방법 논문

사람 말초 혈액에서 생성 및 문화 혈액의 파생물 내피 세포

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DOI:

10.3791/53384

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2015년 12월 23일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Cambridge, 2Papworth Hospital

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 소량의 성인 말초 혈액에서 혈액 성장 내피 세포(BOEC)를 안정적으로 생성하고 특성화할 수 있도록 합니다. BOEC는 혈관 질환 환자의 내피 세포의 대리 및 유도 만능 줄기 세포 생성을 위한 기질로 사용할 수 있습니다.

초록

역사적으로 혈관 질환 환자의 일차 내피 세포의 제한된 가용성은 이러한 개인의 내피 기능 장애의 기저에 있는 분자 메커니즘에 대한 연구를 방해했습니다. 그러나 최근 성인 말초 혈액에서 순환하는 내피 전구 세포에서 생성된 혈액 성장 내피 세포(BOEC)의 확인은 환자 유래 내피 세포에 대한 내피와 같은 일차 세포 대리모를 제공함으로써 이러한 제한을 우회할 수 있습니다. BOEC는 내피 생물학 및 질병 모델링을 이해하는 데 도움이 되는 가치 외에도 내피 세포 이식 요법에 잠재적으로 사용될 수 있습니다. 또한 핵 재프로그래밍을 통한 유도만능줄기세포(iPSC) 생성에 적합한 세포 기질로서 다른 세포 유형에 비해 많은 이점을 제공합니다. 우리는 이러한 응용 분야 및 기타 응용 분야에 사용하기 위해 성인 말초 혈액에서 BOEC의 신뢰할 수 있는 생성, 배양 및 특성화를 위한 방법을 설명합니다. 이 접근법은 (i) 상대적으로 적은 양의 성인 말초 혈액에서 환자 특이적 내피 세포를 생성할 수 있게 하고 (ii) 형태, 세포 신호 전달 및 유전자 발현에서 1차 내피 세포와 매우 유사한 세포를 생성합니다.

서론

최근까지, 새로운 혈관의 산후 생성은 기존의 혈관의 내피 세포에서 새로운 혈관의 발아로 정의 혈관 신생으로 알려진 과정을 통해 독점적으로 발생하는 것으로 추정 하였다. (1)이 프로세스는 혈관 형성에서 대조하거나 배아 발생 동안 배타적으로 발생하는 것으로 생각되었다 내피 전구 세포로부터 혈관의 드 노보 형성. 2 그러나, 최근의 연구는 식별 및 성인 말초 혈액 내피 전구 세포 (내피 전구 세포)를 순환 한 절연. 이러한 세포 배양에 성숙한 혈관 내피 세포로 분화 할 수있는 능력을 보유하고 생후 혈관 형성에 참여하는 것으로 생각된다. 3,4

이러한 분리 및 내피 전구 세포의 팽창에 대한 프로토콜은 전형적 vascul 포함한 내피 세포 성장 인자를 함유하는 배지에서 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)의 배양을 수반AR 내피 성장 인자 (VEGF) 및 섬유 아세포 성장 인자 -2. 5-8 EPC 배양이 크게 상이한 다양한 종류의 세포를 생산한다. 초기 배양 (<7 일) "초기"내피 전구 세포로서, 문헌에 공지 된 단핵구 세포 유형에 의해 지배된다. 그들의 이름에도 불구하고,이 세포는 단핵구 마커 CD14 표현, 전구 마커 CD34에 대한 부정하고 고전적인 내피 마커 CD31와 VEGF 수용체 2 (VEGFR2)의 최소한의 수준을 표현한다. (5) 계속 배양 세포의 2 인구 상승을 제공, 내피 세포와 같은 세포로 신중 식민지를 나타 늦게 가지 내피 전구 세포 또는 혈액 가지 내피 세포 (BOECs)라고도합니다. 단핵구 초기 내피 전구 세포와는 달리, 또한 내피 콜로니 형성 세포 (ECFCs), 부산물 내피 세포 또는 늦은 가지 내피 세포라고 한 BOECs은 내피 세포 단일 층의 전형적인 조약돌 형태를 나타내고 표면 마커 매우 유사하다5 유전자 발현 (9)는 내피 세포를 성숙.

말초 혈에서 내피 형 세포의 생성은 특히 폐동맥 고혈압 (PAH) (10) 또는 폰 빌레 브란트 병. 11 이전 BOECs의 가용성, 내피 같은 혈관 장애와 연관된 내피 세포 기능 부전의 연구를 위해 몇 가지 장점을 제공한다 셀은 출생시 제대 정맥에서 사망 또는 장기 이식, 또는 고립의 시간에 외식 기관에서 파생 될 수있다. 가용성이 감소 심혈관 질환뿐만 아니라, 내피 세포 및 혈액 세포 중 또는 벽화 세포 사이의 상호 작용이있는 환자로부터의 내피 세포 생물학을 이해하는 심각한 제한을 나타낸다. 더욱이, 단리 및 이들 소스에서 내피 세포의 순수 인구를 배양하는 것은 기술적 도전과 이들 방법에 의해 유도 된 세포에서만 발현 기간 한정D 증식 능력. BOECs 따라서 환자 유래 차 내피 세포의 분리 및 문화에 대한 가치있는 대리를 제공합니다.

그들의 시험 관내 애플리케이션 외에 BOECs는자가 세포 이식 치료에 잠재적으로 유용하다. 이러한 애플리케이션은 13 BOEC 유래 iPSCs 질병 모델에 사용될 수 혈관 신생 (내부 (12) 및 참조를 참조)를 촉진하기 모두 내피 세포 이식뿐만 아니라, 유도 된 다 능성 줄기 세포의 생성 (iPSCs 참조). 포함 개시로서 막대한 잠재력을 제공 자가 세포 치료에 대한 자료. BOECs 빠르고 피부 섬유 아세포보다 높은 효율로 재 프로그램. 또한, BOECs도 번역 응용 프로그램에 적합합니다 모든 기술의 필수적인 기능입니다 핵형 이상, 무료입니다 iPSCs의 생성을 가능하게합니다. 환자의 혈액 샘플로부터 iPSCs를 생성하는 기능LSO함으로써 상처 치유 장애, 또는 매우 어린 환자로부터 세포의 생성을 촉진하는 피부 생검에 대한 필요성 및 피부 섬유 아세포의 생성을 제거한다.

아래 설명 프로토콜, 승인 및 국립 연구 윤리 서비스위원회 (영국 이스트)의 지침에 따라 수행은 비교적 작은 부피에서 90 % 이상의 효율로 BOECs의 생성을위한 간단하고 신뢰할 수있는 방법 (60드립니다 ㎖) 말초 혈액의. 이러한 세포 증식 높게하고 단일 혈액 샘플에서 세포 수억의 생성을 허용 반복 계대 될 수있다.

프로토콜

BOEC 세대 프로토콜의 개략도는도 1에 도시된다.

1. 혈액 수집 및 밀도 구배 원심 분리

  1. 각 공여체 개의 50 ㎖ 원뿔형 원심 분리 관 각각에 시트르산 나트륨 3 ㎖를 추가한다. 정맥 천자에 의해 혈액 60ml를 수집하고 각 튜브에 30 ㎖를 추가합니다. 혼합 가볍게 2 ~ 3 회 전환. 적절하게 조정 구연산 볼륨과, 프로토콜에서 혈액의 적은 40 mL로 사용합니다.
    주 : 혈액 샘플을 수집 2 시간 내에 처리하는 것이 필수적이다. 가지 식민지 수율의 현저한 감소 혈액 결과의 처리를 지연.
  2. 제 병을 섞어 수회 반전시켜 밀도 구배 원심 분리 배지를 함유하는 새로운 원추형 튜브를 준비한다. 무균 후드에서, 50 mL의 원뿔형 튜브 (혈액의 매 10 ㎖, 도너 당 6 튜브를 튜브 1) 밀도 구배 원심 분리 배지를 가하여 15.
  3. 둘 베코의 인산염과 1 : 1의 혈액을 희석-Buffered 식염수 (DPBS). 작업 표면과 20 °의 각도에 밀도 구배 원심 분리 배지를 함유하는 튜브를 기울인다. 피펫 보조제 및 25 ㎖ 혈청 피펫을 사용하여 천천히 서서히 기울어 진 관의 벽 아래로 혈액을 추가하여 매체의 상부에 희석 된 혈액의 21 mL의 층을 포함한다.
    주 : 이렇게하면 농도 구배 층을 갖는 혈액의 혼합을 최소화하고 엄격한 버피 코트뿐만 아니라, 향상된 수율을 생성한다.
  4. 35 가속기와 실온에서 분 브레이크 오프 400 XG에 원심 분리기 샘플.
  5. 2.4 - 원심이 기간 동안, 단계 2.1에 상세히 콜라겐 코팅을 시작한다. 다음 단계는 3.1 단계로 진행하기 전에 완료했는지 확인하십시오.

T-75 플라스크와 문화 매체의 준비 2. 콜라겐 코팅

주 : 세포 배양 후드에서 다음 단계를 수행.

  1. 재고 타이를 희석하여 50 μg의 / ㎖ 콜라겐 솔루션을 준비. 내가 0.02M 아세트산 예 10ml에 콜라겐 퍼가기 : 콜라겐 주식 4.05 밀리그램의 농도 / ㎖, 0.02 M 초산 10 ㎖에 콜라겐 123.5 μL를 추가합니다. 살균 필터 콜라겐 현탁액, 사용 전에.
  2. 혈청 피펫을 사용하여, T-75 세포 배양 물 플라스크에 콜라겐 용액 7.5 mL를 추가. 이 볼륨은 5 μg의 콜라겐 / ㎠ (또는 375 μg의 / 플라스크)를 제공합니다. 실온에서 1 시간 동안 코트 플라스크.
  3. 제조업체에서 제공하는 성장 인자로 보충 내피 기초 배지를 보충하여 BOEC 생성에 사용 내피 성장 배지를 준비한다. 모든 보충제를 추가,하지만 혈청을 추가하지 마십시오. , BOEC 생성 배지 15 ml를 준비하는 성장 인자를 함유 보충제 내피 성장 배지의 12.5 ml의 정의 된 태아 소 혈청 (FBS) 2.5 mL를 추가한다.
  4. , 1 시간 코팅 기간이 지난 후에 제 3 절에서 설명하는 단계를 진행합니다 콜라겐 솔루션을 기음과 피펫 팅에 의해 잔류 아세트산을 씻어10 ML의 DPBS에. DPBS 대기음과 한 번 더이 세척 단계를 반복합니다. 단계 3.3 중에 얻어진 세포 현탁액이 때 도금 준비되지 않은 경우, 건조 아웃에서 콜라겐 코팅을 유지하는 플라스크 BOEC 생성 5ml의 배지를 추가한다.

3. 수집 및 PBMNCs의 도금

  1. 단계 1.4에서 설명하는 밀도 구배 원심 분리 후, 조심스럽게 멸균 플라스틱 이전 피펫을 사용하여 버피 코트 층을 수집한다. 버피 코트의 컬렉션은 각 관에서 세포 현탁액과 혈장의 약 20 ㎖를 산출한다. 밀도 구배 매체를 전송하는 피.
  2. 단핵 세포 현탁액을 희석 1 : 1, DPBS 혼합 반전. 최대 브레이크와 액셀러레이터 300 XG에 20 분 동안 실온에서 원심 분리기.
  3. 원심 분리 후, 아래마다 반복 펠릿 BOEC 생성 배지 1 ㎖를 첨가하고, 피펫 팅에 의해 위로 뜨는 재현 탁하고 세포를 흡인. 풀 세포 현탁액을나머지 중 10 ml의에 D 상단까지 총 부피.
  4. 총 세포 수, 시료 세포 현탁액 10 μL의 추정을 얻고 적혈구 용균 것이다 터크의 용액 490 μL, 50X와 희석. 혈구 계를 사용하여 희석하여 세포 현탁액 10 μL 샘플을 계산.
    참고 : 60 ㎖의 혈액이 도금 약 100-150 × 106 백혈구를 수득한다.
  5. 단, 콜라겐 코팅 된 T-75 플라스크에 플레이트 전체 세포 현탁액을, 5 % CO 2를 함유하는 가습 분위기에서 37 ℃에서 15 ㎖ / 플라스크 배양 위에서 업 매체 볼륨. 이 시간에 도금 세포 통로 0을 나타냅니다.
    주 : 나중에 또는 BOECs가 생성 될 수있다 다른 실험실로 수송 PBMNCs 위해 BOECs을 유도하기 위해 이전에 분리 BOEC 절연 PBMNCs을 동결시킬 수있다. 그러나,이 냉동 PBMNCs BOEC 분리의 효율을 감소시킬 수 있음을 주목하는 것이 중요하다. 에스방법은 아래 EE (8).

4. 장기 세포 배양

  1. 신선한 BOEC 생성 배지 15 mL를 첨가하여 2 일마다 배지 변경 (5 : 내피 세포 성장 배지 1 혼합물을 FBS 및 정의). 주말의 경우, 매체의 변화는 매 3 일 지연 될 수 있습니다.
    참고 : 파생물 식민지 문화의 7 14 일 사이에 나타납니다.
  2. 가지 식민지의 모양에 대한 일 7-14에 BOEC 문화 플라스크를 모니터링합니다. 고전 내피 조약돌 형태를 나타내는 세포의 원형 그룹과 같은 식민지를 식별합니다.
  3. 식민지 또는 다수의 식민지가 플라스크에서 확인되면, 매체의 변화를 계속하고 식민지 계대 전에 식민지 당 약 1000에서 2000 사이 세포로 성장할 수 있습니다. 대략적인 시각적 평가를 통해 식민지 당 세포 수를 결정합니다.
    참고 : 가이드로서, 1 주일 먼저 가지 식민지의 확인 후 통과 초기 가지 식민지에 관례이다.
    4. <리> DPBS 10 ㎖로 두 번 플라스크를 세척하여 항로 세포. 1X 트립신 EDTA 5 mL를 추가하고 5 분 동안 37 ° C 배양기에서 배양한다. 5 분 후, 배지 (FBS 함유) 10 mL로 트립신을 중화 반복 피펫 팅으로 세포 현탁액을 가져온다.
  4. 5 분 300 XG, 신선한 BOEC 세대 매체의 15 용액에 재현 탁하고 새로운 T-75 플라스크 (대표 통로 1, P1)로 전체 세포 현탁액을 도금에서 원심 분리기 서스펜션. 어떤 콜라겐 코팅이 필요하지 않습니다.
  5. 세포가 합류 (플라스크 당 약 3 ~ 5 × 10 6 세포)가 될 때까지 상기 한 바와 같이 매체 변화를 계속합니다. 합류 후에 세포 통로 단계 4.3에 기재된 바와 같이.
    주 : 전방 통로 (2)에서, 세포는 더 이상 생성 BOEC 매체를 필요로하지 않으며 내피 세포 성장 배지 및 10 % 열 - 불 활성화 된 표준 FBS에서 배양 할 수있다. 콜라겐의 존재 BOEC prolifer을 향상시킬 수 있다는 증거가 콜라겐 코팅은 선택적인 단계 향후로서 사용될 수있다ATION 속도.
  6. 계속 계대, 플레이트 T-75 플라스크 당 더 적은 75보다 세포의 낮은 세포 밀도는 BOECs가 확산 중지 될 수 있습니다.

5. 동결 융해 BOEC 문화

  1. 5 분 동안 300 XG에 4.3 절과 원심 분리기에 설명 된대로 세포를 Trypsinize. 배지 10ml에 재현 탁하고 상등액을 흡인. 이것은 내피 세포 성장 배지를 필요로하지 않는다; 10 % 표준 FBS와 DMEM 충분하다. 혈구 계를 사용하여 수동 세포 수를 수행하는 세포 현탁액 10 μL 샘플을 수집한다.
  2. 빙냉 동결 배지 (50 % FBS와 10 % DMSO 40 %의 DMEM)에 2 × 106 세포 / ㎖로 재현 탁하고 다시 원심 분리한다. 에 차가운 얼음 이소프로판올 냉동 보존 용기와 장소에 0.5 ㎖ (10 6 세포) 각 유리 병에, 장소의 병을 추가 -80 적어도 2 시간 동안 ° C의 냉동고 액체 질소로 전송하기 전에. 이상 24 시간 동안 -80 ° C에서 세포를 두지 마십시오.
  3. 세포를 해동 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브에 미리 예열 매체 10 ㎖를 추가합니다.
    주 : 통로 1 세포를 해동 할 때, 해동 후 처음 2 일 동안 20 % FBS 정의 보충 내피 세포 성장 배지에 해동. 이는보다 안정적인 세포 격리 향후 리드.
  4. 단지 작은 얼음 결정이 유리 병에 남아 때까지 교반과 함께 37 ℃로 물을 욕조에 액체 질소와 해동에서 세포를 제거합니다. 원뿔 원심 분리기 튜브에 유리 병 드롭 지혜의 내용을 추가하고 5 분 동안 300 XG에 스핀 다운.
  5. 10 ml의 EGM-2mV의 + 10 % FBS에서 기음 뜨는에 resuspend 세포 펠렛. 15 ml의 T-75 플라스크 상단까지 매체에 추가합니다.

유동 세포 계측법에 의해 BOECs 6. 특성

  1. 염색 버퍼 용액 당 10 6 세포의 농도로 4.4 절과 재현 탁에 설명 된대로 4 절에 설명 된 BOEC 식민지가를 Trypsinize 세포를 확장하도록 허용되고 나면 (DPBS 위트H 2 % FBS와 2 mM의 EDTA).
  2. CD45, CD14, CD34, CD31 (사용 1시 20분 희석 모든) 또는 VEGFR2 (희석 1시 10분)에 대한 감독, 형광 - 복합 항체 (자세한 내용은 표 1 참조) 10 5 세포를 결합합니다. 어둠 속에서 4 ℃에서 30 분 동안 품어.
  3. 1 ml를 5 분 동안 300 XG에 버퍼와 원심 분리기를 염색 세포를 씻으십시오. 기음 뜨는 및 분석을위한 400 μL 염색 버퍼에 resuspend. 4 ° C에서 세포를 유지하고 빛의 사전 분석에 보호.
  4. 분석에서 사용 된 형광 복합 항체를 검출하기 위해 구비 사이토에 세포 계측 분석을 수행한다.
  5. 전방 조절 및 측면 산란 전압뿐만 아니라 FITC 및 APC 채널 전압에 의해 사이​​토 세포 집단을 식별하는 흠 BOEC 샘플을 사용한다.
  6. 각각의 형광 색소에 대한 이소 염색 된 세포를 사용하여 임계 값을 게이팅 결정합니다. presenc에 기초하여 각각의 세포 표면 마커에 대해 양성을 평가형광 색소에 대한 이소 타입 제어 대 형광 강도의 피크 시프트의 전자 분석된다.

면역 형광 현미경으로 BOECs 7. 특성

  1. 내피 세포 성장 매체의 500 μL에 5 × 10 4 세포의 밀도로 된 커버없이 24도, 평면 바닥 조직 배양 플레이트에 플레이트 BOECs + 10 % 열 - 불 활성화 아니라 당 FBS가와 준수, 37에서 성장 떠나 ° C는 세포까지 5 % CO 2는 적어도 70-80 각각의 표면적 % 웰 (microsope 광 하에서 육안으로 추정 포화 상태) 커버.
  2. DPBS의 1 ㎖로 5 분 동안 잘 각각의 세포를 씻으십시오.
  3. DPBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 용액 500 μL와 4 ° C에서 세포 O / N을 수정합니다.
  4. 물론 당 DPBS 1 ㎖로 3 × 5 분 동안 세포를 씻으십시오. 추가 각각 펫 및 흡인기를 이용하여 DPBS를 제거합니다.
  5. DPBS에서 0.2 % 폴리 소르 베이트 20 3 × 10 분 동안 세포를 Permeabilize 하시려면.
  6. DPBS에서 10 % FBS를 함유하는 블로킹 완충액에서 실온에서 1 시간 동안 세포를 배양한다.
  7. 4 ° CO에서 염색 세포 항체 희석액 CD34 (10 μg의 / ㎖), CD144 대항 차 항체를 함유하는 (DPBS에서 0.1 % 소 혈청 알부민)을 300 μL의 / N (1 : 300) 또는 vWF의 (1 : 250) . 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오.
  8. DPBS와 5 × 10 분 동안 언 바운드 일차 항체를 씻으십시오.
  9. (: 200 1 모든) 표 1에 설명 된대로 적절한 형광 표지 된 이차 항체로 실온에서 1 시간 동안 세포를 품어.
  10. DPBS와 5 × 10 분 동안 언 바운드 차 항체를 씻어 내십시오.
  11. RT에서 10 분 동안의 DPBS / ㎖ 4 ', 6-diamidino-2-1 μg의 페닐 인돌 (DAPI)로 세포를 배양한다.
  12. 또한 3 × 5 분 동안 DPBS와 세포를 씻으십시오.
  13. 첨부하여 형광 여기 용 외부 광원 장착 도립 현미경을 이용하여 100 배 확대 한 이미지 셀, 및 이미지를 캡처이후 분석 오프라인 에드 디지털 카메라.

8. 동결 융해 PBMNCs

  1. 원심 다음 단계 3.2의 끝에서, 매질을 흡인하고 수동 반복 피펫 위로 및 P1000 피펫 팁을 사용하여 다운 세포 펠렛을 방해. 세포 현탁액을 제조 부드럽게 섞어 확인한 동결 배지, 90 % 혈청과 10 % DMSO 1ml를 추가하기. cryovial에 세포 현탁액을 전송하고, 동결과 제 5 절에 설명 된대로 해동.

결과

혈액 60 ml의 버피 코트로부터 단핵구 세포의 분리는 통상적으로 6 100-150x10 총 백혈구를 산출한다. 하나의 T-75 플라스크에 도금하면 unlysed 세포 현탁액 중의 세포의 다수가 곤란 시야 현미경을 사용하여 개개의 세포 부착 성을 해결할 수있다. 반복 매체의 변화는 비 부착 세포의 간극이 발생할와 "초기"내피 전구 세포 단핵구의 부착 인구의 시각화 할 수 있습니다. 7 일에서, T-75은 약 7 × 6이 연장 된 부착 세포를 포함합니다. 7-14 일에서 BOECs의 식민지 플라스크 (그림 2A) 내에서 나타납니다. 식민지는 처음으로 3-5 인접한 세포를 나타납니다. 가지 콜로니 수는 혈액의 60 ml의 당 1 ~ 10 식민지에서 다를 수 있습니다. 일반적으로, 젊은 기증자 (즉 20-25 세)도 이전 문화에 나타날 가지 식민지, 더 많은 수를 생성하는 경향이있다.BOECs은 수백 개의 세포로 이루어진 원형의 콜로니를 형성하는 세포의 중앙 군에서 증식. 이러한 식민지 내에서 세포 고전 내피 조약돌 형태를 나타낸다.

콜로니들은 당 약 1,000 세포를 포함 때 통로 초기 콜로니하는 것이 바람직하다. 가지 식민지는 일반적으로 칠일 문화에 자신의 원래 모양 후이 크기에 도달합니다. 원래 콜로니 새로운 T-75 플라스크에 계대되면, 이들은 오일 이하 (도 2b) 내에 합류 단층 (플라스크 당 3-5x10 106 세포)를 형성하기 위해 증식한다. 아이솔레이션의 작은 비율에 (<10 %), 가지 식민지가 나타 실패, 또는​​ 초기 계대 단계 다음 충분히 증식하지 않습니다. 첫 계대 후 낮은 증식을 전시 BOECs 거의 안정 BOEC 절연 부가 종종 2-3 통로 내에서 증식 정지로 이동합니다. 단핵구BOEC 문화에 포함 된 초기 내피 전구 세포는 비 증식하며, 일반적으로 1 ~ 2 구절에서 문화에서 지워집니다. 이러한 초기 세포의 정리가 세포 사멸로 인해, 초기 세포의 실패는 계대 반복 계대와 비 증식 초기 내피 전구 세포의 희석 한 후 다시 부착합니다.

항로 1 세포는 하나의 문화에 더 계대 또는 나중에 사용하기 위해 아래로 고정 할 수 있습니다. 안정한 분리가 생성되면, 세포는 최대 정지되기 전에 통로 (8) 또는 (9)까지 3-5 새로운 T-75 플라스크에 합류 한 플라스크의 속도로 계대 될 수있다. 다시, 세포 밀도는 배양에 걸쳐 매우 중요하다. 우리의 경험에서, 더 적은 75 만 이상의 세포 성장 체포 될 수 있습니다 낮은 세포 밀도로, T-75 플라스크에 도금해야한다. BOECs의 높은 증식 잠재력에도 불구하고, 세포는 overconfluent 될 수해서는 안된다 (예.> 플라스크 당 5 × 6 셀)이 CONVERS의 원인이 될 수 있습니다 비 증식 표현형 BOECs 이온.

우리는 BOEC가 내피 세포 마커에 적합한 세포 표면 및 세포 내 염색을 표시해야 임의의 셀이 표시되는 것을 제안한다. BOECs의 전형적인 특성은 내피 세포 마커 염색 다음, 유동 세포 계측법 (도 3) 또는 형광 현미경 (도 4)에 의해 달성 될 수있다. BOECs은 내피 세포 표면 마커 CD31과 VEGFR2에 대한 긍정적 및 단핵구 마커 CD14 및 범 백혈구 마커 CD45에 대한 부정이다. BOECs 또한 Weibel-Palade의 몸을 posess 따라서 이산, 반점 세포질 염색으로 폰 빌레 브란트 인자 (vWF의)을 표현한다. 이러한 폐동맥이나 대동맥 내피 세포와 같은 다른 성숙 내피 세포 유형과는 달리, BOECs는 또한 표면에 전구 및 활성화 마커 CD34를 표현한다.

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내피 성장 배지 안의 콜라겐 - 코팅 된 플레이트에도 1 BOEC 세대 프로토콜의 개략도. 말초 혈액 단핵 세포는 밀도 구배 원심 분리하여 정맥혈로부터 단리되고 배양은 FBS를 함유 정의. BOEC 식민지 문화 7-14 일 이내에 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 대표 BOEC 문화 2. 시야 이미지. (A) 파생물 식민지 조약돌 단층으로 배열하고 중앙 지점에서 반경 밖으로 확산되는 내피 세포와 같은 세포의 집합으로 존재 일 7 (14) 식민지 사이의 문화에 나타납니다. 주변 가지 식민지가 부착 모노입니다초기 문화에서 세포의 대부분을 구성하는 cytic 세포. 이전에 설명한 바와 같이 이들 세포는 "초기"내피 전구 세포는, 스핀들 형상의 형태를 가지고 단핵구 마커 CD14을 발현. 비 증식 단핵구 세포가 죽어 또는 계대 후 다시 연결에 실패 중 하나로 (B)는 계대 후, 높은 증식 BOECs은, 문화를 정복. 스케일 바 250μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 유동 세포 계측법에 의해 BOECs 3. 특성. BOECs는 트립신 특정 표면 마커 (레드 라인)에 대항 형광 접합 된 이소 제어 항체 (채워진 피크 회색) 또는 항체로 염색 하였다. 세포 계측 특성화 표면 마커조혈 마커 CD45과 CD14, 내피 마커 CD31과 VEGFR2 및 progentior과 내피 세포 활성화 마커 CD34. 포함 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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내피 세포 마커 BOECs 그림 4. 면역 형광 염색법. BOECs의 대표적인 면역 형광 이미지는 내피 세포 표면 마커 CD144에 대한 항체와 (-cadherin의 VE, 오른쪽 상단 패널)와 혈액의 당 단백질 폰 빌레 브란트 인자 (vWF의, 오른쪽 아래 패널) 면역 염색 . 핵 DAPI 염색을 보여 해당 패널은 왼쪽에 표시됩니다. 스케일 바는 50μm. CD144에 대해. 더 크게 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 버전입니다.

토론

우리는 성인 말초 혈액 단핵 세포(PBMNC)에서 BOEC를 강력하고 효율적으로 유도할 수 있는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 우리의 프로토콜에는 이전 BOEC 분리 방법의 발전을 나타내는 두 가지 중요한 개선 사항이 포함되어 있습니다. 14-16 여기에는 초기 PBMNC 배양 배지에 헤파린이 없고 정의된 배아 줄기 세포 적격 혈청의 사용이 포함됩니다. 이 후자의 개선은 특히 중요합니다. 배아 줄기 세포(ESC) 인증 혈청은 보다 일관된 등급의 혈청이며, BOEC 분리에 도움이 되는 혈청에 어떤 성분이 풍부한지는 아직 알려지지 않았지만 이 정의된 혈청이 BOEC 생성 효율에 미치는 영향은 우리 손에 분명합니다. 또한 인간 혈청을 사용하여 BOEC를 분리하는 데에도 성공하여 임상 번역을 위한 BOEC를 생성할 수 있었습니다. 우리의 손에서 이 정제된 프로토콜은 기증자의 90% 이상으로부터 안정적인 BOEC 배양을 성공적으로 분리하여 지금까지 보고된 가장 신뢰할 수 있는 BOEC 생성 방법 중 하나가 되었습니다. 특정 혈청의 사용은 BOEC 생성에 중요하지만 현재 프로토콜의 주요 한계이기도 합니다. 이 기술에 대한 향후 개선에는 무혈청, 정의된 배양 조건에서 이러한 세포의 생성이 포함될 수 있습니다.

프로토콜의 중요한 단계에는 수집 후 가능한 한 빨리 혈액 샘플 처리, 밀도 구배 원심분리 후 버피 코트 세포의 완전한 수확 및 P0에서 P1로의 초기 콜로니의 적시 계대가 포함됩니다. 이 계대 단계는 안정적인 격리를 확립하는 데 중요합니다. 다른 내피 세포와 마찬가지로 BOEC는 도금 밀도에 매우 민감한 것으로 보입니다. 계대 후 도금 밀도가 너무 낮으면 BOEC가 증식하지 않습니다. 반대로, 콜로니가 계대 전에 과도하게 융합되도록 허용하면 세포도 증식을 멈추고 길쭉한 중간엽 세포 표현형으로 전환되는 경향이 있습니다. 7일에서 14일까지 콜로니가 거의 나타나지 않거나 콜로니의 크기가 작은 경우 문제 해결에는 P0 콜로니를 T-75 대신 T-25 플라스크로 계대시켜 세포 밀도를 증가시키는 것이 포함될 수 있습니다.

기술이 숙달되면 생성된 BOEC는 내피 세포 생물학의 시험관 내 연구, 질병 모델링 및 약물 스크리닝, 생체 내 세포 이식 요법을 포함한 여러 응용 분야에서 사용할 수 있습니다. 모든 세포 치료 과정의 개발에서 중요한 고려 사항은 병원성 돌연변이가 없는 세포를 사용하는 것입니다. 우리는 이전에 프로토콜을 사용하여 분리된 BOEC가 복제 수 변이가 없는 게놈을 가지고 있으므로 수집된 개인을 대표한다는 것을 보여주었습니다. 또한, 우리는 또한 대부분의 BOEC 유래 iPSC 계통이 복제 수 변이가 없음을 입증했습니다. 13 이것은 섬유아세포 유래 iPSC의 복제 수 변이에 대한 이전 보고와 대조됩니다. 현재까지 이러한 세포는 이러한 수준의 게놈 충실도가 보고된 유일한 iPSC로 남아 있습니다. 이 기능은 iPSC 생물학 분야와 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 향후 세포 이식 요법에서 iPSC를 사용하는 데 중요합니다.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 영국심장재단(British Heart Foundation, BHF), 공룡 트러스트(Dinosaur Trust), 맥알파인 재단(McAlpine Foundation), 재단 르덕크(Fondation Leducq), 파이트 포 사이트(Fight for Sight), 케임브리지 생물의학 연구 센터(Cambridge Biomedical Research Centre), 국립 보건 연구소(National Institute of Health Research)의 지원을 받았으며, (i) BHF 옥스브리지 재생 의학 센터(BHF Oxbridge Centre of Regenerative Medicine) [RM/13/3/30159], (ii) BHF 케임브리지 연구 우수성 센터(BHF Cambridge Centre of Research Excellence), (iii) 애든브룩스 병원(Addenbrooke's Hospital), 케임브리지 대학 병원 NHS 재단 신탁(Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust) 및 (iv) 팹워스 병원(Papworth Hospital) NHS Foundation Trust를 신뢰하고 Cambridge NIHR BRC Cell Phenotyping Hub를 지원했습니다. MLO는 BHF Intermediate Fellowship에서 자금을 지원합니다. FNK는 BHF PhD Studentship의 자금 지원을 받습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
혈액 채취용
60ml 주사기(luer-lok 팁 포함BD309653
19G Surflo 날개 주입 세트TerumoSV-19BL
50ml 원추형 원심분리기튜브 StarLabE1450기증자 당 2
구연산나트륨Martindale Pharmaceuticals270541
NameCompany카탈로그 번호Comments
For buffy coat isolation
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-03
Dulbecco' s PBS (Ca2+ 및 Mg2+ 제외)Sigma-AldrichD8537
멸균 포장 플라스틱 이송 피펫Appleton WoodsKC231
Turk' s 솔루션Millipore1.093E+09
NameCompany카탈로그 번호Comments
세포 배양, 계대 태징 및 동결 세포
Type 1 콜라겐(쥐 꼬리에서 유래)BD Biosciences35-4236
둘베코' s PBS (Ca2+ 및 Mg2+)제외)Sigma-AldrichD8537
0.02M 아세트산 약 등급의 물에서 준비된Sigma-AldrichA6283
Endothelial Growth Medium-2MV
(Bullet Kit 포함, 혈청 제외)		LonzaCC-3202참고: 매체에 헤파린이 포함되지 않아야 합니다.  
사용하지 마십시오 EGM-2.
소 태아 혈청(미국), 정의된HycloneSH30070
10x Trypsin EDTAGibcoT4174사용 전에 PBS에서 1배로 희석
열 비활성화 FBSGibco10500-064
DMEMGibco41965-039
DMSOSigma-Aldrich276855
Nalgene Mr. Frosty 냉동 용기Sigma-AldrichC1562
NameCompany카탈로그 번호Comments
유세포 분석
FITC-conjugated mouse anti-human CD14BD Biosciences555397마우스 IgG1k, 클론: WM59
희석: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD31BD Biosciences555445Mouse IgG1k, 클론: WM59
희석: 1:20
APC-conjugated mouse anti-human CD34BD Biosciences555824Mouse IgG1k, 복제: 581/CD34
희석: 1:20
FITC-conjugated mouse anti-human CD45BD Biosciences560976Mouse IgG1k, 복제: HI30
희석: 1:20
  APC-접합 마우스 항-인간 VEGFR2R& D SystemsFAB357A마우스 IgG1, 클론: 89106
희석: 1:10
FITC-conjugated mouse IgG1k isotype controlBD Biosciences555748Clone: MOPC-21
Dilution: 1:20
APC-conjugated mouse IgG1k isotype controlBD Biosciences555751Clone: MOPC-21
희석: 1:20
APC 복합 마우스 IgG1k isotype controlR& D SystemsIC002A
희석: 1:10		클론: 11711
EDTA, 0.5M 용액Sigma-AldrichE7889
NameCompany카탈로그 번호Comments
>면역형광 현미경 검사용 
Corning Costar 24-well 조직 배양 플레이트Sigma-AldrichCLS3527
파라포름알데히드Sigma-Aldrich158127
BSASigma-AldrichA7906
폴리소르베이트 20Sigma-AldrichP2287
단클론 마우스 항인간 CD34 항체R& D 시스템MAB72271클론 756510, IgG1, 10 &mu에서 사용; g/ml
폴리클로날 염소 항인간 VE-cadherin (CD144)R& D SystemsAF938항원 친화도 정제 IgG, 1:300
단클론 토끼 항 인간 Von Willebrand Factor (vWF)Abcamab154193클론 EPSISR15, 1:250
당나귀 항 마우스 IgG (H + L) 2 차 항체, Alexa Fluor 488 conjugateLife TechnologiesA-21202Polyclonal, 2 mg / ml, 1:200
당나귀 anti-goat IgG (H + L) 2 차 항체, Alexa Fluor 488 conjugate에서 사용Life TechnologiesA-11055Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 568 conjugateLife TechnologiesA-10042Polyclonal,  2 mg/ml, 1:200
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)Sigma-AldrichD95421 &mu에서 사용; g/ml
) 개 시

참고문헌

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