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방법 논문

동정맥루 실패의 소설 쥐 모델 : 세부 수술

13.5K 조회수

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DOI:

10.3791/53294

⸱

2016년 2월 3일

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1Department of Nephrology, Leiden University Medical Center, 2Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine, Leiden University Medical Center, 3Department of Surgery, Leiden University Medical Center, 4Division of Nephrology, University of Cincinnati

이 논문에서

요약

여기에서 우리는 임상적으로 관련된 문합 구성이 통합된 동정맥루(AVF) 부전의 쥐 모델을 제시합니다. 이 모델은 병태생리학을 연구하고 가능한 치료 개입을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

동정맥루(AVF)는 여전히 불충분한 리모델링과 정확한 병태생리학이 알려지지 않은 내막 증식으로 인한 많은 실패를 겪고 있습니다. 병태생리학을 밝히기 위해 문합 배치가 임상 환경에서 선호되는 상황과 유사한 AVF-failure의 쥐 모델을 개발했습니다. 단결된 봉합사를 사용하여 외부 경정맥 분지의 정맥 말단을 총경동맥 측면에 연결하여 AVF를 생성하는 모델을 설명했습니다. 조직학적 수준에서, 우리는 정맥 유출로에서 진행성 협착 내막 병변을 관찰했으며, 이는 실패한 인간 AVF에서도 볼 수 있습니다. 이 절차는 동물의 크기가 작기 때문에 기술적으로 어려울 수 있지만 충분한 교육을 통해 97%의 수술 성공률을 달성할 수 있었습니다. 쥐 모델의 주요 장점은 형질전환 동물의 가용성입니다. AVF 실패의 원인이 되는 다양한 메커니즘에 비추어 볼 때, 혈관 재형성에 역할을 할 수 있는 유전자를 비활성화하면 AVF 실패의 복잡한 병태생리학을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다.

서론

기능 혈관 통로 도관은 살아 남기 위해 만성 혈액 투석에 의존 신부전 환자를위한 매우 중요하다. 동정맥루 (AVF)의 건설은 현재 혈관 액세스를 위해 바람직한 선택이 될 것입니다. 그러나 AVF 합병증 만성 혈액 투석 환자의 주요 사망 원인을 구성한다. 광범위한 과학적 노력에도 불구하고, 소설의 어느 것도 AVF 내구성의 상당한 개선 될 않았다 AVF 액세스 관련 합병증을 줄이기 위해 접근합니다. 이 실망 진행의 일부 혈액 투석 액세스 실패의 기본 기전 불완전한 이해에 관한 것이다.

밀접하게 인간의 병리를 모방 AV 접속 실패, 동물 모델의 병태 생리를 해명하기 위해 가장 중요하다. 이러한 관점에서뿐만 아니라 동물 종뿐만 아니라, 문 합부 필요한 항 coagulatory 요법 기간 서지 후 후속공예 계정 하나에주의해야한다. 큰 동물은 새로운 치료 전략을 개발 목표로 개입 연구에 가장 적합한 반면, 뮤린 모델 의한 형질 전환 마우스의 가용성 AV 액세스 실패를 기본 분자 메커니즘에서 더 파악할 수있는 큰 잠재력을 가지고있다. 또한, 마우스의 수많은 큰 동물의 사용과 비교하여 낮은 비용으로 이러한 목적을 위해 사용될 수있다.

AVF 장애 제 뮤린 모델 Kwei 및 동부 알.이이 모델 2004에 기술되었다에서 avfs는 경동맥 및 혈관 내 카테터를 사용하는 엔드 투 엔드 방식으로 경정맥을 이용하여 구성 하였다. 엔드 - 투 - 엔드 구성 및 혈관 내 카테터의 존재는 인간에서 avfs이 모델의 유효성을 제한하지만이 모델에서 avfs 초기 정맥 적응을 연구하는 것이 유용 할 수있다. 개선 AVF 모델은 Castier과 등에 의해 소개되었다. (3)하는 말에경동맥 경정맥 측에 접속된다. 그러나, 혈액 투석 환자에서 avfs 보통 동맥 측 정맥 끝 anatomizing 의해 구성된다. 이 유로 (4) 내의 혈역학 적 프로파일을 결정하기 때문에 AVF의 정확한 구성은 AV 액세스 모델의 중요한 특성이다. 후자는 장애 및 내막 증식증 (1H)의 후속 개발 내피 중요한 기여.

인간 6에서 사용 된 바와 같이 새로운 쥐 모델은 최근에 동일한 해부학 적 구성으로 개발되었다. 이 모델에서 AVF 중단 봉합 경동맥 측 외부 경정맥의 분기 단부 anastomosing하여 C57BL / 6 마​​우스에서 생성된다. 본 논문에서는 복잡한 기전을 해명보고자 뮤린 모델의 보급을 촉진하기 위해서,이 모델의 미세 수술 절차에 집​​중혈액 투석 접근 실패.

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프로토콜

모든 실험은 라이덴 대학 의료 센터의 동물 복지위원회에 의해 승인되었다.

1. 동물 준비 및 마취

  1. 3-4%의 이소 플루 란으로 가득 연속 마취 유도 챔버에서 마우스 (1-3 개월)를 마취.
  2. 목 및 전기 면도기를 이용하여 좌측 상부 다리의 내측부의 복부 측면을 면도 모발을 제거 테이프의 조각을 사용한다.
  3. 두 눈에 눈 연고를 적용합니다.
  4. 코 환기 마스크가 고정되는 가열 담요에 동물을 배치합니다. 접착 테이프를 사용하여 코 마스크에 머리를 흥분시키는.
    1. 다음 흐름에 산소가 풍부한 공기 세트를 사용하여 1.5 내지 2.0 %의 농도로 이소 플루 란을 전달 : 공기 0.3 L / min로 100 % 산소 / 분 0.2 L. 마취 깊이를 평가하고 필요한 경우 이소 플루 란의 농도를 조정 발가락 사이 피부 핀치.
  5. 동물을 흥분시키는누운 자세에서 약 37 ° C로 설정되어 모든 사지에 접착 테이프로 가열 담요.
  6. 0.1 mg을 투여로 염화나트륨 0.9 %에 용해 된 부 프레 노르 핀을 주입 / 동물의 측면에서 0.9 % NaCl을 멸균 피하 0.5ml를 함께 kg이다.
  7. 준비된 지역에 클로르헥시딘 팅크 0.5 %를 적용합니다.

2. 피부 절개

  1. 외과 의사를 향해 머리를 가진 현미경으로 동물을 배치합니다.
  2. 마이크로 가위를 사용하여 복부 목의 중간 선에서 약 1.5 cm의 종 절개를합니다.
  3. 집게로 침샘을 잡고는 부분적으로 상처 밖에까지 두개쪽으로 오른쪽 침샘을 대체.

3. 해부 및 정맥 준비

  1. 확인하고 퉁명스럽게 확산하여 혈관 주위 조직으로부터 완전히 오른쪽 외부 경정맥의 dorsomedial 분기를 해부 단지longside 및 혈관의 방향.
  2. 해부 정맥 주위에 루프 (10.0 봉합)을 배치하고 잠​​금없이 하나의 매듭을 적용합니다.

4. 흉쇄 근육을 제거

  1. 집게를 사용하여, 퉁명스럽게 그 국경을 따라 확산에 의해 그 주변에서 오른쪽 흉쇄 근육을 해부하다. 격리 된 근육에서 열린 포셉 한 쌍을 놓고는 6.0 봉합사와 근위 및 원위 결찰. 이어서, cauterizer를 사용 근육 절개.

5. 해부 및 경동맥 준비

  1. 확인하고 집게를 사용하여 오른쪽 경동맥을 해부하다. 동맥의 조작에 도움이 동맥 주위에 6.0 봉합 실을 배치합니다.
  2. 같은 말단 및 근위 가능한 혈관 클램프를 적용합니다.
  3. 전문 마이크로 가위를 사용하여 약 1mm의 동맥의 중간에 세로 절개를합니다.
  4. 린스헤파린 용액과 동맥 [100 IU / ㎖] 선박이 피가 깨끗해질 때까지.
  5. 측정 및 폭을 혈관 클램프 [1.1 mm]을 일치시킬 필요 절개의 길이를 조정한다.

정맥 6. 내고

  1. 근위 이미 준비 정맥의 혈관 클램프를 적용하고 정맥 주위 봉합 실을 배치합니다.
  2. 이전에 배치 된 10.0 봉합사를 사용하여 가능한 한 원심 정맥을 봉합 실에 배치하고 결찰하는 haemostat를 사용하여 정맥에 부드러운 꼬리 견인을 적용합니다.
  3. 결찰에 단지 근위 가위를 사용하여 정맥을 잘라.
  4. 혈관 집게를 사용하여 부드럽게 혈관의 내강을 열고 헤파린 솔루션 [100 IU / ㎖]로 씻어.

문합 제 1 항에 창조

  1. 여섯 O '에서 봉합 다음에 12시 위치에 2 평방 노트를 사용하여 중단 된 봉합사 (10.0)과 동맥 정맥을 연결합니다시계 위치입니다. 그것은 자신의 축 주위를 회​​전 할 수없이 동맥에 정맥을 연결해야합니다. 외과 적 노출을 개선시키기 위해 동물을 돌린다.
  2. 정맥 주위 봉합 실을 놓고 haemostat를 사용하여 부드러운 측면 견인을 적용합니다.
  3. 동일한 단속 봉합을 사용하여 문합 표시 복부 측에 약 3-4 봉합 부가 배치하여 문합을 완료.

8. 헤파린 관리

  1. 가열 담요를 180 ° 회전하고 왼쪽 상단 다리에 현미경을 집중한다.
  2. 상부 다리의 중간 부분에 길이 방향으로 실행하고 피부를 통해 볼 수있는 혈관 구조를 찾아 대퇴 정맥 / 동맥 / 신경 다발을 확인합니다. 직접 길이 방법으로 대퇴 정맥으로 약 1cm의 미세 가위와 절개를합니다.
  3. 조심스럽게 대퇴 정맥의 혈관 주위 조직을 해부하고 선량 오에 헤파린을 주입대퇴 정맥에 0.2 IU / g의 체중 바.

문합 제 2 항 만들기

  1. 목 영역으로 돌아가 정맥 주위에 배치 된 봉합 실을 제거합니다.
  2. 연속적으로 정맥을 통해 다시 경동맥 아래에있는 경동맥 아래를 통과 봉합 실 (6.0)을 놓습니다. (그림 1L)
  3. 정맥 혈관 클램프를 제거합니다.
  4. 다음으로, 동시에 혈관 클램프를 왜곡하여 절반 완료 동정맥루를 시계 방향 방식으로 경동맥의 축을 따라 180도 트위스트와 봉합 실의 끝 부분에 중간 견인을 적용합니다.
  5. 단계 7.2에서 설명하는 것과 같은 방식으로 문합을 완료합니다.

10. 혈관 클램프 제거

  1. 봉합 실을 제거하고 혈관이 180 ° 시계 반대 방향으로 회전 클램프.
  2. 근위 혈관 클램프 다음 말초 혈관 클램프를 제거합니다.
    3. <리는> 부드럽게 혈관 집게로 정맥 유출 관을 폐색하여 문합의 개통을 평가합니다. 특허 문합 경우, 사전 흡장 정맥 절에서는 박동성 방식으로 확장됩니다. 원래의 해부학 적 위치하여 집게에 대한 권리 침샘을 변경합니다.

11. 피부 폐쇄 및 수술 후 케어

  1. 중단 봉합 (6.0)와 상부 다리의 피부를 닫습니다.
  2. 중단 봉합 (6.0)과 목의 피부를 닫습니다.
  3. 가열 블랭킷으로부터 동물을 제거하고 0.5 ml의 0.9 % 염화나트륨을 피하 주사.
  4. 가열 램프 가열 어두운 새장에 동물을 놓고 완전히 복구 할 수 있습니다. 동물이 완전히 회복되지 않는 경우,이 때문에 외과 영역에서 출혈에 혈역학 적 충격으로 고생하지 않도록. 이러한 부어 목 혈액의 누출로 표지판을 찾아보십시오.
  5. bupr의 첫 번째 주사 후 약 6 시간 후enorphine, 추가로 72 시간 동안 적절한 진통을 제공하기 위해, 제조자에 의해 권장되는 투여 량의 부 프레 노르 핀 피하의 서방 성 제제의 단일 투여 량을 주입.

(12) 조직 수확

  1. 복강 투여 미다 졸람 (5 ㎎ / ㎏)을 포함 마취-혼합물, 메데 토미 (0.5 ㎎ / ㎏)과 펜타닐 (0.05 ㎎ / ㎏)과 동물을 마취.
  2. 비 가열 된 실리콘 매트에 그것의 발과 뺨을 통해 바늘을 삽입하여 앙와위에서 동물을 흥분시키는.
  3. 마이크로 가위와 목에 흉터를 통해 약 1.5-2.0 cm의 절개를합니다.
  4. AVF를 해부하고, 쉽게 식별하기 위해 proximal-, 말초 동맥 및 정맥 유출 기관 주위 봉합 스레드 (6.0)를 배치합니다.
  5. 프로토콜의 섹션 10.3에서 설명하는대로 AVF의 개통을 평가합니다.
  6. 내측 유 개복술을 수행하여 복강을 열고마이크로 가위를 노래.
    1. 쇄골 라인에 꼬리 쪽부터 가위를 사용하여 왼쪽과 오른쪽 복부 갈비뼈를 잘라. 마이크로 가위를 사용하여 집게를 사용하여 두개쪽으로이 부분을 복부 흉곽의 중간 부분에 부착 이후에 대체되는 다이아 프램을 가로로 쪼개다.
    2. 열등한 대정맥 정맥을 찾아 마이크로 가위로를 가로로 쪼개다.
  7. 좌심실에서 바늘 23 게이지 바늘을 삽입하고 intravasal 유체가 거의 깨끗해질 때까지 약 100 mmHg로의 압력에서 PBS로 관류.
  8. 니들을 제거하지 않고, 현재 약 100 mmHg의 압력에서 10 분 동안 4 % 포르말린 관류.
  9. 마이크로 가위로 동맥과 정맥 모두에 병행하여 AVF 절제 및 4 % 포르말린 용액 O / N에서 잠수함.

13. 조직 임베딩 및 단면

  1. 제조의 protoco에 따라 파라핀하기 위해 조직을 처리엘. 프로토콜은 다음의 구성으로 적용 :
    1. RT에서 1 시간 동안 70 % 에탄올에 담가. 배를 반복합니다.
    2. 실온에서 1 시간 동안 에탄올 96 %에 빠져. 배를 반복합니다.
    3. 실온에서 1 시간 동안 에탄올 99.5 %에 빠져. 한 번 반복합니다.
    4. 실온에서 1.5 시간 동안 에탄올 99.5 %에 빠져.
    5. RT에서 1 시간 동안 100 % 크실렌 빠져. 한 번 반복합니다.
    6. 62 ° C에서 1 시간 동안 Parafin에 빠져. 배를 반복합니다.
  2. 정맥 유출 관이 삽입 카세트에 수직 배향되도록 파라핀에 AVF를 포함.
  3. 마이크로톰을 사용하여 각각 5 μm의 두께 부 (30) (12)로 이루어지는 직렬 섹션을 생성한다. 그런 다음 각 직렬 섹션의, 문합에 가장 가까운 지역부터 시작 질서 열두까지 위치 하나에서 시작하는 단일 장착 유리에 한 섹션을 배치합니다.

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결과

문합 (그림 1)의 생성 후, 개통은 곧 혈관 집게로 정맥 유출 관을 폐색에 의해 평가되어야한다. 문합 특허 때, 폐색에 혈관 계통의 근위 명확하게 박동성 방식으로 확장한다. 또한 명백 적외선 투시 효과적으로 혈관 조영술로 함수 (NIRF) (도 2) 근처하여 확인된다. 수술의 실패는 (그림 2)에 도시되어 같은 문합의 폐쇄로 이어질 수 있습니다. 이 오류가 너무 좁 문합 영역 용기 토션 불충분 헤파린 투여 또는 뒷면에 문합의 전면을 연결하는 실수 봉합 위치에 의해 야기 될 수있다.

조직 학적 수준에서 AVF 혈관 리모델링 과정이 모델을 이용하여 연구를 매끄럽게 할 수있다. AVF 혈관 리모델링의 결과로 발생혈류 및 압력 증가. 마우스에서,이 반응은 수술 후 제 2 주 내강 영역의 증가로 이어지는 (예를 들면, 외측으로 개조) 둘레의 증가에 의해 특징된다. 이 두 주 후...

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토론

AVF는 혈액 투석 치료의 아킬레스로 간주됩니다. 불행하게도, AVF는 여전히 실패 8-10의 높은 숫자에서 겪고있다. 기본 메커니즘에 대한 광범위한 연구에도 불구하고, 정확한 병태 생리는 알려져 있지 않다. AVF 실패 수많은 쥐 모델은 이미 문헌 2,3,11,12에 기재되어있다. 그러나, 이러한 모델 중 어느 것도 대부분의 임상 상황에서 사용되는 동맥 측 문합 구성에 정맥 끝을 통합하지 않습니다. 얻어진 혈역학 프로필 혈관 재 형성에 중요한 역할 때문에 매우 적합하다. 또한, 모델의 일부 임상에서 사용되지 동맥 및 정맥 2,11 간의 연결 합성 커프를 사용했다.

임상 적 관련성을 개선하기 위해, 우리는 따라서 동맥 측 문합에 일방적 정맥 끝이 jugu의 지점 사이에 작성된 쥐 모델을 개발중단 봉합 6 LAR 정맥과 경동맥. 이 모델에서 중요한 histomorphological 변화는 외부를 포함...

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공개 사항

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

이 연구는 네덜란드 신장 재단(Dutch Kidney Foundation)의 보조금(KJPB 08.0003)의 지원을 받았습니다.

Carolien Rothuizen은 연구에 대한 공로를 인정받았습니다. Hoang Pham은 병리학 정밀 검사에 도움을 준 공로를 인정받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
해부 마이크로솝라이카M80
집게Medicon07.61.25
혈관 집게 S& TJFL-3D.2
혈관 겸S & TD-5a.2
겸자RobozSS/45
마이크로 가위 5mm 블레이드정밀 과학 도구15000-08
마이크로 가위 2mm 블레이드정밀 과학 도구15000-03
가위Medicon05.12.21
클립 적용기 1S & TCAF-4
혈관 클램프 1S & TB-1V
클립 어플리어 2B브라운FE572K
혈관 클램프 2BBraunFE740K
지혈 집게BBraunBH110
10.0 봉합BBraunG1117041
6.0 봉합BBraun768464
소작기미술 과학 도구18010-00
바늘 홀더Medicon11.82.18
안구 연고Pharmachemie41821101
Chlorhexidine tincture 0.5%Leiden University Medical CenterNA
HeparinLeo Pharma012866-08
BuprenorphinRB Pharmaceuticals 
IsofluranePharmachemie45,112,110
마취 마스크마스트리히트 대학맞춤형
MidazolamActavisAAAC6877
DexmedetomidineOrion141-267
FentanylBipharma15923002
연속 마취 유도 챔버Vet-tech 솔루션AN010R
자 사 사 283732

참고문헌

  1. Rotmans, J. I. Animal Models for Studying Pathophysiology of Hemodialysis Access. The Open Urology & Nephrology Journal. 7, 14-21 (2014).
  2. Kwei, S., et al. Early adaptive responses of the vascular wall during venous arterialization in mice. Am.J.Pathol. 164 (1), 81-89 (2004).
  3. Castier, Y., et al. Characterization of neointima lesions associated with arteriovenous fistulas in a mouse model. Kidney Int. 70 (2), 315-320 (2006).
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  14. Kennedy, R., et al. Does renal failure cause an atherosclerotic milieu in patients with end-stage renal disease. Am. J. Med. 110 (3), 198-204 (2001).
  15. Cheung, A. K., et al. Atherosclerotic cardiovascular disease risks in chronic hemodialysis patients. Kidney Int. 58 (1), 353-362 (2000).
  16. Lee, T., et al. Severe venous neointimal hyperplasia prior to dialysis access surgery. Nephrol. Dial. Transplant. 26 (7), 2264-2270 (2011).
  17. Kokubo, T., et al. CKD accelerates development of neointimal hyperplasia in arteriovenous fistulas. J. Am. Soc. Nephrol. 20 (6), 1236-1245 (2009).

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