방법 논문

비례 형광 현미경으로 Phagosome 산도 측정

DOI:

10.3791/53402

⸱

2015년 12월 7일

 ,  , 
1Department of Cellular Physiology and Metabolism, University of Geneva

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phagosomal pH는 식좀 성숙, 산화제 생성, 식체 사멸 및 항원 제시에 영향을 미칩니다. 여기에서는 형광 현미경을 사용하여 살아있는 식세포에서 개별 식체의 시간 경과 및 종말점 pH 변화를 측정하기 위한 비율계량 방법을 설명합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

식균 작용은 선천성 면역 세포를 죽이거나 무력화 섭취 자료를, 또는 항원으로 제시하고 적응 면역 반응을 시작하기 위해 박테리아, 세포 사멸 세포 또는 다른 이물질을 삼켜 통해 기본적인 과정이다. phagosomes의 pH는 endomembranes 및 단백질 분해 효소, 식세포 공포가 degradative 세포 기관으로 성숙 할 수 있도록 이벤트의 활성화와 분열 또는 융합을 조절하는 중요한 매개 변수입니다. 또한, H +의 전위의 다른 숙주 조직으로 효율적으로 사멸에 필수적인 시그널링되어 반응성 산소 종 (ROS), 높은 수준의 생산을 위해 필요하다. 많은 세포 내 병원균, phagosomal 산성화를 제한 phagosome 생물학에서의 pH의 중요성을 강조 식세포 살해를 파괴. 여기에 우리가 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC)를 사용하여 호중구에 phagosomal의 산도를 측정하는 비율 계량 방법을 설명은 식세포의 TARG으로 모산를 - 표지ETS, 라이브 셀 이미징. 분석은 490 nm에서 여기 때 단일 염료, 오히려 절대 형광보다, pH에 의존하는 비율의 정량화를 허용, 440 nm에서 흥분하지 않을 경우 산성 pH에 의해 급냉 FITC의 형광 특성을 기반으로합니다. 현장 염료 교정 및 실제 pH 값에 대한 비율의 변환에 수행하기위한 세부적인 프로토콜도 제공됩니다. 그들은 같은 표백 등의 교란에 덜 민감로 단일 염료 비율 계량 방법은 일반적으로 단일 파장 또는 이중 염료 의사 비율 계량 프로토콜 우수 고려, 측정 된 신호를 왜곡 변화, 레이저 변화, 고르지 라벨, 초점을 맞 춥니 다. 이 방법은 용이하게 다른 포식 세포 유형에서의 pH를 측정하기 위해 수정 될 수 있으며, 자이 모산 불활성 비드에서 살아있는 미생물, 기타 아민 - 함유 입자에 의해 대체 될 수있다. 마지막으로,이 방법은 다양한 범위의 pH 또는 다른 phagosom 민감한 다른 형광 물질을 사용하도록 구성 될 수있다알 활동, 그것은 phagosomes의 기능 이미징을위한 일반화 된 프로토콜 만들기.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선천성 면역 세포가 큰 입자를 집어삼키는 과정인

Phagocytosis는 단세포 유기체의 섭식 메커니즘에서 진화했으며, 표적에 결합하고, 막으로 감싸고, 막을 꼬집어 잡아 세포질 내에 식체(phagosome)라고 하는 액포를 형성하는 과정을 포함합니다. 식체막은 원형질막에서 파생되지만, 활성 단백질 및 지질 분류는 물론 식체체 형성 중 내막과의 융합을 통해 식체를 세포 내에서 섭취된 물질의 사멸, 중화 및 분해를 허용하는 분해 특성을 가진 뚜렷한 세포소기관으로 변환합니다1-3. phagosomal maturation이라고 하는 이 과정은 전자를 강력한 산화제 O2 및 그 유도체 반응성 산소 종 (ROS) 2,4를 생성하는 phagosome으로 전자를 전달하는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산염 (NADPH) 산화효소를 포함한 단백질 분해 및 살균 효소의 호스트에 의존합니다.

식체의 내강 pH는 식솜 기능에 필요한 여러 이벤트에 지대한 영향을 미칩니다. 첫째, pH는 일반적으로 내막의 이동에 영향을 미치는데, 막관통 조절인자의 pH 의존적 구조적 변화는 Arfs, Rabs 및 소포 외피 단백질과 같은 이동 결정 요인의 모집을 변화시키며, 이는 다시 어떤 소포가....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

윤리 선언문 : 모든 동물의 조작이 제네바 대학의 동물 연구위원회의 지침을 엄격히 준수 하였다.

식세포 대상 1. 준비

  1. 10 ml의 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)에 건조 모산 20 mg을 추가합니다. 10 분간 끓는 수욕에서 와류 및 열. 5 분 2,000 XG에 시원하고 원심 분리기.
  2. 물 목욕 초음파기에서 10 분 동안 상층 액 1 ml의 PBS에 재현 탁하고 초음파 처리를 제거합니다. 두 개의 1.5 ml의 튜브에 500 μl를 전송합니다. 5 분 동안 11,000 XG에 원심 분리기.
  3. 500 μL PBS로 세척을 반복합니다. 자이 모산 비등 냉동 -20 ℃에서 보관, 분주 될 수있다.
  4. 갓 CO 3 0.1 M 나 2를 준비 500 μL, pH가 9.3로 위 (단계 1.2)에 두 번 모산을 씻으십시오.
  5. 최종 세척 후 490 μL에 재현 탁. 10 mg을 10 μl를 추가 / FITC 디메틸 sulfoxid에 용해 ㎖로E (DMSO), 소용돌이, 호일로 커버하고, 실온에서 4 시간 동안 교반 품어.
  6. 처음으로 0.5 ml의 DMSO + 300 μL PBS, 0.5 ml의 D....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다음 실험에 대한 대표적인 결과 어디에 야생형 또는 골수에서 분리 한 기본 마우스 호중구의 phagosomal 산도 Hvcn1 - / - 마우스를 비교 하​​였다. 성공적인 실험을 위해, 그것은 나중에 이미지 분석 동안 세그먼트에 더 어려울 것이다 너무 많은 phagosomes을 회피하면서, 저속 동영상의 전체 지속 기간 동안 시야 내에 충분히 phagosomes를 획득하는 것이 중요하다. 1은 도표 좋고 나쁜 confluencies의 예. 시간에 따른 스냅 샷 분석을 위해, 외부 모산 입자는 phagosomes 구별 및 분석에서 제외해야합니다. 2 명 시야 이미지 phagosomes에서 외부 모산 입자를 구별 할 수 있도록하는 것이 유용 할 수있는 방법을 보여줍니다. 그림 3은 전형적인 phagosome의 예를 보여줍니다 Hvcn1에 비해 야생형에서 산도 시간 코스.......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

더 많은 시간이 목표물에 커플 링하여 pH 민감성 염료의 사용과 유사한 방법을 적용하지만 phagosomes의 모집단의 평균 pH는 예컨대 분광 측정과 같은 다른 방법 FACS,보다 많이 소요되었지만, 현미경은 몇 가지 장점을 제공한다. 우선 내부와 외부가 내면화 구속,하지만 것입니다, 입자는 쉽게 각각 소멸 또는 외부 입자에 라벨을, 같은 트리 판 블루 또는 항체와 같은 다른 화학 물질을 추가 할 필요없이 구별 할 수 있습니다. 둘째 실시간으로 세포를 수행하면 연구자가 동시가 인구 기반 방법으로 간과 될 수있는 반면 너무 마이그레이션, 감지 및 결합 입자에 미치는 영향은 쉽게, 여기에 식별 할 수있는 식세포 과정의 여러 측면을 관찰 할 수 있다는 것입니다. 또한, 식균 작용의 개시의 동기화, 자주, 더 인해 차가운 충격 40, 41로 다른 인신 매매 이벤트를 교란 할 수 4 ° C에서 배치 세포에 의해 수행되지시간 제로 필요한 t을 직접 식별 할 수 있습니다. 라이브 현미경을 수행 할 때 실제로,이 4 °.......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 스위스 국립과학재단(Swiss National Science Foundation)의 운영 보조금 N° 31003A-149566(N.D.)과 젊은 연구자 보조금(Young Investigator Subsidy)을 통해 쥘 쏜 경(Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust)의 재정 지원을 받고 있다.

....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Zymosan A 분말Sigma-AldrichZ4250다양한 공급 업체가 존재합니다
Fluorescein isothiocyanateSigma-AldrichF7250다양한 공급 업체가 존재합니다
Anti-zymosan 항체 (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent)LifeTechnologiesZ2850Sigma-Aldrich O6637은 동등한 제품입니다. 또는 25% 혈청을 옵소니징 시약으로 사용할 수 있습니다.
4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH)Santa Cruzsc-204107독성, 장갑 사용, 다양한 공급자 존재
Diphenyleneiodonium chloride (DPI)Sigma-AldrichD2926독성, 장갑 사용, 다양한 공급자 존재
Concanamycin A (ConcA)Sigma-Aldrich27689독성, 장갑 사용, 다양한 공급자 존재
NigericinSigma-AldrichN7143독성, 장갑 사용, 다양한 공급자 존재
MonensinEnzoALX-380-026-G001독성, 장갑 사용, 다양한 공급자 존재
인산염 완충 식염수(PBS)Life Technologies14200-075독성, 장갑 사용, 다양한 공급자 존재
Hank's balance salt solutionLife Technologies14025092Ringer's balanced salt solution 또는 기타 명확한 생리학적 완충액 대체됩니다.
탄산나트륨 (Na2CO3)Sigma-AldrichS7795다양한 공급자가 존재합니다
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)Sigma-AldrichM3671 다양한 공급자가 존재합니다
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)Sigma-AldrichH3375다양한 공급업체가 존재합니다
. N-Methyl-D-glucamine (NMDG)Sigma-AldrichM2004 다양한 공급자가 존재합니다
에틸렌 글리콜 -비스 (2- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N&프라임 , N 프라임 - 테트라 아세트산 (EGTA)시그마 -알드리치3777다양한 공급 업체 존재
트리스 (하이드 록시 메틸) 아미노 메탄 (트리스)시그마 알드리치T1503 다양한 공급자가 존재합니다
염화칼륨 (KCl)Sigma-AldrichP9333다양한 공급자 존재
염화나트륨 (NaCl)Sigma-AldrichS7653다양한 공급자 존재
염화마그네슘 (MgCl2)Sigma-AldrichM8266다양한 공급자 존재
절대 에탄올 (EtOH)Sigma-Aldrich2860다양한 공급자 존재
유리 바닥 35mm 페트리 접시 (불소)World Precision InstrumentsFD35-100Ibidi µ - 적절한 이미징 챔버가있는 투명 접시 또는 커버 슬립을 사용할 수 있습니다
초음파 처리 수조O. Kleiner AG초음파 처리기를 대신 사용할 수 있으며 다양한 기기 제공 업체가 존재합니다
HeamocytometerMarienfeld GmbH다양한 기기 제공 업체가 있습니다
.광시야 실시간 이미징 현미경Carl Zeiss AG다양한 기기 공급업체가 존재하지만 현미경은 440/535 및 490/535 여기/방출을 기준으로 이미징할 수 있어야 합니다. 명시야 기능이 있는 스피닝 디스크 컨포칼 셋업이 대체될 수 있지만 자이모산은 더 자주 초점에서 벗어나는 경향이 있습니다.   
연동 펌프 (Dynamax RP-1)Rainin다양한 기기 제공업체 존재
pH 측정기Schott Gerate GmbH다양한 기기 공급업체 존재
Manual CounterMilian SA다양한 기기 공급업체 존재
...

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yeung, T., Grinstein, S. Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis. Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).
  2. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
  3. Fairn, G. D., Grinstein, ....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

FITCpH

관련 논문