이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

감염증에 대한 모델로 Organoids : 헬리코박터 파이로리의 인간의 문화와 쥐 위장 Organoids 및 미세 주입

34.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53359

⸱

2015년 11월 12일

 , 
1Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, University Medical Centre Utrecht

이 논문에서

요약

줄기세포 유래 배양은 감염병을 모델링할 수 있는 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 여기에서는 성체 줄기 세포에서 유래한 마우스 및 인간 위 오가노이드의 배양에 대해 설명합니다. 오가노이드에는 위 병원균인 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)가 미세주입됩니다.

초록

최근 감염 생물학자들은 숙주와 병원체의 상호작용을 연구하기 위한 새롭고 더 나은 모델의 필요성에 부응하기 위해 줄기세포 유래 배양을 채택했습니다. 배아 줄기 세포(ESC), 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 또는 성체 줄기 세포의 세 가지 세포 공급원이 사용되었습니다. 여기에서는 성체 줄기 세포에서 유래한 마우스 및 인간 위 오가노이드의 배양을 설명하고 위 병원균인 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)에 감염시키는 데 사용합니다. 인간의 위샘은 절제 물질에서 분리되어 기저 매트릭스에 파종되고 성장 인자 표피 성장 인자(EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 10, 가스트린 및 형질전환 성장 인자(TGF) 베타 억제제를 포함하는 배지에 내장되어 있습니다. 이러한 조건에서 위샘은 위의 4가지 계통을 포함하는 3차원 오가노이드로 성장합니다. 오가노이드는 무한정 팽창하며 세포주와 유사하게 동결 및 해동할 수 있습니다. 감염 연구를 위해 박테리아는 오가노이드의 내강에 미세 주입됩니다. 감염된 오가노이드는 이미징을 위해 처리됩니다. 설명된 방법은 다른 오가노이드 및 다른 박테리아, 바이러스 또는 기생충 감염에 적용할 수 있습니다. 이를 통해 일차 세포의 감염 유발 변화를 연구할 수 있습니다.

서론

병원균의 연구는 생체 내 감염을 모방하기 위해 적절한 모델 시스템에 의존합니다. 사용 된 시스템의 일부는 최적의에서 멀리있는 동안 일부 감염 에이전트의 경우, 적절한 모델 시스템은 부족하다. 일례 인과 위암 개발에 관한 것이다 위암 헬리코박터 파이로리 (H. 파이로리)이다. 또 다른 더욱 적합한 세포 배양 시스템의 부재하에, 목표 많은 연구 암 캐스케이드의 끝점을 나타내는 암 개발 사용 암 세포주를 기본 분자 메커니즘을 분석한다. 차, 비 형질 전환 세포는 이러한 연구를위한 더 나은 모델이 될 것입니다. 그러나, 일차 전지는 기증자의 작은 숫자 만 사용할 수 있으며, 오랜 기간 동안 배양 할 수 없습니다. 최근 몇 년 동안, 줄기 세포 연구는 감염 생물학의 연구를위한 기본 세포 배양을위한 새로운 소스를 제공하기 위해 상당한 진전을 이루었습니다.

에서 문화세 줄기 세포 공급원이 사용되었다 : 배아 줄기 세포 (ESC), 유도 된 다 능성 줄기 세포 (IPSC) 또는 성체 줄기 세포. 그들은 이러한 거대 세포 바이러스 1, 2 또는 C 형 간염 바이러스와 같은 바이러스에 감염을 모델로 사용되어왔다 3-7, 예컨대 Bacterioides thetaiotaomicron 10 살모넬라 엔테 (11) 말라리아 원충 8 톡소 포자충 (9), 박테리아 등의 기생충. 최근, 여러 가지 접근 방법은 H. 감염을 모델로 발표되었다 15 - ESC 또는 유도 만능 줄기 세포 (12), 마우스 성체 줄기 세포 (21, 22) 인간 성체 줄기 세포 (13)에서 파생 된 organoids와 파이로리.

성체 줄기 세포로부터 organoid 문화의 발달은 뮤린 장내 상피 세포로부터 분리 된 단일 줄기 세포는 3 차원 행렬로 시딩하는 연구로부터 유래뼈 형태 형성 단백질 (BMP) 16 시그널링을 억제 Wnt 신호 및 머리를 향상 미토 겐, R-spondin로 EGF를 포함하는 장 줄기 세포의 환경을 모방 매체에 매립. 특히 이러한 문화는 중간 엽 세포와 공동 배양이 필요하지 않습니다. 이러한 조건에서, 줄기 세포는 증식 도메인 장내 소낭 세포를 형질으로 작은 구조를 형성하고, 장내 융모의 세포를 포함하는 도메인. organoids 따라서 생체 내 상황을 모방하기 위해 자체 구성 할 수 있습니다. 오늘날, 많은 쥐와 인간 조직에서 성체 줄기 세포는 시험관 및 성장 될 수있는 소장과 대장 17 위 13,18, 간, 19, 20로 자신의 생체 대응을 닮은 organoids에 자기 조직, 췌장 (21) 전립선 (22).

여기에서 우리는 성체 줄기 CEL에서 문화 마우스 또는 인간의 위 organoids에 비디오 프로토콜을 제공LS는 H. 그들을 microinject과 파이로리. 이 프로토콜은 이전 보고서 13,18 기반으로합니다. 이 방법은 배양과 같은 장내 organoids 다른 organoid 배양 감염에 대해 적응 될 수있다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

위 Organoid 문화 (1) 설립

주 :이 프로토콜은 마우스 또는 인간 조직으로부터 위산 분비의 분리를 위해 사용될 수있다. 그것은 약 1 cm² 이상의 조직을 사용하는 것이 좋습니다. 인체 조직은 위 절제 또는 생검으로부터 얻을 수있다.

  1. 물질의 제조
    주 : 사용 지하 매트 리겔 매트릭스이다. 항상 얼음에 지하 행렬을 유지합니다. -20 ° C에서 지하 행렬을 저장하고 사용하기 전에 얼음에 해동. 기본 배지는 HEPES가 보충 된 고급 DMEM / F12를 말한다; 이러한 루타 및 1X Primocin 적절한 항생제로 적절한 글루타민 소스. 사용되는 배양기는 표준 세포 배양 인큐베이터 (37 ℃, 가습 공기, 5 % CO 2)
    1. 날카로운 집게, 가위, 메스와 유리 현미경 슬라이드 : 고온 가압 멸균 또는 100 %를 이소 프로필 알코올을 사용하여 준비기구를 소독.
    2. 격리 전날, 24 아를 배치인큐베이터에서 L 세포 배양 접시입니다.
    3. 제조업체의 권장 사항에 따라 지하 행렬을 준비합니다. 반복되는 동결 해동 사이클을 방지하기 위해 1 ml를 분취 량을 준비합니다.
    4. 얼음에 버퍼와 멋진 킬레이트 500 mL로 준비합니다. HPO 4, 8.0 mM의 KH 2 PO 4, 96.2 mM의 NaCl을, 1.6 밀리미터의 KCl 5.6 밀리미터 나 2와 멸균 증류수에서 1X 버퍼를 준비, 43.4 MM의 자당, 54.9 mM의 D- 소르비톨, 0.5 mM의 DL-디티 오 트레이 톨 (주의), pH를 7. 여러 아이솔레이션을 계획하는 경우, DL-디티 오 트레이 톨없이 5 배 농축 용액을 제조. 살균 필터 버퍼. 분리하기 전에 배에서 바로 분리하기 전에 DL-디티 오 트레이 톨을 추가 멸균 물을 5 배 버퍼를 희석.
    5. 준비 및 제조사의 권장 사항에 따라 모든 성장 인자를 희석. 작은 크기의 분취 량을 사용하여 동결 - 해동 사이클을 피한다. 기능적 성장 인자는 결과 중요하다.
    6. 쿨 기초 얼음 매체와 4 원심 분리기를 냉각6; C.
    7. 37 ° C에 기초 배지의 또 다른 나누어지는을 따뜻하게.
  2. 땀샘의 분리
    1. 차가운 얼음 기초 배지에 조직의 약 1 cm² 이상을 수집합니다. 준비까지 얼음에 보관하십시오. 그것은 가능한 한 빨리 조직을 처리하는 것이 바람직하지만, 얼음 매체에 저장 조직 필요한 경우.
    2. 10cm 페트리 접시에 조직을두고 차가운 1X의 킬 버퍼로 커버. 부드럽게 앞뒤로 이동하여 씻으십시오.
    3. 마른 10cm 페트리 접시에 조직을 배치합니다. 집게를 사용하여 조심스럽게 실체 현미경 점액뿐만 아니라 근육 층을 제거한다. 부드럽게 앞뒤로 이동하여 차가운 1X 킬레이트 버퍼에 조직을 씻으십시오.
    4. 새로운 건조한 10cm 페트리 접시에 1cm 2 조직을 놓습니다. 사용 가위는 약 2-5 mm² 인 크기의 20 ~ 50 작은 조각으로 잘라.
    5. 집게를 사용하여, 50 ㎖ 튜브에 모든 조각을 놓습니다.
    6. 멸균 10 ML의 플라스틱 피펫을 가져 가라. 1X 킬레이트 버퍼의 피펫을 젖은. 유지절차 전반에 걸쳐이 같은 피펫을 사용하여.
    7. 50 ML 튜브에 10 ml의에게 차가운 1X 킬레이트 버퍼를 추가합니다. 격렬하게 위아래로 10 회 피펫 팅하여 조각을 씻으십시오. 조각이 정착하자. 상층 액을 제거합니다.
    8. 뜨는 때까지 반복 세척 (단계 1.2.7)은 분명하다. 이것은 인체 조직의 1 cm² 이상 대략 50 ~ 100 ml의 1 배 킬레이트 버퍼의 걸립니다.
    9. 부드러운 매 2 분을 반전하여 실온에서 10 분 동안 10mM의 EDTA가 보충 된 20 ㎖ 1X 킬레이트 버퍼 조직편을 배양한다.
      주 :이 인큐베이션 시간 및 온도는 속도 및 / 또는 선의 구조의 보존 중 위해 최적화 될 수있다. 그들은 200 RPM과 통에서 37 ℃에서 5 분에 롤링 플랫폼에서 4 ° C에서 몇 시간 배양에 이르기까지 다양 할 수 있습니다. 마우스 위를위한 좋은 출발점은 구름 플랫폼에서 4 ° C에서 인간의 위장 30 분, 실온에서 10 분입니다.
    10. 피펫 한 번 부드럽게하고 10 ml의 피펫을 사용하여 아래로. 파이 허용eces 정착한다. 상층 액을 버린다.
    11. 피펫을 사용하여, 깨끗한 10cm 페트리 접시에 조각을 전송합니다. 액체를 제거합니다.
    12. 조직 조각의 상단에 유리 현미경 슬라이드를 놓습니다. 10 배의 배율 세포 배양을위한 반전 현미경 손상 조직을 관찰한다.
    13. 유리 슬라이드와 페트리 접시에 압력을 적용합니다. 모두 (멸균 장갑) 손과 엄지 손가락으로 유리를 눌러를 잡습니다. 조직의 가장자리는 땀샘이 조직에서 출시되는 것을 나타내는 흐린 나타납니다.
    14. 10 배의 배율 세포 배양을위한 반전 현미경 발표 분비를 관찰한다.
    15. 30 ml의 차가운 기초 매체에 땀샘과 조직을 수집합니다. 큰 조직 파편이 정착하자.
    16. 이 15 ml의 튜브에 땀샘이 포함 된 상층 액을 수집합니다.
    17. 200 XG, 4 ° C에서 원심 분리기 5 분. 폐기 뜨는. 펠렛은 고립 된 땀샘이 포함되어 있습니다. 얼음에 보관하십시오.
  3. 땀샘의 시드
    1. 시드를 들어, 지하 행렬은 얼음처럼 차가운 항상 유지, 그래서 액체를 유지됩니다.
    2. (1) 대안 : 씨 희석 행의 6 우물.
      1. 지하 행렬의 60 μL에 펠렛을 일시 중단합니다.
      2. 지하 행렬의 각 포함 50 μL와 얼음에 5 멸균 1.5 ml의 튜브를 준비합니다. 전송 최초의 1.5 ML 튜브에 땀샘 / 지하 매트릭스 현탁액의 10 μL. 땀샘을 일시 중단하고, 다음 1.5 ML 튜브에이 용액 10 μl를 전송합니다. 다음 튜브에 대해 반복합니다.
    3. 방법 2 : 잘 당 땀샘의 계산 된 금액을 시드. 24 웰 플레이트 잘 하나에 50 μL 지하 매트릭스 100 땀샘 시작합니다.
      1. 조심스럽게 10 ml의 기초 배지에서 펠렛 분비를 일시 중지합니다. 깨끗한 10 ml의 배양 접시에 50 μl를 놓습니다. 10 배의 배율 세포 배양을위한 반전 현미경으로 땀샘의 수를 계산합니다.
      2. 용액의 분비 농도를 계산한다. 볼륨을 그 접점 이동인 새로운 15 ML 튜브에 400 땀샘.
      3. 200 XG, 4 ° C에서 원심 분리기 5 분. 뜨는을 취소하고 얼음에 튜브를 유지. 200 μL 지하 행렬을 추가하고 조심스럽게 재현 탁. 얼음에 보관하십시오.
    4. 37 ° C 따뜻한 24 웰 플레이트를 타고 인큐베이터에서 (단계 1.1.2 참조). 잘의 중심에 지하 매트릭스 50 μL 땀샘의 한 방울을 놓습니다. 드롭 돔을 형성 할 것이다.
    5. 주의 깊게 다시 세포 배양 용 인큐베이터에 플레이트를 옮긴다. 지하 행렬은 10 분을 공고히하자.
    6. 모든 성장 인자와 따뜻한 매체를 준비합니다.
      1. 인간의 분비를 들어 인간 위 organoids에 대한 다음과 같은 성장 인자에 기초 배지를 보충 : 50 NG / ㎖ EGF, 10 %의 머리 에어컨 매체, 10 % R-spondin1 에어컨 매체, 50 %의 Wnt 에어컨 매체, 200 NG / ml의 섬유 아세포 성장 인자 (FGF) 10, 1 나노 가스트린 및 2 μM TGFbeta 억제제 및 10 μM RHO 회합을 형성 꼬인 코일 단백질 세린 / 트레오닌 키나제 억제제 (RHOKi).
      2. 뮤린 땀샘 : 마우스 위 organoids 대해 다음 성장 인자와 함께 기초 배지 보충 : 50 NG / ㎖ EGF, 10 % 머리 - 조정 배지 매체 R-spondin1가 에어컨 10 %, 50 %의 Wnt-조정 배지 100 NG / ml의 FGF10, 10 나노 가스트린, 0.5 mM의 TGFbeta 억제제 및 10 μm의 RHOKi.
    7. 인큐베이터에서 접시를 가져 가라. 조심스럽게 잘 지하 행렬을 방해하지 않고 각각의 모든 성장 인자 (1.3.6) 500 μL 매체를 추가 할 수 있습니다. 인큐베이터에 배치합니다.
    8. 주당 매체 3 회 (2-3 일마다)을 새로 고칩니다. 매체를 새로 고침은 그대로 지하 행렬의 드롭을 떠나와 기존의 매체를 제거합니다. 조심스럽게 모든 성장 인자 신선한, 따뜻한 매체를 추가합니다. RHOKi를 추가하지 마십시오. 만 직접 땀샘의 파종 후 또는 organoids (2 단계)의 분할 후 RHOKi를 추가합니다.

미세 주입하기 전에 위 Organoid 문화 2. 통과.

"ove_content> 참고 : organoid 문화의 모든 유형은 자신의 배로 시간이 마우스를 장뿐만 아니라 위 문화가 보통 분할로 1 :. (5) 모든 5~7일 인간의 장 문화가 1 분할 :.. 5 매 10~12일을 인간 위 문화는 1 분할 : 5 14 일마다 하나의 세포에서 시작하는 경우, 인간의 위 organoids도 제대로 형성 20 일이 소요될 수 있습니다 그것은 신진 구조는 중앙 루멘을 둘러싸고 경우이 프로토콜에서, organoids가에 분할 좋은 징조입니다... organoids의 마이크로 인젝션. 유지 보수 4 웰 플레이트는 동일한 프로토콜을 따른다 있지만, 그러한 표준 24 웰 세포 배양 플레이트와 같은 임의의 다른 세포 배양 접시를 사용할 수있다.

  1. 물질의 제조
    1. 오토 클레이브 파스퇴르 피펫.
    2. 날이 통과하기 전에, 37 ° C에서 인큐베이터에서 4 웰 세포 배양 플레이트를 놓습니다. 4 잘 접시 낮은 가장자리가와 미세 조작을 할 수 있습니다.
    3. 제조업체의 권장 사항에 따라 지하 행렬을 준비합니다. passagi의 날NG, 얼음에 지하 행렬을 해동.
    4. 준비 및 제조사의 권장 사항에 따라 모든 성장 인자를 희석.
    5. 쿨 기초 얼음에 중간은 4 ° C에서 원심 분리기를 냉각.
  2. Organoid 문화의 통로
    1. 인큐베이터에서 organoids으로 판을 가져 가라. 한 우물에서 매체를 제거합니다.
    2. 잘 지하 행렬에 차가운 기저 매체의 1 ML을 추가합니다. 1 ML의 마이크로 피펫을 사용하여, 적극적으로 피펫과 지하 행렬이 깨진 될 때까지 아래로. 15 ML 튜브로 전송합니다. 얼음에 놓습니다.
    3. 유리 파스퇴르 피펫과 분젠 버너 등 화재 소스를 가져 가라.
      1. 팁의 개구가 0.5 mm (그림 1) 1.5 mm에서 축소 될 때까지 불에 피펫의 끝을 잡고. 실온으로 냉각 피펫을 보자.
      2. 기초 배지에서 피펫을 젖은. 최적 축소 피펫 않은 좁혀 피펫에 비해 눈에 띄게 느린 매체를 취할 것입니다,하지만 여전히 모든아야 잘 피펫 팅.
    4. 피펫에 organoids을 가지고 적극적으로 위아래로 10 배를 피펫. organoids의 파괴는 눈으로 관찰 할 수있다.
    5. 200 XG에서 5 분, 4 ℃로 차가운 기초 배지 및 원심 분리기의 9 ML을 추가합니다.
    6. 조심스럽게 모든 상층 액을 버린다. 250 μL 지하 행렬의 펠렛을 일시 중단합니다. 얼음에 보관하십시오.
    7. 37 ° C 따뜻한 4 웰 배양 판을 가지고도 각 50 μL의 organoids / 지하 행렬의 드롭 놓습니다.
    8. 조심스럽게 다시 인큐베이터에 접시를 전송합니다. 지하 행렬은 10 분 동안 37 ℃에서 고화하자.
    9. 단계 1.3.6에 나와있는 마우스 또는 사람 중 하나 organoids에 적합한 매체를 준비합니다.
    10. 인큐베이터에서 접시를 타고 500 μL 매체와 각 지하 매트릭스 드롭 오버레이.
    11. 인큐베이터에 접시를 전송합니다.
    12. 2-3 일마다 매체를 주 3 회 새로 고침 (1.3.8를 참조하십시오.).
    13. organoids의 동결, mechan 들어이 프로토콜에서 분할에 기재 한 바와 같이 ically organoids을 방해 (단계 2.2.1-2.2.5.). 매체를 동결 500ml의에서 organoid 조각을 일시 중단 및 C 사용 cryotubes 및 냉동 컨테이너 -80 ° 얼어. 장기간 저장을 위해 액체 질소에 튜브를 전송.
    14. 단계 1.1.2, 1.1.3., 1.1.5., 1.1.6., 1.1.7에 설명 된대로 organoids의 해동을 위해, 문화 플레이트, 지하 매트릭스, 성장 인자, 추위와 따뜻한 매체를 준비합니다. 즉시 10 ㎖ 차가운 기본 배지와 15 ㎖의 튜브에 해동 후 냉동 수욕을 사용하여 바이알 및 전송 세포를 가온. 2.2.12에 2.2.5에 설명 된대로 원심 분리기 세포를 플레이트.
      참고 : organoids의 미세 주입이 힘든이지만, 독특한 가능성이 3D로 상호 작용을 연구 할 수 있습니다.
    15. 3D 과정이 필요하지 않은 경우, 이차원 organoids 시드. 단계 2.2.6에 2.2.1에 배치로이를 위해 organoids을 방해. 지하 엄마의 250 μL에 모든 성장 인자와 2,250 μL 차가운 매체 추가organoid 파편 TRIX.
      1. 물론 당 500 μL와 24 웰 플레이트의 5 우물에 씨. 방해받지 판의 맨 아래에있는 지하 행렬을 유지하기 위해주의 깊게 만 상위 400 μl를 교체하는 중간 3 회를 변경합니다.
        참고 : Organoids는 세포 배양 접시에 부착 및 2D로 확장됩니다. 전자 현미경은 세포의 선단 측이 잘 매체 대향 것을 보여 주었다 (데이터는 미도시).
      2. 감염 전에 박테리아가 세포에 부착 할 수 있도록, 지하 매트릭스를 포함한 모든 매체를 교환한다. 유사한 프로토콜은 또한 H. 감염에 대해 기재 한 내용 파이로리 (14). 2D 셀 층은하지 3D organoids에 존재하는 모든 종류의 세포를 함유 할 수있다.

Organoid 문화 3. 미세 주입.

주 :이 프로토콜은 organoids 내로 박테리아 microinject하는데 사용될 수있다. 그것은 organoids에 주입을 시작하는 것이 도움이 될 수 있습니다미세 주입에 더 허용됩니다. 예를 들어, 마우스 위 organoids는 대상이 용이 매우 큰 낭성 organoids로 성장할 수 있습니다.

  1. 물질의 제조
    1. 제조업체의 권고에 따라, 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 두 개의 주사 바늘에 유리 모세관을 당겨. 마이크로 피펫 풀러는 중간에 유리 모세관을 가열하고 이에 두 유리 바늘을 생성, 두 부분으로 모세관을 끌어. 그것은 여러 바늘을 당겨 깨끗한 페트리 접시에 보관하는 실용적이다.
    2. , 세균 감염을 허용 최소 3 매체의 변화 (= 일주)에 대한 모든 매체에서 항생제를 제거하십시오. 이 지하 매트릭스에서 항생제를 희석합니다. 특정 항생제에 내성 균주를 사용하는 경우, 오염 가능성을 최소화하기 위해이 특정 항생제를 추가합니다.
    3. microinjections에 대한 작업 벤치를 준비합니다. 다른 바이오 안전성 수준의 작업을 위해 그것은 스테레오를 배치 할 필요가있다멸균 벤치 내부 현미경. 이 프로토콜에서는, H.를 주입 2 조건 멸균 벤치 내부 실체 현미경 하에서 바이오 안전성 수준에서 파이로리.
    4. 배양 13, 23 표준 프로토콜에 따른 박테리아.
    5. 박테리아의 수와 organoid 당 세포의 수 아래 설명과 같이 감염 (MOI)의 다양성을 평가하기 위해, 두 개의 매개 변수를 추정한다. MOI는 호스트 IL-8 mRNA 발현 (13) 예를 들어, 결과와 상관 관계가있다.
      1. 감염 용액에서 박테리아의 밀도를 계산하기 위해, 제 24 표준 프로토콜에 따른 광학 밀도 및 콜로니 형성 단위의 표준 곡선 (CFU)을 확립한다. 550 nm에서의 0.1의 광학 밀도는 대략 107 CFU / ㎖를 수득한다.
      2. organoid 당 세포의 수를 추정하기 위해,도 1에 organoids의 개수를 카운트. 단계에 설명 된대로 organoids을 방해 2.2.1-2.2.4. 원심 5 분 200 XG에 후 4 ° C,효소 분해 용액을 Resuspend 1 ㎖를 추가합니다.
        1. 반복 5 ~ 10 분 동안 진탕 37 ° C에서 품어. 세포가 (10 배 배율에서 같은 라이카 DMIL으로 거꾸로 현미경) 현미경으로 단일 세포로 해리 여부를 결정합니다. 필요하면 배양을 연장.
        2. 혈구를 사용 organoid 당 세포를 세어 organoid 당 세포의 수를 계산한다. 약 200 μm의 직경 인간의 위 organoids은 약 4,000 세포를 가지고있다. (50)의 대략의 MOI로 ml의 결과 당 1 × 109 박테리아와 세균 용액 0.2 μL를 주입.
  2. Organoids 사출.
    주 : 마이크로 인젝션 들어 유리 바늘 미세 조작기에 의해 3 차원 적으로 조작 될 수있는 홀더에 안정화된다. Organoids는 잘 내 지하 매트릭스 내에 남아 있습니다. 때문에 잘 크기 및 위치에, 모든 organoids 동등하다주입 menable. 일반적으로, 하나의 웰 (30)은 큰 organoids 5 분에 타겟팅 할 수있다.
    1. 수확 박테리아와 표준 프로토콜 (24)에 따른 기저 매체에 씻어.
    2. 광학 농도에 따른 당 ㎖의 박테리아의 수를 계산한다 (단계 3.1.5.1 참조). 기본 배지에서 ㎖의 당 1 × 109 박테리아 박테리아 희석.
    3. 유리 바늘을 가져 가라. 오프닝은 약 10 μm의 폭 될 수 있도록 사용 집게는 팁을 휴식.
    4. 주입 홀더에 바늘을 삽입하고는 미세 조작기에 고정합니다.
    5. 바늘로 약 10 μL 세균 솔루션을 차지합니다.
    6. 실체 현미경 하에서 organoid 문화를 포함하는 낮은 가장자리 4 웰 플레이트를 놓습니다.
    7. 미세 조작기로 탐색, 바늘 하나 organoids을 대상으로. organoid에 가까운 바늘을 배치하고 하나의 빠른 움직임에 organoid에 바늘을 삽입합니다. approximatel를 주입Y로 각각 0.2 μL 균액은 마이크로 인젝터를 사용 organoid.
  3. 모든 분석을위한 수확 Organoids.
    1. 예를 들어, 4 시간 후 organoids를 해결. 상층 액을 제거하고 1 ml의 2 % 포름 알데히드를 추가하고 4 ℃에서 RT 또는 O / N에서 20 분을 품어. Organoids 표준 절차 (25)에 따른 면역 조직 화학을 위해 처리 될 수있다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

이 프로토콜은 위 글 랜드 (그림 2)의 분리를 할 수 있습니다. 땀샘은 organoids에 분비가 증가 수 있도록 라미닌과 콜라겐이 풍부한 3 차원 프레임 워크 (그림 3)를 제공, 잘 내에서 드롭으로 굳어 지하 행렬에 씨앗을 품고있다. Organoids는 일반적으로 작은 낭종을 시작 12-16 일 이내에, 그들은 50-300 μm의 (그림 4)의 직경 분야로 확장합니다. 일부 organoids는 일부 작은 buddings을 개발, 낭성 유지됩니다. 후자는 일반적으로 건강한 성장 문화의 상징이다. 이 프로토콜에서 24 웰 플레이트 잘 하나 100 땀샘, 지하 행렬의 50 μL와 매체의 500 μL에 사용됩니다. 그러나,이 업 또는 다운 스케일링 할 수 있습니다.

흐린, 박테리아 용액 organoid (도 5)로 채워 마이크로 인젝션의 성공 용이 실체 현미...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

이 프로토콜은 감염 생물학을 위해 성체 줄기 세포에서 끊임없이 확장되고 형질전환되지 않은 1차 오가노이드의 사용을 설명합니다. 중요한 단계는 i) 생존 가능한 땀샘의 분리, ii) 오가노이드의 확장 및 iii) 미세 주입입니다. 다음은 수정, 문제 해결 및 기술적 고려 사항에 대한 몇 가지 제안 사항입니다.

땀샘을 방출하기 위해 격렬한 흔들림이나 피펫팅을 사용하고 똑같이 성공할 수 있는 다른 분리 방법과 비교할 때, 여기에 제시된 기술은 조직에서 땀샘의 방출을 현미경으로 직접 관찰할 수 있다는 장점이 있습니다(단계 1.2.14.). 땀샘이 방출되지 않으면 EDTA에서의 배양을 다양하게 할 수 있습니다(단계 1.2.9 참조). 바람직하다면, 격렬한 흔들림을 사용하여 땀샘을 분리하고 마우스 장 선와에 대해 설명된 바와 같이 현미경 하에서 상청액 내 땀샘의 존재를 조절하려고 시도한다26. 세척 단계에서 분리된 땀샘이 분해되는 경우 중요하지 않습니다. 오가노이드는 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

Hans Clevers는 오가노이드 배양에 대한 여러 특허를 보유한 발명가입니다. 그렇지 않으면 저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 EU Marie Curie Fellowship(EU/300686-InfO)의 지원을 받아 S.B.로, United European Gastroenterology Foundation에서 H.C.에 연구상을 수여했습니다. 기술 지원을 해주신 Harry Begthel, Jeroen Korving 및 Hubrecht Imaging Center, 초기 오가노이드 배양에 도움을 주신 Meritxell Huch, 토론에 참여해 주신 Yana Zavros에게 감사드립니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Medium
HEPESInvitrogen15630-056
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-028
Matrigel, GFR, phenol freeBD356231
GlutaMAXInvitrogen35050-079재고 농도 200 mM, 최종 농도 2 mM
B27Invitrogen17504-044재고 농도 50 x, 최종 농도 1x
N-AcetylcysteineSigma-AldrichA9165-5G재고 농도 500 mM, 최종 농도 1 mM
쥐 재조합 EGFInvitrogenPMG8043재고 농도 500 µ g/ml, 최종 농도 50ng/ml
인간 재조합 FGF10Peprotech100-26재고 농도 100 &마이크로; g/ml, 최종 농도 200 ng/ml
TGFβ i A-83-01Tocris2939재고 농도 500 µ M, 최종 농도 2 &마이크로; 남 
니코틴아미드시그마-알드리치N0636재고 농도 1 M, 최종 농도 10 mM 
[Leu15]-GastrinSigma-AldrichG9145재고 농도 100 &마이크로; M, 최종 농도 1 nM
RHOKi Y-27632Sigma-AldrichY0503재고 농도 10 mM, 최종 농도 10 µ M
Wnt3A 조건화된 배지Clevers 실험실에서 생성된 안정한 세포주. 최종 농도 50%. 세포는 Hans Clevers에서 얻을 수 있습니다.
R-spondin1 조건화된 배지Kuo 실험실에서 생성된 안정한 세포주. 최종 농도 10%. 세포주는 Stanford의 Calvin Kuo에서 얻을 수 있습니다.
Noggin 조건 배지Clevers Lab에서 생성 된 안정된 세포주. 최종 농도 10 %. 세포는 Hans Clevers에서 얻을 수 있습니다.
R-스폰딘3R& D3500-RS/CFR-스폰딘용 대체 공급원. 이는 인간 장 오가노이드(1 µ g/ml)이지만 아직 위 오가노이드에는 사용하지 않습니다.
NogginPeprotech120-10noggin의 대체 소스. 이는 인간 장 오가노이드(100ng/ml)에 대해 테스트되었지만 아직 위 오가노이드에 대해서는 테스트되지 않았습니다.
TrypLE expressLife Technologies12605036효소 해리 솔루션 
쿨셀® 무알코올 세포 동결 용기살생물BCS-405
회수 세포 배양 동결 매체Invitrogen12648-010
Antibiotics
PrimocinInvivogenant-pm-1박테리아와 곰팡이를 다시 사용하는 항생제 조성물. 문화를 시작한 후에 도움이 됩니다. 장기 배양을 위해 다른 항생제로 전환하거나 전혀 사용하지 않을 수 있습니다.
페니실린/스트렙토마이신인비트로젠15140-122재고 농도 10,000/10,000 U/ml, 최종 농도 100/100 U/ml. 장기 배양에서 Primocin에 대안적으로 사용할 수 있습니다.
Other
TweezersNeolabs2-1033끝이 미세한 핀셋은 조직에서 근육층을 제거하는 데 도움이 됩니다.
4 Well MultidishThermo Scientific144444다른 Multidish를 사용할 수 있습니다. 이들은 외부 테두리가 낮고 매니퓰레이터가 더 많이 움직일 수 있기 때문에 미세 주입에 특히 도움이 되었습니다.
MicromanipulatorNarishigeM-152
MicroinjectorNarishigeIM-5B
실체현미경LeicaMZ75
작업대Clean Air실체현미경에 맞게 맞춤 제작
.
마이크로피펫 풀러셔터 기구불타는 갈색 마이크로피펫 풀러
안티 Cag A 항체Santa Cruzsc-25766
ML2 조건 Capillaries Harvard Apparatus GC100T-10 1mm 외경, 0.78mm 내경에

참고문헌

  1. Aiuto, L., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Models to Investigate Human Cytomegalovirus Infection in Neural Cells. PLoS ONE. 7 (11), e49700(2012).
  2. Penkert, R. R., Kalejta, R. F. Human Embryonic Stem Cell Lines Model Experimental Human Cytomegalovirus Latency. mBio. 4 (3), e00298-13-e00298-13(2013).
  3. Roelandt, P., et al. Human pluripotent stem cell-derived hepatocytes support complete replication of hepatitis C virus. J Hepatol. 57 (2), 246-251 (2012).
  4. Schwartz, R. E., Trehan, K., et al. Modeling hepatitis C virus infection using human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2544-2548 (2012).
  5. Shlomai, A., et al. Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).
  6. Wu, X., et al. Productive Hepatitis C Virus Infection of Stem Cell-Derived Hepatocytes Reveals a Critical Transition to Viral Permissiveness during Differentiation. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002617(2012).
  7. Yoshida, T., et al. Use of human hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells as a model for hepatocytes in hepatitis C virus infection. Biochem Biophys Res Commun. 416 (1-2), 119-124 (2011).
  8. Ng, S., et al. Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Support Plasmodium Liver-Stage Infection In Vitro. Stem Cell Report. 4 (2), (2015).
  9. Klotz, C., Aebischer, T., Seeber, F. Stem cell-derived cell cultures and organoids for protozoan parasite propagation and studying host-parasite interaction. Int J Med Microbiol. 302 (4-5), 203-209 (2012).
  10. Engevik, M. A., et al. Loss of NHE3 alters gut microbiota composition and influences Bacteroides thetaiotaomicron growth. AJP: GI. 305 (10), G697-G711 (2013).
  11. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. 8 (2), 352-361 (2015).
  12. McCracken, K. W., et al. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).
  13. Bartfeld, S., et al. In Vitro Expansion of Human Gastric Epithelial Stem Cells and Their Responses to Bacterial Infection. Gastroenterology. 148 (1), (2014).
  14. Schlaermann, P., Toelle, B., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. , (2014).
  15. Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 Plays a Functional Role in Helicobacter pylori-induced Epithelial Cell Proliferation. PLOS Pathogens. 11 (2), e1004663(2015).
  16. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  17. Sato, T., et al. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  18. Barker, N., et al. Lgr5+ve Stem Cells Drive Self-Renewal in the Stomach and Build Long-Lived Gastric Units In Vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  19. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  20. Huch, M., et al. Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from Adult Human Liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  21. Boj, S. F., et al. Organoid Models of Human and Mouse Ductal Pancreatic Cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  22. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  23. Bartfeld, S., et al. High-throughput and single-cell imaging of NF-kappaB oscillations using monoclonal cell lines. BMC cell. 11, 21(2010).
  24. Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory Maintenance of Helicobacter Species. Curr Protoc Microbiol. , (2006).
  25. Van Es, J. H., de Geest, N., van de Born, M., Clevers, H., Hassan, B. A. Intestinal stem cells lacking the Math1 tumour suppressor are refractory to Notch inhibitors. Nat Commun. 1 (2), 1-5 (2010).
  26. Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -K. A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture. J Vis Exp. (90), (2014).
  27. Stange, D. E., Koo, B. -K., et al. Differentiated Troy+ Chief Cells Act as Reserve Stem Cells to Generate All Lineages of the Stomach Epithelium. Cell. 155 (2), 357-368 (2013).
  28. Van de Wetering, M., Sancho, E., et al. The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells. Cell. 111 (2), 241-250 (2002).
  29. Schumacher, M. A., Aihara, E., et al. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology. Journal Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).
  30. Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. -K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids. PLoS ONE. 8 (10), e76871(2013).
  31. Koo, B. -K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nat Meth. 9 (1), 81-83 (2012).
  32. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  33. Li, V. S. W., Ng, S. S., et al. Wnt Signaling through Inhibition of β-Catenin Degradation in an Intact Axin1 Complex. Cell. 149 (6), 1245-1256 (2012).
  34. Van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a 'Living Organoid Biobank' of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

더 많은 논문 탐색

위 오가노이드오가노이드 배양미세주입 기술위선기저막성장 인자세포 배양면역조직화학 염색유전자 변형
감염증에 대한 모델로 Organoids : 헬리코박터 파이로리의 인간의 문화와 쥐 위장 Organoids 및 미세 주입
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.