방법 논문

miRNA의 뇌의 특정 최저 대한 정위 주입하는 간단한 대안

DOI:

10.3791/53307

⸱

2015년 12월 26일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology, New Delhi, India, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), New Delhi, India

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs는 뇌에서 중요한 역할을 하며 신경 퇴행을 모델링하기 위한 잠재적인 표적입니다. 그러나 miRNA의 길이가 짧고 뇌 조직에 접근하기 어렵기 때문에 miRNA 수치를 교란하는 것은 어렵습니다. 이 비디오는 마우스에서 뉴로펩타이드를 사용하여 antagomir 설계 및 뇌 특이적 전달 방법을 제시합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs(miRNAs)는 유전자 발현의 핵심 조절자입니다. 뇌에서 신경 발달 및 신경 기능과 같은 중요한 과정은 microRNA의 올바른 발현에 달려 있습니다. 뇌에서 microRNA의 섭동은 신경 세포 사멸을 조절하여 신경 퇴행성 질환을 모델링하는 데 사용할 수 있습니다. 현재 정위 주사(stereotactic injection)는 miRNA 녹다운(knockdown) 제제를 뇌의 특정 위치로 전달하는 데 사용됩니다. 여기에서는 고정 뉴클레오티드 변형(LNA)이 있는 miRNA에 대해 antagomir를 설계하는 전략에 대해 논의합니다. 그런 다음 뇌의 여러 영역에 걸쳐 균일하게 antagomirs를 뇌 특이적으로 전달하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 정위 주사에서 수술, 관련 부상 및 국소 전달의 한계를 극복하기 때문에 간단하고 널리 적용할 수 있습니다. 우리는 miRNA-29에 대항하여 안타고미르와 함께 신경영양성 세포 침투 펩타이드 광견병 바이러스 당단백질(RVG) 복합체를 준비하고 꼬리 정맥을 통해 주입하여 뇌에 특이적으로 전달했습니다. antagomir 설계는 miRNA의 특정 표적화와 펩타이드와의 비공유 복합체를 형성할 수 있는 기능을 통합했습니다. 신경 세포에서 miRNA의 knockdown은 apoptotic cell death 및 관련 행동 결함을 초래했습니다. 따라서, 방법은 miRNAs의 섭동을 통한 신경 퇴행의 급성 모형을 위해 이용될 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

마이크로 RNA에 의한 유전자 발현과 질병에의 참여에 대한 직접적인 증거의 규제에서의 보편적 인 역할에 새로운 치료 대상으로 등장했다. 약물이 1, 2를 대상으로 miRNA가 적극적으로 자신의 잠재력에 대한 탐구되고있다. 더욱이, miRNA의 발현의 변화가 여러 질환 3의 miRNA 발현의 인공 섭동에 의한 이러한 변화의 시뮬레이션과 관련된 질병의 발현에 관여하는 세포 경로를 연구하기 위해 사용될 수있다. miRNA의 표적 약물의 조직 특정 배달은 현재의 miRNA 기반 신약 개발의 주요 과제입니다. Antagomirs 및 miRNA의 모방은 miRNA의 레벨 4-6을 교란하기위한 유망 에이전트입니다. 그러나, 특이성 및 효능을 향상 특징들은 miRNA의 발현 생체 섭동에 사용될 수 있기 전에 antagomirs의 디자인에 혼입 될 수있다.

마이크로 RNA는 특히 관련이 현재 불치의 퇴행성 신경과 신경 발달 질​​환 대상으로. 혈액 - 뇌 장벽은 뇌에 antagomirs의 전달에 제한을 포즈. 정위 주사 널리 7 뇌의 특정 위치로 분자를 전달하는 설치류 모델에서 사용된다. 그것은 기술, 계측 및 시간에 광범위한 투자를 필요로한다. 정위....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

참고 : 동물 과목을 포함한 모든 절차는 기관 동물 윤리 유전체학 연구소의위원회 (IAEC)와 통합적인 생물학, 뉴 델리에 의해 승인 된 (IGIB / AEC / 2,013분의 10). 이 프로토콜은 특히은 miR-29의 뇌와 최저의 Antagomir-29의 표적 전달을 위해 조정됩니다.

1. Antagomir 디자인 전략

  1. miRBase (11)의 성숙한 miRNA의 순서를 검색 ( http://www.mirbase.org/ ).
  2. miRBase 레코드 "유전자 패밀리"링크를 사용하여 관련 miRNA의 가족 구성원의 서열을 검색
    ( http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009 ).
  3. 순서를 보완 역 : http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.ht....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시된 절차를 이용하여 형광 표지 된 올리고 뉴클레오티드 50microgram (FLO)와 전하 ~ 1시 15분 몰 비율의 850microgram RVG 펩타이드 복합체 (FLO : 펩티드)을 준비하고, 꼬리 정맥을 통해 한 번만 주입 하였다. 비 neurotropic 광견병 바이러스 매트릭스 (RVM) 펩티드 및 FLO의 복합체는 대인 대조군으로 사용 하였다. 다음날, 마우스 뇌 및 간을 분리 하였다 및 단일 세포 현탁액을 제조 하였다. 세포는 녹색의 형광 현미경으로 관찰 하였다. FLO-RVG 착체 성공적 아니지만 RVM 펩티드가 간뿐만 아니라 뇌 세포에서 FLO 전달하면서 간 (도 2B, 2D)에서 (뇌 세포에서의 녹색 형광 어느 날의 최단 시간에 전달하고 검출 된 도 2A, 2C).

은 miR-29 5 개의 LNA 수정 설계되었습니다에 대한 마우스의 뇌 antagomir .......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서 우리는 miRNA 조절의 효과를 연구하기 위해 널리 접근 가능한 방법론을 보여줍니다. 현재 miRNA 기능의 생체 내 특성화에 대한 대부분의 시도는 녹아웃 마우스 또는 miRNA 스폰지를 발현하는 형질전환의 생성을 포함합니다. 대부분의 miRNA, 심지어 세포 유형 특이적 miRNA도 둘 이상의 기관에서 발현됩니다. 예를 들어, 처음에는 조혈계에 특이적이라고 생각되었던 miRNA도 미세아교세포의 존재로 인해 뇌에서 발현됩니다. 따라서 세포 유형 특이적 프로모터의 제어 하에 miRNA에 대한 안티 센스 제제를 발현하는 세포 유형 특이적 녹다운 전략조차도 다발성 효과를 생성할 가능성이 높습니다. 예를 들어, miRNA의 miR-29 계열은 뇌, 혈액 세포 및 신체의 다른 여러 부위에서 발현됩니다. 따라서 miRNA 조절을 위한 유전 도구는 널리 적용되지 않습니다. 또한 약물 개발이나 잠재적인 치료 전략의 테스트에도 적합하지 않습니다.

간단한 .......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

안타고미르 설계에 도움을 준 Souvik Maiti에게 감사드립니다. 또한 실험 방법에 도움을 준 Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey 및 Bijay Pattnaik에게 감사드립니다. 이 작업은 과학 및 산업 연구 위원회(BSC0123)의 자금 지원을 받았습니다. HS, MV 및 RR은 인도 과학 및 산업 연구 위원회(Council of Scientific and Industrial Research)의 펠로우십을 인정합니다. MAS는 인도 대학 보조금 위원회(University Grants Commission)의 펠로우십을 인정합니다.

....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Vortex
Restrainer 또는 Decapicone
좁은 활주로~길이 70cm, 너비 ~5cm, 벽은 ~5cm입니다.
시약
형광 표지 올리고뉴클레오티드(siGLO)GE Healthcare Dharmacon INCD0016300120
10% 멸균 D-포도당
Antagomir-29Exiqon맞춤형 합성
Antagomir-controlExiqon맞춤형 합성
Neuropeptide RVGG.L.Biochem ( 상하이) Ltd.주문 종합>98% 순수성
Neuropeptide RVMG.L.Biochem (Shanghai) 주식 회사.주문 종합>98% 순수성
다른
면
온난한 물
인슐린 주사기
흡수성 장
잉크
솔
방부제

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
  2. Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease an....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

RNAPCR

관련 논문