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방법 논문

코어 텍스, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, 횡 중격 Nucleus-과 줄무늬 별

27.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53303

⸱

2016년 1월 18일

 , 
1TARC (Translational Animal Research Center), University Medical Center, JGU Mainz

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 자궁 내 전기천공법을 통해 C57BL/6 중추신경계의 다른 영역을 구체적으로 transfection하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜에는 피질, 해마, 시상, 시상하부, 외측 중격 핵 및 선조체로 발달하는 영역의 형질주입에 대한 자세한 지침이 포함되어 있습니다.

초록

자궁 내 전기천공법은 설치류 중추신경계의 다양한 유전자를 빠르고 효율적으로 시공간 조작하기 위해 널리 사용되는 기술입니다. 원하는 유전자의 과발현은 shRNA 매개 기능 손실 연구와 마찬가지로 가능합니다. 따라서 광범위한 응용 프로그램을 제공합니다. 별개의 영역에 있는 특정 세포를 표적으로 할 수 있는 가능성은 이 매우 유용한 방법의 잠재적 응용 범위를 더욱 증가시킵니다. 특정 영역을 효율적으로 대상으로 하기 위해서는 배아 단계, 적용할 전압, 가장 중요한 전극의 위치와 같은 미묘함에 대한 지식이 필수적입니다.

여기에서는 C57BL/6 마우스 중추 신경계의 여러 영역에 대한 자궁 전기천공법에서 특정적이고 효율적인 방법을 제공하는 상세한 프로토콜을 제공합니다. 특히, 후비장 피질(retrosplenial cortex), 운동 피질(motor cortex), 체성 감각 피질(somatosensory cortex), 이상형 피질(piriform cortex), 각진 암모니(cornu ammonis) 1-3, 치상회(dentate gyrus), 선조체(striatum), 외측 중격 핵(lateral septal nucleus), 시상(thalamus) 및 시상하부(hypothalamus)로 발달하는 영역을 transfection하는 방법을 보여줍니다. 적절한 배아 단계에 대한 이러한 정보를 위해 해당 배아 단계에 대한 적절한 전압이 제공됩니다. 가장 중요한 것은 양극의 적절한 위치를 나타내는 각도 맵이 묘사되어 있다는 것입니다. 이 표준화된 프로토콜은 자궁 내 전기천공법의 효율성을 촉진하는 데 도움이 되며, 이는 또한 동물 수를 감소시킬 수 있습니다.

서론

3 개의 독립적 인 그룹 1-3에 의해 2001 년 처음 소개 이후 N 자궁 일렉트로는 설치류 중추 신경계에서의 유전자 발현을 분석하기 위해 널리 사용되는 표준 도구가되었다. 지속적으로 개선 기술, 아직 시간과 돈 단순하기 때문에, 자궁 내 전기 호소 소비에도 불구하고,이다 녹아웃 마우스의 세대에 비해. 따라서, 자궁 내 전기는 신속하고 효율적인 이득이 손실-의 기능 연구 (4)를 할 수 있습니다.

뇌 영역 트랜, 음으로 하전 된 플라스미드를 함유하는 용액이 뇌실 내로 주입된다. 전기 펄스 동안, 음으로 하전 된 DNA는 양극으로 이동한다 따라서 형질 영역은 양극의 위치를​​ 변경하여 간단하게 선택할 수있다. 그것은 자주 중추 신경계의 다양한 영역 (TA)이 될 수 있음을 보여왔다3,5-8를 rgeted. 예를 들어, 최근의 연구는 해마, 배 모양의 피질이나 줄무늬 9-11의 특정 형질을 보여줍니다. 그러나, 해당 위치에 대한 정보는 거의 종종 표준화되지 않고, 항상 상이한 마우스 균주로 전송할 쉽지 않다.

특정 배아 단계의 형질 사소한는 거리가 멀다. 자궁의 전기의 특정을위한 셋업을 선택할 때 많은 영향을 미치는 요인을 고려해야합니다. 먼저, 각각의 최적 배아 단계 형질, 적절한 전압에 대한 지식이 필요하다. 낮은 전압이 형질 전환 효율을 감소 2,3,12 반면 고전압은 생존율을 감소시킨다. 또한 전극 패의 크기가 중요한 역할을 감소 특이성에 너무 큰 결과 또는 인해 심장 리듬 4,12,13의 애정에 사망에이를 수 있습니다 전극 충격기를 사용하기 때문이다. 적용전압의 크기와 전극 패들의 위치가 고려하는 가장 중요한 특징이지만, DNA-용액의 도포량 같이 전기의 결과에 영향을 미치는 또 다른 요인들도있다.

우리는 C57BL / 6 마우스 12 다양한 뇌 영역의 빠르고 효율적인 형질 있도록 상세한 프로토콜을 개발했다. 이 프로토콜에서 전압에 대한 자세한 정보는 사용되는 향상된 특이성 전극 패들의 크기가 제공된다. 또한, 심실 대한 정보 플라스미드 용액의 양 전극의 위치에 대한 권장 사항이 공급과 함께 충전된다. 지도와 이러한 위치의 더 시각화의 자세한 위치 정보의 표시는 retrosplenial 피질, 운동 피질, 체성 감각 피질, 배 모양의 피질, T의 자궁의 전기에서 간단 구체적이고 효율적으로 할 수 있습니다그는 ammonis 1-3, 치아 이랑 (dentate gyrus), 선조체, 측 중격 핵, 시상과 시상 하부 cornu.

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프로토콜

윤리 선언문 : 마우스 및 실험 절차의 처리는 동물 보호에 대한 유럽 국가 및 기관의 지침에 따라 실시 하였다.

1.에서 자궁 Electroporation에

참고 : 이전에 (12, 14)을 발표 한 자궁 전기에서 수행되었다. 따라서, 상기 방법은 이하의 (도 1)에 간단히 설명 만한다.

  1. 준비
    1. 이전 12 설명 된대로 (1,5는 pCAGGS를 포함) 빠른 그린 컬러 독소없는 고급 형질 급 플라스미드 솔루션을 준비합니다.
    2. 주사를위한 (35 ° 각도) 붕규산 유리 모세관 (0.8-0.9 직경)를 당겨 갈기.
    3. 악기를 소독.
  2. 외과
    1. 수술을 시작하기 전에 진통제 (카프로 펜, 4 ㎎ / ㎏ 체중, SC, 24 시간 저장소) 적어도 30 분을 관리합니다.
    2. 의 길이를 유지(- 수술 마취의 단계 Guedel 15에 따라 - 단계 III가 최대 25 ~ 30 분) 35 ~ 45 분의 최대 마취.
    3. (: 마스크를 통해 2.8 %, 수술 : 2.5 % 유도 챔버) 이소 플루 란과 시간이 초과 임신 쥐를 마취. 발가락 핀치에 응답하지 않는 문제로 마취를 확인합니다.
    4. 마취 동안 눈 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
    5. 7.5 % 프로 비돈 - 요오드 용액으로 수술 영역을 소독 노출 만 수술 영역 (0.9 % 벤질 알코올 식염수와 습기) 멸균 거즈와 마우스를 커버한다.
    6. (: 1.5 cm, 근육 절개 : 1.5 cm의 피부 절개) 메스로 복강을 열고 잘라.
    7. 수의학 직원 또는위원회의 지시에 따라 예열 0.9 % 벤질 알코올 식염수 또는 다른 멸균 등​​장 성 용액과 가습에 의해 건조에서 열린 복강을 보존합니다.
    8. 조심스럽게 손가락으로 자궁을 만지지 마십시오, 링 집게 사용하여 자궁 뿔 (추출에스).
  3. DNA와 전기 사출. 참고 : 특정 지역을 대상으로하는 정확한 세부 사항은 섹션 2에 표시됩니다.
    1. 준비된 붕규산 모세 혈관을 통해 그림 1과 2 절에 표시된대로 천천히 뇌실에 색깔의 DNA 용액을 주입.
    2. 해당 배아 단계에 해당하는 전압을 적용 (예. E14를위한, 36 ~ 38 V) 전문 집게 형 백금 전극 (간격주기 길이 50 밀리 초, 간격 일시 정지 950 밀리 초)를 통해. 질 벽의 손상을 최소화하기 위해 전압의인가시 전기 충격기 펄스.
  4. 포스트 전기 / 수술 후 관리
    1. 조심스럽게 복강에서 자궁 뿔을 교체합니다.
    2. 근육과 별도로 피부 절개 봉합.
    3. 복구를위한 열 지원 장치에 마우스 나머지를 보자.
    4. 복구 중에 마우스 (행동, 공급을 감독하고물 소비), 4 시간, 24 시간 및 수술 후 48 시간. 필요한 경우, 추가로 2 일간 추가 진통제 (카프로 펜, 4 ㎎ / ㎏ 체중, 24 시간 저장소)에 적용됩니다.

특정 뇌 영역 2. 형질

주 : 양극의 위치는 DNA 용액 (오른쪽 또는 제 3 뇌실)와 양극의 위치를​​ 가득 뇌실 통해 수직 중심선 사이의 각도로 표시된다. 좌심실을 채울 때 위치는 거울 반전. 도 4에 이어 원시의 위치는 중요한 기준점을 제공하는 나타낸다.

  1. 피질 영역의 형질 감염 (도 2A, 표 1).
    1. 1.2 절에 설명 된대로 수술을 수행합니다. 대뇌 피질의 영역에서 자궁 전기의 경우 E14 배아를 사용합니다.
    2. 우측 뇌실 4 μg의 DNA를 함유하는 DNA-용액 1.5 μL를 주입준비된 붕규산 모세 혈관을 통해.
      1. 신중 천자 부위 위에 보이는 혈관이 없도록 링 집게를 이용하여 태아의 위치.
      2. 천천히 lambdoidal 봉합에서 약 0.75 mm의 관상면과 시상 봉합 (그림 3)에서 0.5 mm 측면의 DNA 용액을 주입. 삽입 깊이는 1.2 mm (자궁 벽에서 측정 E14가) 있는지 확인하십시오. 날카로운 경계와 파란색 - 녹색 색소를 확인합니다.
    3. 전문 집게 형 백금 전극을 통해 전압 (간격주기 길이 50​​ 밀리 초, 간격 일시 정지 950 밀리 초)를 적용합니다.
      1. 3 5mm 전극 패들을 사용합니다.
      2. 36 ~ 38 V.에 이르기까지 전압을 사용하여
      3. 전극 귀 primordia의 바로 앞쪽의 중심을 놓습니다.
      4. , 운동 피질 0-40 °를 형질 형질, 체성 감각 피질 40-95 °를 형질, 330-0 °에서 retrosplenial 피질의 사용 각도를 형질배 모양의 피질 95-110 ° (그림 2A).
    4. 1.4 절에 설명 된대로 포스트 전기 / 수술 후 관리를 수행합니다. 쥐를 희생과 3 장에 기술 된 바와 같이 전기 (E18) 후 배아 4 일 분석 할 수 있습니다.
  2. 해마 (도 2B, 표 1)의 형질 전환.
    1. 1.2 절에 설명 된대로 수술을 수행합니다. 해마 형성의 자궁에 전기를 들어 E15 배아를 사용합니다.
    2. 준비된 붕규산 모세 혈관을 통해 오른쪽 측면 뇌실에서 4 μg의 DNA를 포함하는 DNA-솔루션 μL 2를 주입.
    3. 전문 집게 형 백금 전극을 통해 전압 (간격주기 길이 50​​ 밀리 초, 간격 일시 정지 950 밀리 초)를 적용합니다.
      1. 3 5mm 전극 패들을 사용합니다.
      2. 38-40 범위의 전압을 사용합니다.
      3. 음극 귀 primordium의 바로 앞쪽의 중심과 중심 (O)를 배치했다귀 primordium의 중간에서 양극 F.
      4. 치아 이랑은 CA1 250-275 ° (그림 2B)를 형질, CA2 230-250 °를 형질, cornu의 ammonis (CA) 3 210-230 °를 형질, 190-210 °에서 각도를 사용하여 형질합니다.
    4. 1.4 절에 설명 된대로 포스트 전기 / 수술 후 관리를 수행합니다. 3 장에 설명 된대로 (출생, P21 후) 완전한 해마 형성 한 후 분석을 수행합니다.
  3. 횡 중격 핵 선조체의 형질 감염 및 (도 2C, 표 1)
    참고 : 각도는 해마를 형질에 대한 그와 중첩된다. 효과적으로 측 중격 핵 원치 않는 해마 형질 전환 이전 배아 단계 (E12)없이 선조체를 형질하는 데 사용되어야한다.
    1. 1.2 절에 설명 된대로 수술을 수행합니다. 횡 중격 핵과 striat의에서 자궁 전기 용음 E12 배아를 사용합니다.
    2. 준비된 붕규산 모세 혈관을 통해 오른쪽 측면 뇌실에서 4 μg의 DNA를 포함하는 DNA-솔루션 μL (1)을 주입.
    3. 전문 집게 형 백금 전극을 통해 전압 (간격주기 길이 50​​ 밀리 초, 간격 일시 정지 950 밀리 초)를 적용합니다.
      1. 0.5 mm의 전극을 사용합니다.
      2. 33 (V)를 사용하여
      3. 이어 primordia의 수준에서 전극의 중심을 배치.
      4. 선조체 170-240 ° (그림 2C)를 형질, 100-170 °에서 횡 중격 핵의 사용 각도를 형질합니다.
    4. 1.4 절에 설명 된대로 포스트 전기 / 수술 후 관리를 수행합니다. 쥐를 희생과 3 장에 기술 된 바와 같이 전기 (E18) 후 배아 6 일 분석 할 수 있습니다.
  4. 시상과 시상 하부의 형질 (그림 2D, 표 1)
    1. 1.2 절에 설명 된대로 수술을 수행합니다. U에 들어시상과 시상 하부 사용 E12-E13 배아의 테로의 전기.
    2. 준비된 붕규산 모세 혈관을 통해 뇌실 (왼쪽 또는 오른쪽) 4 μg의 DNA를 포함하는 1.5 μL의 DNA 용액을 주입한다. 이 솔루션은 제 3 뇌실에 확산 될 때까지 2 ~ 3 분 동안 기다립니다. 다른 방법으로 직접 제 3 뇌실에 주입.
      참고 :이 특이성을 강화하지만 감소 생존율 (손상의 위험이 높은)가 발생할 수 있습니다.
    3. 전문 집게 형 백금 전극을 통해 전압 (간격주기 길이 50​​ 밀리 초, 간격 일시 정지 950 밀리 초)를 적용합니다.
      1. 0.5 3mm 전극을 사용합니다.
      2. 33-35 V.에 이르기까지 전압을 사용하여
      3. 바로 귀 primordia 후부 전극의 중심을 놓습니다.
      4. 시상 하부 90-180 ° (그림 2D)를 형질, 25 ~ 40 °에서 시상 사용 각도를 형질합니다.
    4. DES로 포스트 전기 / 수술 후 관리를 수행1.4 절에 cribed. 쥐를 희생과 3 장에 기술 된 바와 같이 전기 (E18) 후 배아 6 일 분석 할 수 있습니다.

3. 관류 고정

  1. 준비
    1. 따뜻한 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 37 ° C.
    2. PBS로 50 ML의 주사기 (4 ° C) 및 예열 PFA와 두 번째 주사기를 입력합니다. 거품을 피하십시오.
    3. 세 방향 꼭지에 주사기를 연결합니다. 날개 달린 주입 세트 (나비)에 세 번째 끝을 연결합니다.
    4. PBS로 날개 달린 주입 세트를 플래시합니다.
  2. 관류
    1. 깊이 피하 케타민 염산염의 응용 프로그램 (60 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (7.5 ㎎ / ㎏)와 (임신 또는 출생 후의 형질) 마우스를 마취.
    2. 발가락 핀치에 응답하지 않는 문제로 수술 허용 단계를 확인합니다.
    3. 바로 흉곽 아래 복강을 엽니 다.
    4. 조심스럽게 다이어프램을 잘라.
    5. 조심스럽게 전자에 컷을 통해 흉곽을 열고쇄골까지 ACH 사이트.
    6. (심장의 정점에서 시작) 왼쪽 심장 챔버로 나비의 끝을 삽입합니다.
    7. 좌심방을 잘라.
    8. PBS 천천히 (약 10ml)로 마우스를 관류.
    9. 삼방 코크 스위치.
    10. 5 ~ 10 ml의 4 % PFA와 마우스를 관류.
    11. 가위를 사용하여 마우스를 목을 벨과 난원 매그넘에서 시작 뇌를 해부하다. 이전에 (16)이 발표 한 절개를 수행합니다.
    12. 4 % PFA 2 일 동안 뇌를 Postfixate. 어둠 속에서 4 ° C에서 머리를 유지합니다.

4. 면역 조직 화학

  1. (vibratome와 예) 70 μm의 섹션을 생성합니다.
  2. 옵션 : 항체 염색 형광을 향상시킬 수 있습니다.
    1. RT에서 1 시간 동안 차단 부 (0.1-0.2 % 트리톤 X-100, 5 % 정상 염소 혈청)
    2. 적절한 항체 (1,000 방지 GFP, 1)로 O / N을 품어
    3. 워시 30.1 M 인산 완충와 -5 번.
    4. 적절한 형광 - 복합 이차 항체 (1,000 알렉사 플 루어 488 복합 항 - 토끼 IgG를, 1)과 3-5 시간을 품어.
    5. 선택적 : 1 분간 (0.1 M 인산 완충액 DAPI, 0.2 g / ㎖) 4-6-diaminodino -2- 페닐 인돌로 Counterstain과.
    6. 적절한 형광 현미경으로 형광을 분석 할 수 있습니다.

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결과

그림 2, retrosplenial 피질로 개발 지역의 자궁 전기의 특정에 대한 예를 보여줍니다, 운동 피질, 체성 감각 피질, 배 모양의 피질, cornu가 1-3 ammonis, 치아 이랑 (dentate gyrus), 선조체, 횡 중격 핵 , 시상과 시상 하부. 형질 감염의 결과는 권장 각도 (도 2) 다음에 나타낸다. 생체 내에서 각의 더 나은 시각화를위한 전극 (0.5 mm)의 위치도 (양막 낭 그림 5, 자궁 내 배아, 배아, 해부 배아) 배아에 표시됩니다. 제공하기 위해 개요 표 1은 특정 형질에 대한 중요한 사실들을 요약 하였다.

또한, 전극의 크기는 특이성 (도 6)에 대한 중요한 역할을한다는 것을 입증 하였다. 전극 패의 큰 크기는 라에 이르게예시...

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토론

이 프로토콜은 C75BL/6 마우스의 비장후피질, 운동 피질, 체감각 피질, 이상형 피질, 각암모니스 1-3, 치상회, 선조체, 외측 중격핵, 시상 및 시상하부를 형질감염시키는 방법을 자세히 설명합니다. 제공된 모든 정보와 함께 이것은 C57BL/6 마우스에서 이러한 대뇌 영역의 형질감염을 쉽게 재현하는 데 필요한 모든 정보를 제공하는 첫 번째 프로토콜입니다. 이전 간행물은 대부분 소수의 특정 지역에만 초점을 맞추고 있으므로 특정 형질감염에 필요한 자세한 정보는 거의 표준화되지 않았습니다.

효과적이고 특이적인 형질감염을 위한 중요한 단계인 전극의 위치와 크기, 해당 배아 단계에 적용되는 전압이 정확하게 설명되어 있습니다. 제공된 각도 맵은 특정 전기천공을 위해 전극의 방향을 지정하는 데 도움이됩니다. 전극의 위치는 자궁의 배아, 양막의 배아 및 순수하고 해부된 배아에 추가로 표시됩니다. 이 모든 것은 전극의 올바른 위치를 식별하는 데 도움이 됩니다.

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

Melanie Pfeifer와 Nikolai Schmarowski(Institute for Microscopic Anatomy and Neurobiology, University Medical Center Mainz)의 기술 지원.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
EndoFree 플라스미드 맥시 키트QIAGEN12362
Fast GreenRoth0301.1
pCAGGSAddgene
붕규산 유리 모세관 (직경 0.8-0.9mm)Precision Instrument Inc.1B100F-4
Isoflurane (Forene)AbbottPZN 4831850
Carprofen (Rimadyl)Pfizer GmbH승인 번호: 400684.00.00
눈 연고 (Bepanthen Augen und Nasensalbe)Bayer PZN 01578681
0.9% 벤질 알코올 0.9% 식염수 약국
대학 의료 센터 마인츠
거즈 (ES-Kompressen)Hartmann407835
멸균 5-0 Perma-Hand Silk SutureEthicon Johnson & JohnsonK890H
링 핀셋 1/ 1.5 mm파인 사이언스 도구11101-09
링 핀셋 4.8/ 6 mm파인 사이언스 도구11106-09
링 핀셋 2.2/ 3 mm파인 사이언스 도구11103-09
Adson 집게 - 톱니 모양 스트레이트 12 cm파인 사이언스 도구1106-12
아이리스 가위 - 섬세한 스트레이트 - 샤프/ 무뚝뚝한 10 cm파인 사이14028-10
Mayo-Stille 가위-스트레이트 15 cm파인 사이언스 도구14012-15
Dumont #5 펜치-Inox파인 사이언스 도구11251-20
Castroviejo NeedleHolder-잠금장치 포함-텅스텐 카바이드 14 cm파인 사이언스 도구12565-14
Elektroporator CUY21 SC 네파 진 (주)
FST 250 핫 비드 살균기파인 사이언스 도구18000-45
마이크로 그라인더 EG-44Narishige
P-97 마이크로 펫 풀러셔터 기기 회사P-97
백금 전극 650P 0.5mm네파젠CUY650P0.5
백금 전극 650P 3mm네파진CUY650P3
백금 전극 650P 5mm네파젠CUY650P5
백금 전극 650P 10mm네파젠CUY650P10
마취 시스템Rothacher-Medical GmbHCV-30511-3 증기 19.3
가열판Rothacher-Medical GmbHHP-1M
온도 컨트롤러 220VAC Rothacher-Medical GmbHTCAT-2LV
언스 도구

참고문헌

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코어 텍스, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, 횡 중격 Nucleus-과 줄무늬 별
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