Method Article

마우스 모델의 유효성 검사는 세포 고유의 방식으로 LINC 단지를 방해

DOI:

10.3791/53318

⸱

December 10th, 2015

 ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Washington University in St. Louis School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

핵막 단백질은 많은 기본적인 생물학적 과정에서 중심적인 역할을 하며 다양한 인간 질병과 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 LINC 복합체 파괴의 시공간 제어를 허용하는 새로운 Cre/Lox 기반 마우스 모델을 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

개발도상국과 성체 조직 내에서의 핵 이동과 정착은 핵골격 및 세포골격(LINC complexes)의 고리(LInkers)라고 불리는 큰 고분자 단백질 어셈블리에 크게 의존합니다. 이 단백질 골격은 핵막에 걸쳐 있으며 핵 내부를 주변 세포질 세포골격의 구성 요소와 연결합니다. LINC 복합체는 각각 SUN 도메인과 KASH 도메인이라고 하는 C-말단 분자 서명 모티프를 가진 두 개의 진화적으로 보존된 단백질 패밀리인 Sun 단백질과 Nesprins로 구성됩니다. 태양 단백질은 내부 핵막의 막관통 단백질로, N-말단 핵질 도메인은 핵 층과 상호 작용하고 C 말단 태양 도메인은 핵 주위 공간으로 돌출되어 Nesprins의 KASH 도메인과 상호 작용합니다. Canonical Nesprin isoforms는 세포질로 돌출되어 세포골격의 구성 요소와 상호 작용하는 다양한 크기의 N-terminus를 가지고 있습니다. 이 프로토콜은 세포 유형 특이적 방식으로 내인성 SUN/KASH 상호 작용을 방해하는 우성-음성 형질전환 마우스 전략의 검증을 설명합니다. 우리의 접근 방식은 LINC 복합 불활성화의 생식계열 모델과 관련된 주산기 치사율 및 세포 비자율적 표현형과 같은 많은 단점을 우회하는 Cre/Lox 시스템을 기반으로 합니다. 이러한 이유로 이 모델은 다양한 조직에서 발달 및 항상성 중 LINC 복합체의 역할을 이해하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

핵 봉투 (NE)는 세포질에서 핵질을 분리한다. 그것은 핵 구멍에 연결하는 내부 및 외부 핵 막 (INM 각각 ONM)로 구성되어있다. 모두 멤브레인로 구분 루멘은 핵 주변 공간 (PNS)라고합니다. ONM 러프 소포체 (ER)의 연장이고, INM 핵 박판에 부착, A- 및 B 형으로 표현 핵-V 형 중간 필라멘트 그물 세공은 1,2 라민. Nucleoskeleton 및 세포 뼈대 (LINC) 복합체의 링커는 물리적 골격 필라멘트 및 분자 모터 (그림 1A)에 핵의 내부를 연결하는 전체 핵 봉투에 걸쳐 거대 분자 어셈블리입니다. 일 (SAD1 / Unc84) 단백질과 Nesprins (핵 봉투 SPectRINS) : 그들은 NE의 통합 횡단 단백질의 두 가족의 특성을 진화 적으로 보존 모티브 사이의 상호 작용으로 구성되어 있습니다. 포유 동물에서, Sun1 Sun2에 ARN 말단 영역 nucleoplasmic A- 및 B 형 라민 3-5와 직접 상호 작용 INM의 E 막 횡단 단백질. PNS 내 INM의 다른 측면에서, 썬 단백질은 150 C- 말단 아미노산이 태양 도메인이라고 ~의 진화 - 보존 스트레칭 항구. SUN 도메인은 진화 - 보존 KASH와 직접 상호 작용 (Klarsicht / ANC-1, 영신의 인사 상동) 도메인, Nesprins의 분자 서명. KASH 도메인은 막 횡단 도메인 (6) 다음에 PNS 내로 돌출 ~ 30 C 말단 아미노산 스트레치로 구성된다. 적어도 네 가지 Nesprin 유전자 (Nesprin1-4)는 NE 7에서 지역화 단백질을 KASH 함유 인코딩. 놀라운 1,000 kDa의 (Nesprin1 거인)에 크기가 달라질 ~ 50kDa (Nesprin4)에서 Nesprins의 세포질 영역은 여러 스펙 트린은 액틴, plectin 및 분자 모터 8과 같은 세포 골격의 구성 요소와 상호 작용을 가능하게 반복뿐만 아니라 특정 주제 포함 (13).

<척추 동물과 무척추 동물의 P 클래스 = "jove_content"> 연구 라민 / 일 / Nesprin / 분자 모터는 진화 적으로 보존 된 "축"핵 이동과 고정을 제어를 구성하는 것으로 나타났습니다. LINC 복잡한 구성 요소의 여러 녹아웃 (KO) 마우스 모델을 설명하고 포유류의 개발 9,14,15시 (NE)에서 태양과 Nesprin 단백질의 역할을 이해하는 프레임 워크를 제공하는 수단이되었다되고있다. 그러나, 이러한 모델 특히 현재 몇 가지 중요한 단점 :의 표현형 기여 구별 비 자치 효과, 2) 어려움을 세포에 의한 표현형 해석 1) 어려움 KASH없는 Nesprin 대 KASH이 함유, 3) 16 이소 폼 다양한 세포 유형의 NE에서 태양과 Nesprin 단백질의 기능 중복은 모두의 KASH 도메인에 대한 결핍 마우스 (17)의 모든 SUN-KASH 상호 작용과 마우스의 4) 주 산기 치사를 비활성화하는 복잡한 번식 체계를 필요Nesprins1 2는 성인의 분석 18 표현형을 배제한다.

이 프로토콜은 따라서 위에서 설명한 단점이 많은 우회, 셀 자율과 발달 규제 방식으로 생체 내에서 모든 Sun-KASH 상호 작용을 방해하기 위해 설계된 새로운 마우스 모델에 대해 설명합니다. 이는 Cre 호텔 / LOX 계 마우스 모델은 두 개의 중요한 개념에 의존한다 : 1) 공지 Nesprin 단백질 KASH 도메인은 세포 배양 시스템에서 NE에 EGFP 타겟팅 및 2) 일 도메인이 과발현 따라서 KASH 도메인으로 이것은 무작위 상호 작용하기에 충분한 어떤 KASH 도메인은 모든 내생 일 도메인을 포화과 지배적 인 음성 방식 (17) (그림 1B)에 LINC 복합체를 비활성화합니다. 이 프로토콜은 조직 수확 및 소뇌 조롱박 세포의 모든 SUN-KASH 상호 작용의 중단을 확인하는 데 사용 처리 단계를 설명합니다.

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Protocol

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윤리 문 : 동물 주제와 관련된 절차는 세인트 루이스의 워싱턴 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

1. 마우스 사육 및 유전자형

  1. (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19, 20, Tg는 생산의 Tg (CAG-LacZ를 / EGFP-KASH2)의 Tg와 마우스 (PCP2-Cre 호텔) 쥐 새끼를 낳. 주 :이 프로토콜의 나머지는 소뇌 내 조롱박 세포 EGFP-KASH2 발현을 제한의 Tg (PCP2-Cre 호텔) 마우스 라인의 사용에 초점을 맞추고 있지만, 유사한 절차가 다른 Tg는 (Cre 호텔) 마우스 수 미행 ( 도 2A).
  2. 이전 19 설명 된대로 모두 EGFP와 Cre 호텔 유전자를 품고 새끼를 식별하는 유전자형을 수행합니다.

해부 및 조직 컬렉션 재료 2. 준비

  1. -20 ℃에서 30 %의 수크로오스 PBS (PBS 1X 중 자당 30g / 100 mL) 및 점포 100 ㎖를 준비한다. 조직 (H)의 일transcardial 관류에 대한 35 ML의 주사기에 arvesting, 해동 및 자당 용액의 부하 ~ 30 ~ 35 ml의.
  2. PBS로 4 % PFA, 40 ㎖ (10 ㎖, 16 % 파라 포름 알데히드 및​​ PBS 30 ㎖)을 준비한다. transcardial 관류에 대한 35 ML의 주사기에로드 ~ 30 ~ 35 ml의 4 % PFA.
  3. 조직의 절개에 대한 PBS의 10 ㎖로 10cm 조직 배양 판을 채 웁니다.
  4. 16 ㎎ / ㎖ 케타민 3 ㎎ / ㎖ 자일 라진 구성된 케타민 / 자일 라진 칵테일을 준비합니다.
  5. 해부에 대한 70 % 에탄올 용액을 준비합니다.

3. 해부 및 조직 컬렉션

  1. 1 ML의 주사기를 사용하여, 체중 25g 당 케타민 / 자일 라진 칵테일 500 μl를 주입하고 15 분 ~ 기다립니다. 대안 적으로, 관심있는 생물학적 시스템에 적합한 다른 제도적 승인 진정 방법을 사용한다.
  2. 진정되면, 부드럽게의 등쪽면 스티로폼 트레이에 모든 발 핀, 통증 반응의 부족을 확인하기 위해 후면 발을 꼬집어마우스를 아래로 향하게.
  3. 70 % 에탄올로 복부를 스프레이하고 마음에 액세스 할 흉곽의 상단에 하복부에서 절개를합니다.
  4. 심장의 우심방의 작은 절개를 확인하고 심장의 좌심실에 30 % 자당 용액이 들어있는 주사기를 삽입합니다.
  5. ~ 2-5 ml의 당 분의 속도로 용액을 관류. 비어있는 경우, 주사기를 제거하고 4 % PFA 용액으로 반복한다.
  6. 스티로폼 트레이에서 마우스를 고정 해제 뇌에 액세스하기 위해 목을 벨.
  7. 집게와 가위를 사용하여 동물의 머리 주위 피부를 제거합니다. 바늘로 두개골의 뒤쪽 부분에 구멍을 찌를 조심스럽게 가위 해부 집게와 두개골을 제거합니다.
  8. 뇌가 명확하게 접근하면, 소뇌를 제거하고 PBS에 배치하는 집게를 사용합니다. 메스와 시상면에서 소뇌를 양분하고 4 ℃에서 하룻밤 30 % 자당 용액에 전송할 수 있습니다. 참고 : 수험하기파라핀 섹션입니다 전에 조직 매립 및 단면에 4 % PFA 4 ° C에서 하룻밤 소뇌를 해결.

4. 조직 가공 및 단면

  1. 드라이 아이스, 2- 메틸 부탄의 슬러리를 조제. 욕조의 온도가 5 분 동안 평형을 허용합니다.
  2. 10월 화합물과 cryomold를 입력하고 금형에 이분 소뇌의 절반을 배치합니다.
  3. 해부 현미경과 집게 위치의 쌍 (소뇌의 중간 선 부근) 이분 된면이 위를 향하도록 소뇌 사용.
  4. OCT의 화합물은 조직 표본 주위 백색 고체 매트릭스를 형성 할 때까지 5 분 동안 드라이 아이스 슬러리에 cryomold 옮긴다. 주의 : 필요하다면 냉동 시험편 지금 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
  5. 라벨 세르 15 μm의 단면을 수집하기 위해 제조자의 지시에 따라 조직 절편을 수집하기위한 폴리 리신 슬라이드를 처리 및 저온 장치가 미리 준비찾. 섹션을 수집하려면, 조심스럽게 슬라이드의 폴리 라이신 코팅 된면이 OCT의 섹션을 문의하십시오. 섹션의 방향을 유지하기 위해,이 단계에서 슬라이드를 회전하지 않습니다.
  6. 염색 및 이미징을 진행하기까지 -20 ° C에서 보관 조직 섹션.

5. 염색과 소뇌 섹션의 이미지

  1. 조직 염색하기 전에 다음과 같은 솔루션을 준비 :
    PBS의 ~ 50 ㎖
    ~ PBS에서 4 % PFA의 5 ~ 10 ml의
    ~ PBS에서 0.5 % 트리톤 X-100, 10 % 당나귀 혈청의 10 ~ 20 ml의
  2. 해동 소뇌 부분. 중요한 것은, EGFP의 퇴색을 방지하기 위해 지속적이고 강렬한 빛의 소스에 노출을 최소화 할 수 있습니다.
  3. 소수성 장벽 펜을 사용하여 조직 섹션 주위에 사각형을 그립니다.
  4. 5 분 동안 4 % PFA와 섹션을 포스트 - 수정. 소수성 장벽 (보통 ~ 500 μL)로 구분 전체 영역을 커버하기에 충분한 액체를 사용합니다. 진공 또는 피펫을 다시 사용정착은 조직 절편을 방해하지 않도록 특히주의하면서 이동합니다.
  5. 피펫으로 부드럽게 조직 섹션을 방해하지 않고 슬라이드에 PBS를 적용합니다. 5 분 후 조심스럽게 액체를 제거하기 위해 진공 또는 피펫을 사용합니다. PBS가 3 회 반복하여 총 린스.
  6. 피펫을 사용하여 조심스럽게 PBS에서 0.5 % 트리톤 X-100, 10 % 당나귀 혈청 (솔루션의 9​​00 μL 당 3 μL Calbindin 및 / 또는 Nesprin2 항체) 적절한 일차 항체의 희석을 적용합니다. 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
    주 : EGFP-KASH2은 동결 절편에 직접 형광 현미경으로 볼 수 있으며이 항 EGFP 항체를 이용할 필요가 없다. 파라핀 섹션이 준비되어있는 경우, EGFP-KASH2의 영상은 반 EGFP 항체와 면역을 필요로한다.
  7. 항체 용액을 제거하고 PBS로 3 회 씻어.
  8. 제조 1 : 0.5 % 트리톤 X-100-알렉사 형석 이차 항체 1,000 희석액,어둠 속에서 10 % 당나귀 PBS에서 혈청 및 저장.
  9. 조심스럽게 최종 PBS 린스를 제거하고 어둠 속에서 한 시간 동안 차 항체 희석을 적용합니다.
  10. 이차 항체 용액을 제거 씻어 절을 세 번 씻는다. 필요한 경우, 제 PBS의인가 등 DAPI (~ 300 ㎚) 등의 핵 염색을 적용한다.
  11. 완전히 조직과 조직 섹션에 미디어를 장착 장소 ~ 5-7 μL 각국에서 PBS 용액을 제거합니다. 조직 절편 위에 유리 커버 슬립을 놓고 어둠 속에서 실온에서 ~ 15-30 분간 방치.
  12. EGFP와 같이 5.8 / 5.9에서 사용 된 이차 항체에 적합한 임의의 다른 파장을 시각화하는 적절한 필터를 갖춘 형광 현미경을 사용한다. 소뇌 조각에서 EGFP-KASH2 핵 림을 보려면 20 배 목표를 사용합니다.

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Results

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이 프로토콜의 Tg (PCP2-Cre 호텔) 생쥐를 사용 소뇌 조롱박 세포 EGFP-KASH2 발현을 제한 (TG-LacZ를 CAG / EGFP-KASH2) 마우스 모델의 유용성을 도시한다. Tg가에서 (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 자손, LacZ를 / V5 오픈 리딩 프레임함으로써 특히 조롱박 세포 (그림 2A)를 대상으로 EGFP-KASH2의 발현을 유도하는 Cre 호텔 재조합 효소에 의해 P6에서 절제되어있다. 예상대로 핵 (그림 2B)의 주위에 관찰 EGFP 양성 림 같은 패턴에 의해 지시 된 바와 같이, EGFP-KASH2은 핵 봉투를 대상으로한다. 임의의 생리 학적 표현형을 극대화하기 위해서는 세포 - 특이 적 항체 마커와 공동 - 염색 KASH2 EGFP 양성 세포의 비율을 계산하여 그 EGFP-KASH2 타겟 세포의 과반수에 표현되어 있는지 확인하는 것이 중요하다. 이 예에서는 EGFP-KASH2 식 Calbindi...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

가장 중요한 단계는 성공적으로의 Tg (CAG-LacZ를 / EGFP-KASH2) 모델이 적합 Cre 호텔 마우스 라인 (들)을 식별하는 것입니다 사용하여 생체 내에서 LINC 복합체의 역할을 연구합니다. Cre 호텔 유사한 경​​로에 관여하는 다른 세포 유형에서 활성 상태 인 경우 사실, 그것은 결과의 해석을 복잡하게 할 수 있습니다. 소뇌 (도 2B)의 분자량 및 과립 세포층 여기에 도시 된 바와 같이, 따라서, 이것은, 주변 셀을 검사하는 것이 중요하다. 마찬가지로, 임의의 생리 학적으로 관련된 표현형을 최대화하는 것이 관심의 세포 유형에 걸쳐 광범위 Cre 호텔 식 Cre 호텔 균주를 파악하는 것이 중요하다. 이는 관심의 시스템의 개발시 LINC 복합체 성분의 발현 패턴의 충분히 특성화를 수행하는 것도 중요하다. 실제로, (TG-LacZ를 CAG / EGFP-KASH2) 마우스 모델의 한가지 단점은 일 Nesprins 단백질 또는 변이체는 생물학적 체계에 관여 할로 어떤 정...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 (학과 안과 및 Visual 과학)과 의학의 세인트 루이스 학교 워싱턴 대학에서 마우스 유전학 코어의 분자 유전학 코어, 형태 및 이미지 코어의 직원을 감사드립니다. 저자는 세포에 대한 맥도넬 센터 및 분자 신경 생물학, 신경 장애에 대한 희망 센터에서 작은 보조금 프로그램에 의해 지원, 국립 안과 연구소 (DH에 # R01EY022632), 국립 안과 연구소 센터 코어 그랜트 (# 1 P30EY002687) 및 연구에서 무제한 부여 안과 및 Visual 과학 부서에 실명을 방지합니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
설탕시그마 AldrichS0389
10x PBSGibco14200-075
16% 파라포름알데히드 용액전자 현미경 과학15710
OCT 화합물Tissue-Tek4583
접착 슬라이드StatLabM1000W
당나귀 혈청시그마 AldrichD9663
Triton X-100Sigma AldrichT9284
ImmuEdge PenVector LaboratoriesH-4000
Anti-Calbindin 항체Sigma AldrichC9848
Anti-EGFP 항체Abcamab13970
Anti-Nesprin2 항체이전에 설명된 Ref. 21
Fluorescent Mounting 미디어DakoS3023
2-메틸 부탄시그마 알드리치O3551

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hutchison, C. J. Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews. Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).
  2. Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions. Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).
  3. Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).
  4. Haque, F., et al. SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton. Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).
  5. Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein. The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).
  6. Starr, D. A. KASH and SUN proteins. Current biology : CB. 21, R414-R415 (2011).
  7. Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton. Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).
  8. Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei. The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).
  9. Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration. Development. 136, 2725-2733 (2009).
  10. Padmakumar, V. C., et al. Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton. Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).
  11. Roux, K. J., et al. Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).
  12. Wilhelmsen, K., et al. a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin. The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).
  13. Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells. Development. 142, 218-228 (2015).
  14. Yu, J., et al. KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development. Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).
  15. Zhang, X., et al. Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation. Development. 134, 901-908 (2007).
  16. Zhang, J., et al. Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage. Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).
  17. Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness. Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).
  18. Zhang, X., et al. SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice. Neuron. 64, 173-187 (2009).
  19. Razafsky, D., Hodzic, D. Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo. Genesis. 52, 359-365 (2014).
  20. Razafsky, D., Hodzic, D. A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I. Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).
  21. Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina. PloS one. 7, e47180(2012).
  22. Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis. Nucleus. 4, 399-409 (2013).

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