아밀로이드-β (Aβ)의 동물 모델에 정의 된 수량 및 Aβ 단편 종의 관리를 가능하게하고 각 연구 그룹 내의 개별 차이를 줄여 주사 하였을. 이 프로토콜은 정상 마우스에서 알츠하이머와 같은 행동 이상의 생산을 가능하게 정위기구없이 Aβ의 뇌실 (ICV) 주입을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Amyloid-β (Aβ)는 가족성 및 산발성 알츠하이머병(AD)의 주요 병리학적 매개체입니다. 알츠하이머병 환자의 뇌에서 Aβ 올리고머와 플라크의 점진적인 축적이 관찰됩니다. 이러한 Aβ 이상은 장기적인 강화를 차단하고 시냅스 기능을 손상시키며 인지 결핍을 유발하는 것으로 여겨집니다. 임상 및 실험적 증거에 따르면 뇌에서 Aβ 수치의 급격한 증가는 알츠하이머와 유사한 표현형의 발달을 가능하게 합니다. 따라서 많은 경우에 Aβ의 ICV(intracerebroventricular) 주입을 통해 AD 마우스 모델을 급성으로 생성하는 방법을 설명하는 자세한 프로토콜이 필요합니다. 이 프로토콜에는 펩타이드 준비부터 행동 이상 테스트에 이르기까지 Aβ 주입 마우스를 사용한 실험 단계가 포함되어 있습니다. 주사 전에 도구와 동물 피험자를 준비하는 과정, ICV 주사를 통해 Aβ를 마우스의 뇌에 주입하는 과정, 인지 장애의 정도를 평가하는 과정은 프로토콜 전반에 걸쳐 쉽게 설명되며, Aβ의 효과적인 ICV 주사를 위한 팁에 중점을 둡니다. 연구자들은 지정된 Aβ 주사로 AD의 특정 측면을 모방함으로써 노화 과정을 우회하고 Aβ 이상의 다운스트림 병리학에 집중할 수 있습니다.
서론
알츠하이머 병 (AD)의 병리학 적 특징은 그 아밀로이드 β (Aβ)을 감안할 때, AD의 동물 모델의 개발은 Aβ의 신경 과발현에 초점을 맞추고있다. 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 또는 프레 (PS)의 돌연변이는 Aβ 평형 외란 궁극적 가족 성 AD (1)의 발병을 유도하기 때문에, APP 또는 PS 유전자 돌연변이를 포함하는 마우스 모델이 일반적으로 허용되고있다. 형질 전환 마우스의 넓은 범위 중, 원형 마우스 모델은 다음과 같습니다 : TG2576, PDAPP, APP / PS1과 APP23합니다. 뇌에서,이 마우스는 일반적으로 Aβ 응집 결국 노인반을 나타내고; 플라크 형성은 그들이 학습과 기억의 행동 테스트에서 성능 저하를 표시하도록 유의 한인지 장애옵니다. 천연 인간 AD 병리를 모방하는 트랜스 제닉 마우스를 사용하여 생성을 따라서 다이의 진행을 모니터하기 위해 우리시킴으로써 AD 연구 사회에 기여한sease. 이 Aβ 플라크를 개발하기 위해 마우스 개월 취하고 더 긴 Aβ 유도 시냅스 또는 2,3- 행동 이상을 표시하기 때문에, 트랜스 제닉 마우스를 사용하는 것은 비 경제적으로 시간 소모적이다. 원래 형질 전환 마우스 모델의 단점을 극복하기위한 대안으로 개발 된, 비 - 형질 전환 모델은 또한 일반적으로 그들의 독특한 이점 때문에 사용된다. AD와 같은인지 결핍은 다른 물리 화학적으로 유발 될 수있는 반면 병원체 - 유도 AD의 모델 수단 - 예컨대 스코 폴라 민 등의 신경 독성 화합물의 주입, 병변의 유도로, 뇌에 Aβ의 직접 주사에 의해 제조 할 수있다 이러한 해마와 같은 또는 대뇌 피질의 손상 사에 의해 인식 관련 분야이다. 그러나,인지 장애의 비 병원성 유도 정확하게 AD의 기본 병태 생리를 반영하지 않는다; 대신, 그것은 단지 그 결과 증상을 모방. 대조적으로, AD 병원체 - 유도 모델은 A(46), 주사 하였을 마우스 모델은 AD-같은 행동 이상을 표시 할 수 있습니다뿐만 아니라, Aβ 병리, 가족 및 산발적 AD가 공유하는 공통의 기능을 나타낼 수있다.
뇌 조직에서 Aβ 플라크를 시각화하기 어려움에도 불구하고, AD의 조사가 매력적인 만드는 Aβ 주입 모델의 가장 큰 장점은 제어합니다. 연구자들은 마약 관련 연구에서 잘못된 데이터로 이어질 수 마우스 모델의 개별 차이를 걸러 수 있습니다. 적시 약물 치료는 후보 약물의 기전에 따라 활성화되고; 정교한, Aβ 응집 억제제는 Aβ의 주입 전에 적용 할 수있다. 또한, 연구자들은 다른 요소가 긴밀하게 개인차를 포함하여 제어되기 때문에 Aβ 주입 후 발생하는 병원성 변화가 Aβ 노출에서 파생되어 있다고 가정 할 수 있습니다.
시간이 프로토콜에서 생생한 설명흐름은 제시 정위기구없이 Aβ의 뇌실 (ICV) 주사를 통해 정상 마우스의 AD-같은 표현형을 유도합니다. 뇌 조직에 주입 - 유발 손상을 최소화하는 구조적 손상 및 병변을 유발 염증 가능성을 방지하기 위해 필수적이다. 마우스 취급 능력의 부족은 뜻밖의 연결 부상으로 이끈다. 또한, 주입하는 동안 달성 될 수있는 적절한 각도 및 깊이를 활성화 기술은 잦은 오류를 회피하는 것이 특히 중요하다. ICV 주사 상세한 선명한 설명에 더하여, 이하의 프로토콜에 의해 생성 된 모델의 신뢰성은 또한 다음 섹션에서 설명된다. 다음 프로토콜함으로써 궁극적으로 AD 사회에 대한 의미있는 발견으로 이어질 수있는 발판을 제공, AD 연구에 기여하는 안정적이고 쉽게 이해 도구가 될 수 있습니다.
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프로토콜
모든 동물 실험 (1978 개정, NIH 간행물 번호 8023) 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 수행과의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 동물 관리 및 사용위원회와 함께했다 KIST (서울, 한국).
1. 동물 준비
- 7 주령의 수컷 ICR 마우스 (또는 C57BL / 6) 군을 준비한다.
- 쥐가 항상성을 복원 전송 ~ 7 일 동안 적응 과정을 통해 가자. 일반적으로, 각 장에 4-5 마우스 그룹을 올려 놓고 12/12 시간의 명 / 암주기, 22 ~ 23 ° C에서 40 % 습도에서 그들을 유지한다. 물과 음식 광고 무제한을 제공합니다.
순응 과정이 새로운 주택, 음식, 물 운송 및 적응의 스트레스에서 회복을 허용하는 것이 중요합니다, 새로운 케이지 빛 사이클뿐만 아니라 냄새 :합니다. 이 실험에서, 마우스는 SPE에있는 개별 환기 케이지 (IVCs)에 수납 된cific 병원체 무료 (SPF) -grade 시설 - 각 마우스의 무게를 측정하고, 그 중량 평균에서 ± 10 %를 벗어나는 주제를 제외 할 수 있습니다.
- 두 그룹으로 주제를 나누어 : 차량 주입 그룹 (Aβ를 (-))와 Aβ 주입 그룹 (Aβ (+)). 실험은 특정 약물 후보의 효능을 테스트하는 경우, 네 개의 그룹으로 마우스를 분할 (1) Aβ (-) / 약물 (-), (2) Aβ (-) / 약물 (+), (3) Aβ (+) / 약물 (-), (4) Aβ (+) / 약물 (+).
2. Aβ 펩타이드의 제조
- 미리 냉각 된 1,1,1,3,3,3- 헥사 플루오로 -2- 프로판올 (HFIP) 상관 응집체를 용해 6 균질 한 펩티드를 확인하여, 화학적 합성을 통해 5 또는 상업적 출처로부터 유도되는 Aβ 펩티드 치료 .
- (RT시) 5 분간 부드럽게 선회하는 물 - 욕조 초음파 처리기에서 Aβ / HFIP 용액을 초음파 처리하고 RT에서 30 분 동안 용액을 배양한다. 완전히 질소와 증발을 통해 HFIP를 제거그리고 사용할 때까지 -80 ° C에서 균일 한 Aβ를 저장합니다.
- Aβ 단량체를 준비 (. 100 μM Aβ, 10 % DMSO, 90 % PBS) 1 mM의 Aβ의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 주식을하고 희석 10 배 인산염 완충 식염수 (PBS)를의
- Aβ 올리고머를 준비합니다.
- 각각 3 ~ 7 일 동안 37 ° C에서 (단계 2.2). (Aβ (1-42) 또는 Aβ (1-40)를 포함)가 Aβ의 모노머 용액을 인큐베이션.
- 인큐베이션 기간 동안 수분 증발을 방지하기 위해 습한 환경을 제공하기 위해 젖은 종이 타월을 함유하는 지퍼백에 밀봉 된 튜브에서 Aβ 용액을 놓는다.
- 변성 단백질 (6)의 광 - 유도 된 가교 나트륨 도데 실 설페이트 - 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 제조 Aβ 올리고머를 확인한다.
- 차량 ICV 주사 10 % DMSO를 함유하는 제어 PBS 용액을 준비한다.
3. 주사기 준비
- ICV 주입을위한 26 G 스테인레스 스틸 바늘와 마이크로 실린를 준비합니다.
- 수술에 사용되는 다른 모든 장치와 오토 클레이브 멸균 주사기. 오토 클레이브 후, 20 분 동안 자외선 아래에 장치를 배치합니다.
- 뇌 (그림 1A)에 주입의 깊이에서 최대 정확도를 사용하려면 3.8 mm로 길이를 조정하는 파라 필름과 마이크로 실린의 바늘을 감싸. (B6 마우스의 경우, 3.6 mm에 주사기 바늘을 조정).
참고 : 파라 필름의 압축 3.6 mm의 복부를 초과 주입의 깊이로 이어질 것입니다. 바늘 삽입시 압축되는 것을 파라 필름을 방지하기 위해, 밀도가 바늘을 여러 번 포장. - 회, 70 % 에탄올로 주사기의 내부 공간을 세척한다.
- RT에서 30 분 동안 물 욕조 초음파 처리기에서 주사기와 바늘을 초음파 처리.
- 회, 70 % 에탄올로 주사기의 내부 공간을 세척한다.
- 주사기를 씻어증류수와 이상 30 분 흄 후드에서 완전히 건조와. Aβ 주입을 시작하기 전에 20 분 동안 자외선 아래에서 깨끗한 주사기를 남겨주세요.
4. Aβ 주입 마우스 모델 준비
참고 : 무균 상태를 유지하고 70 % 에탄올 및 자외선 노출을 사용하여 ICV 분사에 대한 모든 수술기구를 소독하는 소독제로 운영 필드를 청소합니다.
- 자일 라진 (20 ㎎ / ㎏) 및 tiletamine의 혼합물을 복강 내 주사하여 마우스를 마취 · 염산 / zolazepam · ICV 주사 전에 염산 하였다 (80 mg / kg). 마취하면서 체온을 유지하고 발 핀치 반응을 평가하여 적절한 마취를 확인하기 위해 따뜻한 매트에 마우스를 놓습니다.
- 적용 멸균 PBS는 절차 (그림 1B) 동안 각막 건조를 방지하기 위해 두 눈에 떨어진다.
- difficu의 경우에는 그 표면에 여러 개의 직선 수직선을 그려 두 개의 거울을 준비합니다lty 수직 주사기 주입.
- 바로 옆에 마우스의 몸과 다른 (M2)에 머리의 앞에 하나의 거울 (M1)를 놓습니다. 마우스의 두 눈 사이의 가상의 중심선에 평행 한 M1로 유지하고 두 개의면이 90 ° (도 1C)을 형성하도록, M1 M2에 수직 정렬. 연구자가 오른 손잡이 인 경우 마우스의 왼쪽에 M1을 놓습니다. 연구자가 왼손잡이 경우 마우스의 오른쪽에 M1을 놓습니다.
- 마우스의 이마의 중앙에 70 % 에탄올 스프레이 건조 면봉으로 문질러. 때문에 알코올 증발 체온 저하 피하기 위해 이마의 영역이 너무 큰 적시 지 않는다.
- 깨끗한 면봉을 사용하여 2 % 클로르헥시딘 용액으로 이마에 같은 부위를 닦아주십시오. 3 회의 총 알코올, 클로로 헥와 반복 scrubbings.
필요한 경우, possi을 최소화하기 위해 마우스의 이마에 모발을 면도 참고오염의 부 합성 - 브레 그마를 찾습니다.
- 엄지와 검지를 사용하여 긴밀 이마의 피부에 직접 누르고 두 눈이 돌출 정도에 위의 두 눈. 팽팽 이마를 만들어 피부 아래 두개골의 움직임을 최소화하기 위해 다시 피부를 드래그합니다.
- 3 개의 꼭지점 할당하여 눈에 보이지 않는 삼각형을 형성 : 마우스의 두 눈과 포인트를 어디에 엄지와 검지 손가락 대회, 브레 그마. (도 1B, 빨간색 화살표 : 브레 그마)
- 브레 그마에 -1.0 ± 0.06 mm 후방, 깊이 시상 봉합에 측면 ± 0.1 mm 1.8, 2.4 mm (그림 1D, 푸른 별 : 주입 지점 각 반구에서) 측정 테이프로 주입 지점을 찾습니다. (B6 마우스의 경우 : -0.9 mm 후방, 깊이 1.7 mm 측면, 2.2 mm)
- 우발적 인 공기 주입을 방지하기 위해 과량의 용액을 10 μL Aβ 용액 또는 비히클로 주사기를 채우기.
- 일에 주사기를 놓습니다전자 주입 지점 (프로토콜 47에 기재되어 있음). 주입 지점의 평면에 수직 주사기를 만든다. 정렬은 고정 된 관점 (그림 1C)에서 미러에 그려진 선을 모두 거울에 주사기의 이미지를 반영합니다.
- 파라 필름 포장이 피부에 도달 할 때까지 바늘을 삽입하기 시작한다.
- 안정 손을 잡고 주사기를 유지하고 일시 정지하지 않고 천천히 5 초 동안, Aβ 용액 또는 차량의 5 μl를 주입하는 다른 손을 사용합니다. 주사기가 전반에 걸쳐 수직으로 유지해야합니다. 주입을 완료 한 후, 확산을 위해 주사기를 제거하기 전에 3 초 5를 기다립니다.
- 원래 삼각형의 위치를 가정하면, 불필요한 움직임에서 두개골을 보호하기 위해 적당한 압력을 발휘. 경사하지 않고 주사기를 제거합니다.
- 복구를 위해 따뜻한 패드의 Aβ 주입 마우스를 놓고 그 흉골 드러 누움을 유지한다. 이 의식을 회복 할 때까지 무인 마우스를 두지 마십시오과 m을 반환하지 않습니다완전히 회복 될 때까지 비수술 마우스를 포함하는 케이지 여러개.
- 단계 3.3-3.6에 따라 주사기를 씻으십시오.
- 수술 후 마우스의 이동을 모니터링 5-7 일 동안 생쥐에 감염 또는 질병의 징후를 확인합니다.
ICV 영역으로도 1 Aβ 주입 (A)를 변성 주사기 바늘에 비해 파라 필름 래핑 주사기 바늘.; (B) PBS 건조를 방지하기 위해 눈에 상품; 엄지, 검지 손가락으로 마우스의 이마에 형성된 삼각형, 마우스의 두 눈뿐만 아니라 각각의 눈에서 등거리 가상 중간 선; (C) 바늘 주사기의 주입으로 수직 도와 표면에 그려진 복수 수직선 두 거울 (M1 및 M2); (D) 분사 점 삼각형, 인도어ated으로 푸른 별 (브레 그마에서 -1.0 ± 0.06 mm와 sagittally 1.8 ± 0.1 mm) 마우스의 각 반구에; 녹색 화살표 : 파라 필름, 빨간색 화살표 : 브레 그마 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Y-미로와 뇌 분석하여 Aβ 주입 5. 확인
- Y-미로 테스트 -3,7,8-을하여 Aβ 주입 마우스의 작업 메모리 평가
- 메모리 적자의 발병에 대한 주입 후 3 일 기다립니다.
- 3 개의 동일한 무기 흑색 플라스틱 미로를 사용하여 Y 미로 테스트를 수행하는 라벨 A, B, 및 C 각각의 미로의 중앙에서 120 °의 각도로되는 분기 OUT (너비 X 길이 x 높이의 10cm × 40 cm × 12 cm).
- 시작 암 (암 A)에 마우스를 놓고 피사체가 자유롭게 8 분의 미로를 탐험 할 수 있습니다.
- 각 아암에 엔트리 수를 측정하고 계산 altern각 과목 3,9의 ATION 속도.
- 직접 분사가 적절하게 ICV 영역을 대상 여부를 확인하기 위해 사후 뇌를 검사합니다.
- 4.1 절에 설명 된 것과 동일한 절차에 의해 마우스를 마취. 그리고 자궁 경부 전위로 마우스를 희생.
- 마우스를 목을 벨 및 수술 가위를 사용하여 두개골을 노출 피부를 제거합니다. 두개골에서 조직과 근육을 제거합니다.
- 뇌에 손상을주지 않고 (정수리와 interparietal 뼈 사이)에 lambdoid 봉합에 상처를 확인합니다. 후두 및 interparietal 뼈, 후 두정엽과 전두엽 뼈를 제거합니다. 집게를 사용하여 두개골 뼈를 제거하고 수막을 올려 두개골에서 뇌를 분리.
- 냉장 멸균 식염수의 뇌를 세척하고 수술 칼 (그림 2)와 관상 방향으로 뇌의 ICV 영역을 잘라.
- 온 니들 삽입의 추적에 기초하여 분사 영역을 확인뇌 조직 (그림 2). 니들 추적 심실 중 하나에 도달하면 확인합니다. 니들 트레이스가 충족 또는 심실을 통과하지 않는 경우의 실험 결과의 분석으로부터 그 대상의 데이터를 제외.
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결과
이 섹션에서는 Aβ 집계 및 메모리 적자의 Y-미로 평가의 확인에 의해 얻을 수있는 결과의 예를 보여줍니다. 전장 Aβ를 사용하여 42 개의 아미노산 Aβ 모노머, 올리고머의 혼합물, 및 피 브릴 (도 3)의 (1-42) 펩티드를 제조 하였다. HFIP 유도 monomerization 공정을 통해, 상대적으로 균일 한 단량체 (레인 B)를 얻었다. 7 일간 배양 한 후, Aβ 집계 (레인 C)의 다양한 크기를 개발했다. 삼량 체 및 사량은 Aβ의 올리고머 형태 중 우점종이었다. 작업 메모리 공간은 Y 미로 시험에서 교대 통해 Aβ 주입 된 마우스에서 평가 하였다. 각 마우스 자유롭게 미로를 탐험 할 수있는 동안 팔 선택의 순서와 전체 팔 항목의 수를 기록했다. 더 그대로인지 능력은 마우스보다 덜 최근에 방문한 아암 알테 들어가는 경향이 있어야그 팔 선택을 rnating. Aβ 주입 마우스 그룹인지 결핍 (도 4)의
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토론
이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 Aβ의 ICV 주입입니다. 이 프로토콜은 정위기구 (11, 12)없이 마우스의 ICV 영역으로 Aβ를 주입하도록 설계되었습니다. 실험을 시작하기 전에, 대신 Aβ의 파란색 염료와 연습 주사의 예비 기간은 충분한 손재주를 달성하기 위해 장소를해야한다. 즉시 주사 한 결과, 안료 분사가 적절하게 수행되었는지 여부를 확인할 필요가있다. 조심스럽게 뇌를 꺼내 해당 영역이 파란색으로 염색되었는지 여부를 확인합니다. 색소 라인에 도달하지만,의 ICV 영역의 깊이를 초과 할 수 없습니다. 일반적으로 50 개 이상의 ICV 주사 한 후 달성 90 % 성공률 최소가 제안된다. ICV 주입하는 동안, (브레 그마 영점에 가까운) 시상 동을 주입하여 혈관의 손상을 방지.
Aβ 주입 한 후, 통계적으로 유의 한 기억 손상이 관찰되었다Aβ 주입 그룹과 행동 테스트를 Y가-미로 사용하여 대조군 사이 라. 행동 실험의 종류는 13 미로
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 한국의 보건 복지부, 공화국 (: H14C04660000 허가 번호)에 의해 투자 한국 보건 산업 진흥원을 통해 한국 의료 기술 R & D 프로젝트의 기금에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| ICR 마우스 | Orientbio | 남성, 6-8 주, 체중 27-29g | |
| C57BL / 6 마우스 | Orientbio | 남성, 6-8 주, 체중 21-23g | |
| Amyloid-beta1-42 | 집 합성 | 재고 농도 : 1 mM / DMSO, 주입 농도 : 100 μ M/10% DMSO 및 90% PBS | |
| ICV 주입 주사기(26s 게이지) | Hamilton | 80308 | |
| Evans blue dye (EBD) | abcamBIochemicals | ab120869 | 1% EBD in PBS |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| PBS | gibco | 10010-023 | |
| Gradi-GelTM II Gradient PAGE 분석 키트 | ELPiS Biotech | EBS-1056 | 15% 젤 |
| Precision Plus ProteinTM Dual Xtra Standards | Bio-Rad | 161-0377 | |
| 은 염색 키트 | GE-Healthcare | 17-1150-01 | |
| LabDiet | Orientbio | 5053 |
참고문헌
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