 양식 연구에 유용할 수 있는 것으로 보입니다. 여기에서는 GL261 세포에서 안정적인 루시페라제 발현을 생성하는 기술과 생물 발광 이미징을 통해 종양 세포의 체외 및 생체 내 성장을 연구하는 방법을 보고합니다.

서론

악성 신경교종은 가장 흔하고 가장 치명적인 인간 뇌종양입니다. 최대 외과적 절제술, 방사선 요법 및 화학요법으로 치료하더라도 주요 뇌종양 의뢰 센터1, 2, 3에서 평균 생존율은 15-20개월로 유지된다. 악성 신경교종의 가장 공격적인 형태인 교모세포종은 유사분열, 신생혈관화, 인접 뇌로의 침입, 가성팔리사딩 괴사를 특징으로 합니다. 인간 뇌종양 세포를 사용하는 정형소 뇌종양 이종이식편은 신경 종양학 연구에서 필수적인 기능을 수행해 왔으며 인간 임상 시험에 들어가기 전에 새로운 제제 테스트를 위한 전임상 번역을 용이하게 했습니다. 대부분의 인간 이종이식 모델은 인간 질병의 많은 특징을 요약하지만, 모든 인간 기반 이종이식 모델 시스템의 근본적인 한계는 면역 결핍 동물을 사용한다는 것입니다4.

온전한 숙주 반응이 없다는 것은 종양 형태와 생착의 효율성 측면에서 종양 성장을 분명히 수정한다는 것입니다. 이종이식 모델의 결과를 해석할 때 특정 가정이 허용되지만, 치료 평가 영역에서 관련 결론을 달성하는 것은 어려운 일입니다. 특정 근본적인 생물학적 특징은 면역 결핍 동물과 면역 능력이 있는 동물에서 유사할 가능성이 높지만, 종양 관련 염증, 조직 침습, 부상에 대한 반응과 같은 다른 특징은 아마도 매우 다를 수 있습니다. 이와는 대조적으로, GL261은 화학적으로 유도된 쥐 신경교종 세포주로, 면역능력이 있는 합성유전자 C57BL/6 마우스의 뇌에 이식되었을 때 신경교종을 정확하게 재현합니다5. 인간의 질병과 유사하게, 두개내 종양은 빠르고 재현 가능하게 성장하여 신경학적 증상과 동물의 폐사를 유발합니다6-10.

피하 종양 성장을 직접 측정할 수 있습니다. 두개내 종양 성장은 동물 희생 또는 비용이 많이 드는 영상 검사를 통해서만 측정할 수 있습니다. 효소 루시퍼라아제(Luciferase)의 안정적인 발현은 비침습적이고 비용 효율적인 두개내 생물발광 이미징을 가능하게 합니다11. 루시페라제 형질주입된 GL261 세포의 생물 발광은 두개내 종양 성장과 밀접한 관련이 있습니다. 최근 GL261과 루시페라제 변형 GL261 세포를 직접 비교한 결과, 체외 성장 및 침입, 면역학적 사이토카인 프로파일, C57BL/6 마우스가 함유된 두개내 종양의 생체 내 생존 또는 면역 세포 침투에 차이가 없음을 입증했습니다. 이 기술은 종양 성장의 비침습적 모니터링을 포함하는 교모세포종 전임상 연구에 적용할 수 있습니다.

프로토콜

아래에 설명 된 모든 절차를 검토하고 노스 웨스턴 대학 기관 동물 사용 및 관리위원회의 승인을 멸균 조건 하에서 수행되고있다.

반딧불 루시 페라 제 표현 기자와 GL261 세포의 1. 변경

주 : HIV-1 계 렌티 바이러스 벡터는 비장 초점 형성 바이러스 (SFFV) 프로모터의 제어 하에서 반딧불 루시페라아제 (Fluc)을 표현한다. 광학 리포터 유전자는 벡터 플라스미드 pHRSIN-CSGW - dlNotI에 복제 된.

  1. 95을 함유하는 가습 분위기하에 37 ℃에서 10 % FBS, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신이 보충 된 RPMI 배지에 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 GL261 세포가 보충 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) 293-T 세포를 유지 % 공기와 5 %의 이산화탄소 (CO 2).
  2. 293-T 세포 배양은 T-75 플라스크에서 80 % 컨 플루 언시에 도달 할 때, pH가 번 세포를 씻어osphate 완충 식염수의 Ca2 +와는 Mg2 +가없는 (PBS)는, 주 형틀이 약간 기울어 진 채 5 ㎖ 피펫으로 5 분, 씹다 37 ℃에서, 트립신 (0.05 %) 3 mL를 가진 세포를 배양하고있는 모든 세포를 수집 플라스크의 바닥에서. 15ml의 원뿔형 튜브에 트립신 세포 현탁액의 3 ㎖를 전송하고, 육체 RPMI 배지 (세포 현탁액 10 ㎖의 전체) (7)를 가하여.
  3. 5 ml의 피펫으로 웰 세포 현탁액을 혼합한다. 관으로부터 세포 현탁액 100 ㎕를 취하여 혈구를 이용한 세포의 수를 계산. 이렇게하려면 트리 판 블루 용액 300 μL와 세포 현탁액 100 μl를 혼합하고 혈구로 혼합물의 2 μL를 삽입합니다. 현미경 네 개의 개별 뷰에서 블루 염색하지 않고 세포의 수를 계산. 이 수가 104 세포 / ㎖를 나타내는 바와 같이, 각각의 뷰에서 세포 수의 평균.
  4. 한편, 30의 세포 현탁액을 포함하는 튜브를 원심7 분 0 XG. 미디어 대기음 1.0 × 106 / ㎖의 밀도로 GL261 세포 현탁액을 만들기 위해 신선한 RPMI 배지로 세포 펠렛을 재현 탁. 27.5 ml의 DMEM (1 일)와 T-175 플라스크에 넣고 RPMI 미디어 2.5 mL를 종자 2.5 × 10 6 GL261 세포.
  5. 24 시간 후, 20 ㎖ 신선한 DMEM (2 일)와 매체를 교체합니다.
  6. 상기 렌티 바이러스 벡터를 생산하고 5 분 동안 2 ml의 무 혈청 DMEM으로 54 μL 형질 감염 시약을 혼합한다. 형질 전환 시약 DMEM에 Fluc (pSIN-Fluc)의 3 개그-POL의 μg의, 수 포성 구내염 바이러스 G 봉투 (VSV-G)의 3 μg의, 4.5 μg의를 추가하고 실온에서 20 분 동안 품어. T-293 플라스크 (T-175)로 전체 DNA 혼합물을 삭제하고 48 시간 (2 일), 95 % 공기 및 5 % CO 2를 함유하는 가습 챔버 내에서 37 ℃에서 배양한다.
  7. (3 일) (약 30 ml를해야 293-T 세포 배양 배지의 총 부피) 형질 전환 후 24 시간 신선한 DMEM 10 ML을 추가합니다.
  8. 로 GL261 세포를 분할하려면24 웰 플레이트, 약간 기울어 진 술병을 들고하여 5 mL를 피펫으로 5 분, 씹다 37 ℃에서 트립신 (0.05 %) 5 ㎖와 세포를 품어의 Ca2 +와는 Mg2 +없는 PBS로 한 번 세포를 씻어 플라스크의 바닥으로부터 모든 세포를 수집하고, 단계 1.2에서와 혈구 세포를 통해 카운트. 한편, 7 분 동안 300 XG에서 튜브를 원심 분리. 미디어 대기음 2.5 × 104 / ㎖의 밀도로 GL261 세포 현탁액을 만들기 위해 신선한 RPMI 배지로 세포 펠렛을 재현 탁. 시드 24 웰 플레이트에 RPMI 매체의 1 ㎖ (3 일) 2.5 × 10 4 GL261 세포.
  9. 48 시간 다음과 같은 형질의 293-T 플라스크 (T-175) 10 mL를 피펫으로 렌티 바이러스 상층 액 30ml를 수집하고 50 ML 원뿔 튜브에 뜨는을 전송합니다. 대기음 30 ml의 렌티 바이러스 0.22 μm의 주사기 필터를 통해 50 ML의 주사기를 통해 상층 액, 1 mL를 분취 (4 일)에 바이러스 뜨는 나누어지는.
  10. (R)의 1 mL로 교체렌티 바이러스 상층 액 1 ㎖과 함께 GL261 세포 판 (24도)에서 PMI 매체는 가습 실 (4 일)에 37 ° C에서 품어.
  11. 렌티 바이러스 감염의 48 시간 후, 신선한 RPMI 1 ㎖ (6 일)와 매체를 교체합니다.
  12. 24 시간 후, GL261 세포 (7 일)의 렌티 바이러스 감염을 반복한다.
  13. 렌티 바이러스 감염의 2 차 48 시간 후, 신선한 RPMI 1 ㎖ (9 일)와 매체를 교체합니다.
  14. (GL261.luc 셀로 언급되는) 변형 된 루시퍼 GL261 세포 성장 및 T-75 플라스크에 세포 배양을 확장하는 것을 계속한다.
  15. GL261.luc 세포 배양은 T-75 플라스크에서 70 % 컨 플루 언시에 도달 할 때, 트립신 처리에 의해 세포를 수확하고, 단계 120에서와 같이 계산에 의해 혈구. 졸업 밀도에서 24- 웰 플레이트 GL261.luc 셀 플레이트 (1.0 × 106 5.0 × 105, 2.5 × 105, 1.0 × 105, 5.0 × 104, 2.5 × 104 세포 / 웰) 및 humidi에서 37 ° C에서 부화3 시간 동안 95 % 공기 및 5 % CO 2를 함유하는 챔버 얘기들이었다.
  16. 셀룰러 루시퍼 라제 활성에 대하여 측정 값을 생물 발광 영상 (도 1)를 이용하여 U-87 MG (U87.luc) 세포 변성 루시페라아제한다.
    1. 이미지 소프트웨어를 시작합니다 (바탕 화면에 아이콘을 클릭) 이미징 시스템을 초기화 (버튼을 클릭 "초기화"). 초기화가 자동으로 시작되고 시스템 검진 및 -90 ℃로 냉각 할 수있는 카메라를 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
    2. 각 웰에 루시페린의 25 μL (D-루시페린 칼륨 염, 150 ㎎ / ㎏)를 추가합니다.
    3. 10 초 동안 판을 실온에서 1 분 동안 루시페린과 이미지로 세포를 품어. 이미징 시스템을 설정하려면, "발광", "10 초"노출 시간, "중간"비닝 (binning)을 선택합니다. 영상 스테이션의 24 웰 플레이트를 놓고 이미지를 시작합니다 "취득"버튼을 클릭합니다.
    4. 이미지를 성공적으로 인수 한 후에는 이미지 창 및 도구 PA가 표시됩니다화면에 lette. "ROI (관심 지역) 도구"를 클릭하고 슬릿 아이콘에서 6 × 4를 선택합니다. 24 웰 플레이트의 이미지 신호의 영역을 커버하고 측정 탭 (연필 아이콘)을 클릭하는 6 × 4 슬릿을 만듭니다. 평방 센티미터 (광자 / 초 / / SR cm 2) 당 스테 라디안 당 초당 광자 단위로 투자 수익 (ROI) 측정의 테이블 창을 준수하십시오.
    5. 사용 U87.luc 셀들은, 이전에 GL261.luc 형질 세포에서 루시퍼 라제 활성을 평가하기위한 대조군으로서, GL261 개질 11 여기 사용 된 것과 같은 렌티 변성.

체외 증식 분석 2.

  1. GL261과 GL261.luc 세포 배양은 T-75 플라스크에서 70 % 컨 플루 언시에 도달 할 때, 트립신 처리하여 세포주 모두를 수확하고, 단계 120에서와 같이 계산하고, 1,500 세포의 밀도로 96- 웰 플레이트에 플레이트 세포 또한 시간과 피펫 오차를 최소화하도록 멀티 채널 피펫을 사용하여 당 RPMI 배지 80 μL. 괜찮다ED (20) 우물의 총에 각 셀 라인. 세포에 의해 채워 우물의 증발을 제한하기 위해, 신선한 RPMI 배지 100 ㎕ 빈 우물을 입력합니다.
  2. 비색 세포 증식 분석법을 이용하여 세포 증식을 평가. 여기에서 우리는 MTS 세포 증식 분석을 사용합니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여, 세포를 포함하는 96- 웰 플레이트의 각 웰에 MTS 시약 20 μL를 추가한다.
  3. 3 시간 동안 95 % 공기 및 5 % CO 2를 함유하는 가습 챔버 내에서 37 ℃에서 플레이트를 배양한다. 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정한다. 이것은 도금 후, 7 일 1, 2, 4에서 반복되고. 흡광도 값을 정규화하기 위해, 매일의 값은 1 일 (도 2)에서 얻어진 대응하는 수치로 나누어진다.

3. 종양 세포 주입

참고 : 모든 장비를 압력솥. 살균제 (2 % 클로르헥시딘 액)을 분무하여 수술 영역을 준비하고 absorben 커버T 커튼. 멸균 상태를 유지 수술시 무균 수술 장갑을 착용하고, 색 테이프로 두 영역으로 수술 영역을 나누기 위해. 지역 1 "클린"이라는 살균 공급을 포함합니다; 지역 2 "더러운"로 표시하고, 재료를 사용 포함되어 있습니다.

  1. 동물 수술에 앞서, 두개 내 주입을위한 세포 현탁액을 준비합니다. 70 %의 합류 T-75 플라스크 트립신에 의해 단계 1.2에서와 같이 혈구를 통해 세포를 계산하고, 2 + 칼슘없이 행크스 '균형 소금 용액에 1.0 × 10 5 세포 / μL의 농도에서 세포 현탁액을 만들어에서 수확 세포 마그네슘 2+ (HBSS).
  2. 0.9 %의 식염수에 자일 라진의 케타민 100 ㎎ / ㎏과 10 ㎎ / ㎏을 포함하는 200 μL 혼합물의 복강 내 주사로 쥐를 마취. 적절한 마취를 확인하려면, 마우스의 발가락을 꼬집어. 마우스가 완전 마취 경우, 마우스는 자극에 반응해서는 안된다.
  3. 0.1 미터를 관리피하 주사를 통해 G / kg의 부 프레 노르 핀은 수술 후 통증을 완화합니다.
  4. 2 % 클로르헥시딘 용액에 침지면 팁 어플리케이터 및 가위를 사용하여 깨끗한 동물의 머리의 상단 면도. 수술 중 적절한 윤활을 유지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
  5. 멸균 메스를 사용하여 두정 - 후두 뼈를 통해 약 1cm 길이 시상 절개를합니다. 브레 그마 시각화, 3 % 과산화수소 용액에 적신 솜 팁 어플리케이터 두개골의 표면을 닦아.
  6. 브레 그마의 오른쪽 바로 뒤에 관상 봉합 3mm 작은 구멍을 만들기 위해 무균 25-G 바늘 두개골을 뚫는다.
  7. 두개 내 주사 부위는 두개골 3 mm의 깊이에 있는지 확인하기 위해 가위를 사용하여 20 μL 피펫 팁의 끝이 뾰족 오프 3mm을 절감하고 피펫 팁에 주사기를 삽입합니다.
  8. 이전에 만든 구멍에 수직으로 주사기를 삽입하고 천천히 종양 세포 SUS를 주입1 분 동안 3 μL HBSS에 3.0 × 105 세포를 함유 연금. 다른 분 동안 자리에 바늘을 그대로두고 천천히 바늘을 빼냅니다.
  9. 3 % 과산화수소에 침지면 팁 어플리케이터 및 2 % 클로르헥시딘 용액 두개골을 면봉. 면 팁 어플리케이터 두개골의 표면을 건조시킵니다. 크기가 3 약 3mm 멸균 뼈 왁스를 잘라면 팁 어플리케이터의 측에 뼈 왁스를 연결합니다. 면 팁 어플리케이터 구멍을 충당하기 위해 뼈 왁스를 적용합니다.
  10. 집게를 사용하여 두개골을 통해 함께 두피의 각면을 그리고 주식은 상처를 닫습니다. 2 % 클로르헥시딘 용액에 담근면 팁과 상처를 청소합니다.
  11. 그들은 보행이 될 때까지 수술 후 모든 쥐를 모니터링하고 정상적인 활동을 유지합니다. 일반적으로, 회복 시간은 약 30 분이다. 그들이 완전히 마취에서 회복 될 때까지 다른 동물 케이지에 마우스를 반환하지 않습니다.

4를. GL261 종양 성장의 생물 발광 영상

  1. 깨끗한 종이 타월에 살균제의 충분한 양 (0.05 % 디메틸 암모늄 클로라이드 용액)을 스프레이. 철저하게 동물 장치와 접촉 할 것 이미징 챔버 내부의 검은 색 시트, 코 콘 및 디바이더를 닦아 살균제에 젖은 종이 타월을 사용합니다. 철저하게 깨끗하고 마른 종이 타월로 모든 표면을 닦으십시오. 이 한 번 더 반복하고 5 분을 기다립니다.
  2. 단계 1.14.1과 촬상 국 초기화.
  3. 복강 주사에 의해 케타민 / 자일 라진 및 200 μL의 100 μL 루시페린 (D-루시페린 칼륨 염 150 ㎎ / ㎏)을 함유 300 μL 혼합물로 마우스를 마취.
  4. 주사 후 10 분을 기다린 후 쥐가 꼬리를 곤란하게하여 마취하에 완전히 있는지 확인합니다. 이미징 시스템을 설정하려면, "발광", "자동"노출 시간, "중간"비닝 (binning)을 선택합니다. 영상 stati에 마우스를 놓고과에하면 이미지를 시작합니다 "취득"버튼을 클릭합니다. 주사 후 시간이 각 이미지 세션과 일관성이 있음을 확인합니다.
  5. 이미지가 성공적으로 획득되면, 화상 창 및 도구 팔레트 나타나야. "투자 수익 (ROI) 도구"를 클릭하고 원 아이콘에서 "자동"을 선택합니다. ROI를 정의하기 위해, 이미지 신호의 영역을 둘러싸하고 SR 광자 / 초 / / ㎠의 단위로 ROI의 측정을 수행.
  6. 영상 실에서 쥐를 가지고 그들이 보행이 될 때까지 마우스를 모니터링하고 정상적인 활동을 유지합니다. 일반적으로 복구 시간은 약 15 분이다. 그들이 완전히 마취에서 회복 될 때까지 다른 동물 케이지에 마우스를 반환하지 않습니다.
  7. 동물은 다음과 같은 현상이 제시 될 때까지 일주일에 두 번 생물 발광 이미징에 의해 종양 성장을 모니터 : 체중 감소 (주입 전의 중량에 20 % 이상의 상대적인 손실) inappetance (24 시간 동안 완전한 거식증), 및 지속적인 purposefu ​​부족그들이 안락사해야하는 시간에 부드러운 자극 (최대 얻을 수있는 약한 시도)에 L 응답. 경추 탈구이어서 CO 2 챔버를 사용하여 이러한 증상이있는 동물을 안락사.
    1. 장소 안락사 챔버에 마우스 (과밀하지 챔버을) 유입은 5-6 분 동안 이산화탄소를 압축. 모든 동물은 무의식과 후 약 5 분 호흡을하지 않는 것을 관찰한다.
    2. 챔버에서 마우스를 가져 가라. 심장이 엄지와 집게 손가락 사이의 가슴을 느낌으로 치고 있지 않은지 확인하고, 깜빡임이 없음을 확인합니다.
    3. 평평한 표면에 발생하기 쉬운 위치에 마우스를 억제하고 엄지와 다른 손의 첫 번째 손가락으로 꼬리의 한 손으로 두개골의 기지에서 목 뒤쪽과 기지를 파악.
    4. 머리를 제지하고 신속하게 뒤로 꼬리를 잡아 당깁니다. 그 두개골은 엄지와 첫 번째 손가락을 사용하여 첫 번째 경추에서 분리되어 있는지 확인합니다.
  8. 표준단계 2.3 (그림 3A)과 생물 발광 영상의 첫 번째 날에 얻은 대응하는 측정 값에 대한 매일 ALIZE 발광 값.
  9. 통계적인 분석을 위해, 카플란 - 마이어 추정 (12)을 이용하여 생존 곡선을 생성하고, 로그 - 랭크 테스트 (13)을 이용하여 생존 곡선 사이의 차이를 비교한다.

결과

GL261 세포는 시험관 내 생물 발광 1. 촬상 인간 아교 모세포종 세포주 U87.luc 양성 대조군의 수준과 유사한 강력한 루시페라아제 발현 (도 1)를 보여주는 단계에서 상술 한 바와 같이 루시페라아제는 렌티 바이러스를 포함하여 감염시켰다. 예상대로, 감염되지 않은 GL261 세포는 어떤 배경 루시 페라 제 표현을 보여 없습니다. 이 단계에서는 아직 종래 안정 루시퍼 라제 발현을 확인 감염된 세포주를 사용하여 추가 연구를 수행하는 것이 중요 간단하다.

두개 내 주입 후 루시 페라 제 표현.

두개 내 주입하기 전에, 우리는 GL261 세포 (그림 2)에 비해 GL261.luc의 체외 성장 속도의 차이를 입증하지 않습니다. 두개 내 성장 및 생존 분석을 위해, 세포에 주입 하였다 BRGL261.luc 종양을 갖는 마우스에서 3 단계 종양 성장 프로토콜에 따라, C57BL / 6 마우스의 AINS 직렬 프로토콜을 사용하여 단계 4 생물 발광 영상을 분석 및 검출 종양 성장 (도 3a)을 입증 하였다. 신속하고 일관 GL261.luc 종양을 갖는 마우스는 죽어가는되었고 안락사시켰다. 중요한 GL261.luc 동물 베어링 GL261 종양 (도 3b) 사이의 전체 생존율에는 차이가 없다. 생체 내 생물 발광 촬상 따라서 실험 아교 모세포종 치료에 반응을 모니터링하는 데 사용될 수있다. 신속한 신뢰성 종양 성장 및 생존율은 짧은 상대적으로 짧은 시간에 많은 양의 데이터를 얻을 수있다.

figure-results-1
GL261.luc 세포도 1 루시페라아제 활성. U87.luc는 GL261.luc 및 GL261 (대조군) 세포의 밀도로 플레이 팅 하였다1.0 × 106, 5.0 × 105, 2.5 × 105, 1.0 × 105, 5.0 × 104, 2.5 × 104 세포 / 웰에서 좌우. 발광 (광자 / 초 / / SR CM 2) 루미나 이미징 역으로 측정 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
도 2 루시 페라 제 발현은 GL261 세포 증식에 영향을주지 않는다. GL261.luc 세포는 발생하지 않는다 증식의 차이는 MTS 세포 증식 분석에 의해 입증 된 바와 같이. 평균 흡광도 값을 비교함으로써 결정되는 그래프는 일 (1)에 대하여 배 증가를 나타낸다 (제 1 일 평균값 thespecified 시점에서 비교를위한 부대 t의 -test 값 (± SEM을 의미)각 셀 라인 사이 : P = 0.7796) (14). 오차 막대는 평균 값이 하루에 사통 샘플에서 (± SEM을 의미)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3. 루시 페라 제 발현은 생체 내 종양 성장과 동물의 생존에 영향을 미치는 것이 아닙니다. (A) 생물 발광 모니터링 C57BL / 6 마우스에서 두개 내 GL261.luc 종양의 진보적 인 성장을 보여줍니다. (B) Kaplan-Meier 생존 분석은 하나 GL261 (실선) 또는 GL261.luc 세포의 두개골 이식 마우스에 대한 전체 생존율의 차이를 보여줍니다 없습니다 (점선).이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

동계 면역 C57BL / 6 마​​우스에 두개골 내에 이식 할 때 GL261 쥐의 신경 교종 세포는 인간의 신경 교종 이종 이식 동물 모델에 비해 몇 가지 장점을 제공합니다. 이종 이식 종양의 대부분은 정확하게 침략 인간의 질병을 요점을 되풀이하지 않는 캡슐화 된 병변으로 성장. 반면, GL261 종양뿐만 아니라 인접한 뇌에 침략을 보여줍니다뿐만 아니라, 혈관 신생, 유사 분열, 그리고 깊은 괴사 7. 가장 중요한 것은 종양 면역학 또는 면역 전략 15, 16, C57BL / 6 마우스가 그대로 면역 시스템 (8)을 유지 공부를 할 때. 이전의 연구는 면역 사이토 카인 TGF-β의 강력한 표현을 보여 주었다 및 두개 내 종양은 인간 아교 모세포종 (9), (10)과 유사한 면역 억제 T-조절 세포가 포함되어 있습니다.

여기에 설명 된 간단한 기술은 GL261 세포에 의해 루시 페라 제의 안정적 발현 할 수 있습니다. 우리는 최근 미 신고되었습니다시험 관내 및 GL261 세포에 비해 GL261.luc 세포의 생체 내 성장 LAR은 유사한 종양 조직 학적 특성 및 면역 세포에 더하여 17 침투. GL261.luc 세포 안정적 따라서 광자 검출 광 화학적 에너지 변환 루시페린 기질의 산화를 촉매하는 루시퍼 라제를 발현. 루시페린 안전하게 동물에게 복강 내 투여 또는 정맥 내 주사 후 혈액 뇌 장벽을 통과 할 수있다. 이러한 생쥐 작은 동물 연구에서, 생물 발광을 비 침습적 방식으로 (11)에 외부 적으로 검출 될 수있다. 따라서, 종양의 성장은 직렬 동물의 희생 또는 비용 MRI 또는​​ CT 촬영에 대한 필요없이 평가 될 수있다.

프로토콜의 중요한 단계는 생체 내 실험을 시작하기 전에 시험 관내에서 렌티 바이러스 형질 도입, 또한 루시퍼 라제를 안정적으로 발현 대조까지도 포함한다. 전달의 손실 requi 수 있습니다반복 렌티 바이러스 감염 재. 발현 벡터에 항생제 내성 유전자의 도입은 또한 루시퍼 라제 발현을 선택하는 데 사용될 수있다. 세심한 기술 재현성 다른 처리 군의 비교를 허용하도록 정확한 해부학 적 위치에있는 세포의 수를 일치 배치 두개 내 주입을 위해 요구된다. 현재 연구 및 루시퍼 라제 발현 GL261 셀의 이전 연구 간의 주요한 차이점은 정위 프레임 (18)의 사용에 비해 세포를 주입하는 프리 핸드 기술의 사용이다. 우리는 이전에 한 손 기술 (19)과 일치 주입 결과를 보여 주었다. 자유로운 손 기술의 장점은 다른 치료제의 높은 처리량 분석을 수행 할 수있는 능력이다. 우리의 손에, 우리는 1 시간에 약 60 동물을 이식 할 수 있습니다.

기술을 습득 한 후, 미래 기술의 응용은 무한하다. GL261의 demonstr로축열 상승 유사 분열 및 인간 아교 모세포종 유사한 빠른 종양 성장은, 항 - 증식 치료제가 평가 될 수있다. GL261 종양이 침습성 및 혈관 신생이다 마찬가지로, 항 침습 및 항 - 혈관 신생 요법이 사용될 수있다. 인간 표적 겨냥 화학 치료제의 효과를 평가하는 경우에는주의가 사용되어야한다. 루시퍼 라제를 발현하는 20 인간 아교 모세포종 이종 이식편을 이용한 이전 연구에 비하여, 이것은 우리의 모델의 제한으로 간주 될 것이다. 또한, 종양 성장의 면역 요법 전략의 효과 GL261 이종 이식 모델에서 연구 될 수있다.

공개 사항

공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

기술 지원을 해주신 Rajwant Kaur님께 감사드립니다. 렌티바이러스 준비에 도움을 주신 Maxwell Tom에게 감사드립니다. 이 연구는 UCSF의 Reza and Georgianna Khatib Endowed Chair in Skull Base Tumor Surgery와 Northwestern University의 Michael J. Marchese 교수 겸 의장의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
D-Luciferin, Potassium SaltGold BiotechonologyLUCK-100빛에서 멀리 보관
Living Image SoftwareCaliper Life Sciences견적문의 없음
Xenogen LuminaCaliper Life Sciences견적문의 없음
24-well; 표준 조직 배양; 플랫 바텀Falcon353047
CellTiter 96 A일회용 단일 용액 세포 증식 분석 PromegaG3582없음
Synergy 2 다중 모드 리더BioTek연락처 견적없음
없음 96 웰 분석 플레이트, 블랙 플레이트, 뚜껑이 있는 투명 바닥, 조직 배양 TretaedCoster3603없음
KetasetPfizerNDC 0856-2013-01제어 물질
XylazineSigma-Aldrich23076-35-9없음
28G 바늘 (주사기 포함) 어부   22-004-270일명 인슐린 주사기
2% 클로르헥시딘피셔NC9756995일명 " 놀바산"
3% 과산화수소피셔H312P-4빛에서 멀리 보관
과 연고추기경 건강1272830일명 " Akwa 눈물"
25G 1 1/2 바늘BD Becton Dickinson305127없음
일회용 메스깃털2975No. 21
거즈피셔22028563오토 클레이브 사용 전
가열 패드DunlapHP950없음
스킨 스테이플러, 스테이플, 리무버스톨 팅59020없음
PDI 알콜 준비 패드피셔23-501-711없음
Reflex 7mm 상처 클립 100 팩Brain Tree Scientific, INC203 1000사용 전 오토클레이브
Reflex 7mm 상처 클립 ApplierBrain Tree Scientific, INC204 1000사용 전 오토클레이브
Reflex 7mm 상처 클립 제거제Brain Tree Scientific, INC205 1000없음
나무 손잡이가 있는 단일 종단 라운드 팁 면봉Qosmedix10107전 Autoclave
Ca2+ 및 Mg2+ (HBSS)가 없는 Hanks의 균형 잡힌 염 용액Gibco14170-112없음
Hamilton 주사기Hamilton80300없음
FuGENE 6 Transfection 시약PromegaE2961없음
Bone WaxHarvard Apparatus599864없음
안 사용

참고문헌

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