유세포 분석을 사용하여 마우스 정자에 대한 정렬 전략을 설명합니다. 정자류는 둥글게(정자형성 단계 1-9), 초기신장(정자형성 단계 10-12), 후기신장(정자형성 단계 13-14) 및 길쭉한 정자류(정자형성 단계 15-16)를 포함하여 4개의 매우 순수한 개체군으로 분류됩니다. DNA 염색, 크기 및 입도는 선택 매개변수로 사용됩니다.
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방법 논문
단계 별 마우스 정자의 정렬을 유동 세포 계측법에 의해
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이 논문에서
요약
초록
마우스 정자의 분화는 그대로 게놈과 수컷 생식 기능의 제조를위한 하나의 중요한 과정이 다음 세대로 전달 될 것이다. 지금까지, 이러한 형태 학적 변화의 분자 연구는 후속 분석을위한 spermatid 분화 이러한 중요한 단계의 적절한 분리를 가능하게하는 방법의 결여에 의해 방해되어왔다. 유동 세포 계측법을 사용하여 이러한 세포의 적절한 게이트에서 이전 시도 때문에 염색질 리모델링을받은 정자의 DNA 형광의 독특한 증가로 어려웠을 수있다. 이러한 관찰에 기초하여, 우리는 에탄올로 고정 마우스 정자 네 개체군의 재현성 정화를 허용 방식 계측법 단순 흐름의 세부 사항을 제공하는, 각각의 핵 리모델링 과정에서 다른 상태를 나타내는. 인구 농축 단계 특정 마커와 형태 criterions에를 사용하여 확인할 수있다. 정자 정제 게놈과 proteom 위해 사용될 수있다IC는 분석한다.
서론
반수체 원형 정자는 정자 형성(spermiogenesis)이라는 과정에 의해 정자로 분화합니다. 여기에는 편모 획득, 염색질 및 세포골격 리모델링, 핵 응축 및 대부분의 세포질 손실을 포함한 다양한 단계가 포함됩니다. 이러한 독특한 세포 사건은 수정에 적합한 온전한 게놈을 가진 성숙한 기능적 배우자를 생성하기 위해 미세하게 조절되어야 합니다. 정자 형성은 지금까지 신뢰할 수 있는 세포 배양 시스템이 프로세스의 여러 단계를 통한 진행을 지원할 수 없었기 때문에 체외에서 거의 연구할 수 없습니다. 더욱이, 실제 시험관 내 기술은 수율이 좋지 않습니다1,2. 생체 내에서, 정자 형성의 여러 단계를 통한 적절한 전환은 남성 배우자의 자연스러운 기능적 무결성에 매우 중요합니다. 분화 단계에 따른 정자류의 성공적인 정제는 정자 형성의 분자 특성화를 허용하기에 충분한 수준의 농축으로 수행된 적이 없습니다. 예를 들어, 정자 분화의 주요 단계를 정제하는 것은 발달 중인 아크로솜, 중간조각의 형성3, 세포 접합역학4, RNA역학5, 염색질 리모델링 과정6,7 또는 게놈 안정성8을 연구하는 데 특히 유용할 것입니다. 정자류의 정제는 점진적인 형태....
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프로토콜
동물 보호는 셔 브룩 대학 동물 관리 및 사용위원회에 따라이었다.
1. 튜브 준비
- 셀 소팅 전날, 5 ㎖ 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브에 열 활성화 된 우 태아 혈청 (FBS) 1-2 mL를 넣고 15 mL 및 50 mL의 폴리 프로필렌 원추형 튜브에 관한 것이다.
중요한 단계 : 프로토콜에서 사용되는 모든 튜브가 코팅 된 것을 확인합니다.
참고 : FBS 코팅 튜브 벽에 달라 붙는 세균 세포를 방지 할 수 있습니다. - 천천히 튜브를 균일하게 회전을 사용하여 코트 4 ° C에서 반전에 의해 O / N을 섞는다.
- 다음 날, 경사에 의해 코팅 된 튜브에서 FBS를 제거합니다.
- * 중요한 단계 : 5 ML의 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브 및 셀 제조에 사용 (15)과 50 ㎖ 튜브 (프로토콜이 2.11에 2.1 단계) 완전히 패닝 (측면 스트림 즉, 부정확 편차)을 방지하기 위해 FBS의 비워되어 있는지 확인합니다. FBS를 제거하기 위해 P200 피펫을 사용합니다.
참고 : 이전에 셀 또는 셀 정렬하는 동안 사용되는 다른 튜브의 오염의 손실을 초래할 수 정렬에 튜브에 잔류 FBS, - 라운드 5 ....
- * 중요한 단계 : 5 ML의 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브 및 셀 제조에 사용 (15)과 50 ㎖ 튜브 (프로토콜이 2.11에 2.1 단계) 완전히 패닝 (측면 스트림 즉, 부정확 편차)을 방지하기 위해 FBS의 비워되어 있는지 확인합니다. FBS를 제거하기 위해 P200 피펫을 사용합니다.
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결과
게이팅 전략 유동 세포 계측법에 사용
그림 1은 네 개의 순수 spermatid 인구를 정렬 유동 세포 계측법에 사용되는 게이팅 전략을 나타냅니다. 간단히, 긍정적 인 DNA 염색과 세포 (알렉사 플 루어 488-A)를 처음 크기 대 granulosity (SSC-A)를 보여주는 도트 플롯에 spermiogenesis 1. 정자가 12이 선택 단계들 게이트 (문 2)와 선택 (FSC 게이트 (1)로부터 -A) 그런 다음, spermiogenesis에서 정자 1-9 단계 및 spermiogenesis 10-12은 DNA 염색 강도의 변화에 따라 서로 분리 될 수있는 단계 (게이트 (5, 6)). spermiogenesis에서 정자는 단계 13-14 및 15-16는 직접 DNA 염색 (알렉사 형석 488-A) 대 도트 플롯 나.......
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토론
정자 세포는 항상 정액을 운반하는 상피 세포의 복잡성뿐만 아니라 체외 문화의 제한된 성공을 주어 연구에 도전하고있다. 수년에 걸쳐, 많은 접근법은 다양한 종에서 생식 세포가 개발되었다 정제한다. 퍼콜 또는 소 혈청 알부민 구배로 중력을 이용하여 침전 정화 기법은 일반적으로 그대로 생식 세포의 우수한 수율을 제공하지만, 이러한 감수 배체 세포 및 정자 10 일부 세포 유형 사이의 적절한 정의가 부족하다. 또한, 이러한 기술이 필요 성가신 시행 착오없이 재현하기가 어려운 렌더링 많은 실험실에 쉽게 사용하지 못할 수 있습니다 (종종 집에서 만든) 특수 장치.을 장치는 일반적으로 세포의 생존을 유지하기 위해 4 ℃에서 보관 될 때 이들 방법은 또한 시간 소모, 진동에 매우 민감하고 불편하다. 성공하면, 침전 방법 그러나 수백만 정제 라이브 C를 제공인구 당 ELL 학생. 그러나, 달성 될 수있는 셀 농축 로우 레벨은 거의 이상 80~90% 순도에 도달하지 않기 때문에이 기술의 주요 단점이다. 분자량.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 표면 형광 현미경에 관한 기술적 조언 박사 레오 니드 볼코프 에릭 보우 차드을 감사드립니다.
경제적 지원
GB의 건강 연구 (보조금 # 1 MOP-93781)의 캐나다 연구소에 의해 자금 지원
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Isoflurane | ABBOT | 05260-05 | 안락사 전 마우스 마취용 |
| 소 태아 혈청 | Wisent | 90150 | 튜브 코팅용 |
| 1x PBS | |||
| EDTA | BioShop | EDT | 분류 완충액 준비용 |
| HEPES | Sigma | H | 분류 완충액 준비용 |
| 100% 에탄올 | Les alcools de commerce | 092-09-11N | 세포 고정용 |
| SYTO 16 | Life Technologies | S7578 | DNA 염색 |
| 5ml 폴리프로필렌 원형 바닥 튜브 | BD Falcon | 352063 | 분류 된 세포 수집 |
| 15ml 폴리 프로필렌 원추형 바닥 튜브 | PROgene | 1500 | |
| 50ml 폴리 프로필렌 원추형 바닥 튜브 | PROgene | 5000 | |
| TEC4 마취 기화기 | Ohmeda | 1160526 | 마우스 안락 |
| 용 CO2< / sub> 가스 탱크 | Praxair | C799117902 | 마우스 안락사 |
| 용 O2< / sub> 가스 탱크 | Praxair | O254130501 | 마우스 안락 용 |
| 수제 마우스 가스 챔버 | 마우스 안락사 40 | ||
| µ m 팔콘 셀 스트레이너 | Corning Incorporated | 352340 | |
| 50 μ m 샘플 라인 필터 | BD Biosciences | 649049 | |
| Vortex 믹서 | Labnet international, inc. | S0200 | 세포 정착 Dynac |
| 원심 분리기 | Clay Adams | 101 | |
| Celltrics 50 µ m 필터 | Partec | 04-004-2327 | |
| 488nm 레이저 euipped 세포 분류기 | BD Biosciences | FACSAria III | |
| Accudop 형광 구슬 | BD Biosciences | 345249 | |
| 분류 버퍼: 1x PBS, 1mM EDTA pH 8.0, 25mM HEPES pH 7.0, 1% FBS | FBS는 불활성화입니다. 새로운 솔루션 만들기, 0.22 μ m은 필터링하고 4°C로 유지합니다. |
참고문헌
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nat. Commun.
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재인쇄 및 허가
