하는 세포 칼슘의 형광 및 생물 발광 영상<sup&gt; 2 +</sup&gt; 노인 해마 신경 세포에서

요약

노화 시 세포 내 Ca²⁺ 리모델링은 흥분 독성 및 뉴런 손상에 기여할 수 있으며, 이는 Ca²⁺ 과부하에 의해 매개되는 과정입니다. 우리는 신경 노화 모델인 쥐 해마 뉴런의 장기 배양에서 세포질 및 미토콘드리아 Ca²⁺의 형광 및 생물 발광 이미징을 사용하여 노화 뇌의 Ca²⁺ 리모델링을 조사하는 것을 목표로 했습니다.

초록

신경 변성과 허혈에 관련된 신경 세포 사멸에 대한 감수성이 대단히 세 뇌에서 증가하지만 책임 메커니즘이 심하게 알려져있다. 흥분 독성 (excitotoxicity), 두 모욕에 의해 유도 된 신경 세포 손상에 기여하는 것으로 과정은 ^칼슘 유입 및 미토콘드리아의 ^칼슘 과부하를 촉진 글루타메이트 수용체의 활성화에 의해 매개된다. 세포 내 ^칼슘 항상성의 세포 내 ^칼슘 항상성 또는 리모델링에 상당한 변화가 된 신경 세포에서 신경 세포의 손상을 선호 할 수 있습니다. 노화에 ^칼슘 리모델링을 조사를 위해 우리는 생체 내에서 뉴런 세 일부 측면에서 유사한 쥐의 해마 신경 세포의 장기 문화에서 라이브 세포 이미징을 사용했다. 이를 위해, 해마 세포는 처음에 갓 새로 태어난 쥐의 해마에서 분산 POLI-D 라이신 코팅, 커버 글라스에 도금입니다. 그런 문화는 며칠 동안 제어 매체에 보관 또는 W 몇 가지있다각각, 젊은이와 노인 신경 세포를 조사하기위한 eeks. 둘째, 배양 된 신경 fura2 로케이션 디지털 형광 비 이미징을 사용하여 세포질 ^칼슘 농도의 측정을 실시한다. 셋째, 배양 된 신경 세포는 미토콘드리아를 대상으로 낮은 선호도 쿼린 및 GFP의 탠덤을 표현하는 플라스미드로 형질된다. 24 시간 후, 균체 내에 쿼린은 코 엘렌 테라으로 재구성되고 뉴런은 미토콘드리아의 ^칼슘 이온 농도를 모니터링 생물 발광 촬상을 실시한다. 이 세 단계의 절차는 예를 들어, 글루타메이트 수용체 효능 NMDA 및 이들과 다른 응답이 노화에 의해 영향을 받고 있는지 여부를 비교 관련성 자극 세포질과 미토콘드리아 ^칼슘 응답의 모니터링을 허용한다. 이 절차는 어떻게 영향 세포질과 미토콘드리아 ^칼슘 선택 자극에 대한 반응뿐만 아니라, 신경 세포를 방지하기위한 선택 약물의 테스트를 노화에 관한 새로운 통찰력을 얻을 수있다노화 관련 질환 사망.

서론

흥분 독성은 허혈과 같은 신경 욕설에서 신경 손상과 세포 사멸에 관여하는 가장 중요한 메커니즘 중 하나이며, 알츠하이머 병 ^(1)과 같은 몇 가지 신경 퇴행성 질환이다. 신경 독성의이 유형은 주로 칼슘 글루타메이트 작용에 의해 매개된다 ²⁺ -permeable, 이온 성 NMDA 수용체 (NMDAR) ^2. 글루타메이트에 배양 된 신경 세포의 노출은 신경 세포 사멸 ^4가 발생 흥분 독성 (excitotoxicity) ^3로 이어질 수 있습니다. 우리와 다른 사람은 이전에 NMDA에 의한 세포 사멸에 신경 취약점이 체외에서 개발 및 ^{5-8 노화로} 변경 될 수 있다고보고있다.

널리 세포질 무 ^칼슘 농도 ^([칼슘] _CYT)의 증가는 세포의 활성화에 이르게하는 것이 허용된다. 이 너무 높게 상승 및 / 또는 충분히 지속 된 경우에는, 그 세포 ^사멸을 유발할 수 ^9. 또한,이 제안되어있다그 흥분 독성 (excitotoxicity)는 미토콘드리아의 ^칼슘 흡수 ^(10), 글루타메이트에 의....

프로토콜

윤리 문 : 동물 과목을 포함하는 절차는 유럽 협약 (123) / 유럽 의회 및 지침 6백9분의 86 / EEC와 일치 발라 돌 리드 대학 동물 주택 시설에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 처리되고있다.

쥐 해마 신경 세포의 1. 단기 및 장기 문화

1. 폴리 D 라이신의 제조, 12mm 커버 글라스 코팅.
   1. 최소 24 시간 동안 에탄올에 12mm 직경 커버 글라스를 소독. 그들이 멸균 조건에서 건조하도록 허용합니다.
   2. 페트리 접시에 파라 필름의 스트립에 커버 슬립을 배포합니다. 1 ㎎ / ㎖ 폴리 D 라이신 200㎕의 각 커버 슬립의 표면을 커버. O / N 치료를 허용합니다.
   3. 다음 날은 멸균 조건에서 90 분 동안 두 번 증류수 멸균 수로 매 15 분을 커버 슬립을 씻는다.
   4. 로 Neurobasal 문화 매체의 500 μL와 네 잘 multidish 판을 채우기 당 잘. 로 Neurobasal 문화 매체는 보충해야한다10 % 소 태아 혈청, 2 % B27, 1 μg의 / ㎖ 젠타 마이신 및 2 mM L- 글루타민.
   5. multidish 판에 커버 슬립을 놓습니다. 사용할 때까지 가습 37 ºC 5 % CO ₂ 배양기에서 그들을 유지합니다.
   <....

결과

여기에 우리가 ^칼슘 리모델링 및 세포질과 미토콘드리아에 NMDA의 효과를 평가하기 위해 간단한 방법을 설명 [칼슘 ^{2 +]} 세 뉴런. 그림 1은 분리 및 신생아 쥐에서 해마 신경 세포를 배양하기위한 절차의 회로도를 보여줍니다. 시작하기 전에, 우리는 살균, 폴리 D 라이신 코팅, 커버 글라스를 준비하고 4 잘 접시에 그들을 찾을 필요가있다. 그런 다음, 신생아 쥐 사망하고 뇌가 제거됩니다. 해마를 분리 한 후, 조직을 조심스럽게 파파인을 이용한 분산된다. 분리 된 세포 세척 및 코팅 된 커버에 도금되어있다. 그런 다음 세포는 2-5 DIV 또는 각각 젊은이나 노인 문화를 얻을 수> 15 DIV 배양 및 ^칼슘 이미징 실험에 사용됩니다.

상기 전략을 사용하여, 테스트 할 같은 시료에서 노소 뉴런을 가질 수있다, 예를 들면, NMDA는 ^[칼슘] 젊은 cultu의 세포질.......

토론

노화 뇌 세포 내 칼슘의 리모델링 ^{2 +} 항상성이인지 적 손실과 관련되어, 허혈성 손상, 흥분 독성 및 신경 퇴행에 대한 감수성을 증가했다. 체외에서이 가설을 조사하기 위해, ^칼슘 이미징 절차를 사용할 수 있습니다. 불행하게도, 이전 해마 신경 세포의 생존 문화는 신뢰할 수 없습니다. 최근에는 관찰되었음을 래트 해마 뉴런 ROS의 축적, 리포 푸신 과립, 염색질 초점의 형성, 활성화 pJNK 및 p53과 / P21 경로, 콜레스테롤 감소를 포함한, 생체 내에서 노화의 전형적인 특징의 본 많은, 그리고 장기 배양 ^칼슘 채널의 밀도를 변화시키고 ¹⁴ NMDA ^수용체. 따라서, 쥐의 해마 신경 세포의 젊은이와 노인 문화 ^칼슘 이미징 실험은 노화 뇌의 ^칼슘 리모델링의 새로운 통찰력을 제공 할 수있다. 배양 hippoca위한 중요 조건장기적 mpal 뉴런 두 배이다. .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Neurobasal Culture Medium	Gibco	21103-049
HBSS medium	Gibco	14170-088
Ham's F-12 medium	Gibco	31330-038
DNase I (소 췌장에서)	Sigma	D5025-15KU
태아 Bobine Serum	Lonza	DE14-801E
B27	Gibco	17504-044
Gentamicin	Gibco	15750
L-글루타민	Gibco	25030-032
12mm 유리 커버 슬립	Labolan	0111520/20012
Papain	Worthington	LS003127
4-well multidish plaques	Nunc	176740
Petry dish	JD Catalan s.l.	2120044T
멸균 피펫	Fisher Scientific	431030
Fura2-AM	Life Technologies	F1201
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-027
Coelenterazine n	Biotium	BT-10115-2250 uG
Digitonin	Sigma	D5628
NMDA	Sigma	M3262
글리신	시그마	50046
자이스 액시오베르트 S100 TV 현미경	칼 자이스 Inc.
Xcite 발광 시스템	EXFO
ORCA ER 형광 카메라	Hamamatsu
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