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방법 논문

암 세포 회전 타원체 분석은 3D 설정에 침략을 평가하기 위해

33.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53409

⸱

2015년 11월 20일

 ,  ,  , 
1Lombardi Comprehensive Cancer Center, Department of Oncology, Georgetown University, 2Department of Biomedical Sciences, University of Minnesota

이 논문에서

요약

이 방법은 스페로이드에서 주변 3D 매트릭스로의 암세포 침입을 평가합니다. 스페로이드는 행잉 드롭 배양 방법을 통해 생성된 다음 기저막 재료와 I형 콜라겐으로 구성된 매트릭스에 내장됩니다. 이후에 스페로이드 외부로의 침입이 모니터링됩니다.

초록

암 세포주의 침습적 특성은 전이 가능성과 상관관계가 있는 것으로 생각됩니다. 그러나 대부분의 기존 분석은 3차원 환경에서 이러한 침입 특징을 검사하지 않으며 결과 데이터는 생물학적 적용 가능성이 감소합니다. 여기에서는 생리학적으로 관련된 환경에서 세포주의 침습 능력을 시각화하기 위한 접근 방식이 제시됩니다. 암세포 스페로이드 침입 분석은 먼저 중력을 활용하여 세포 배양 접시의 뚜껑에 매달려 있는 배지 방울 내에서 스페로이드를 생성합니다. 다음으로, 이러한 스페로이드는 기저막 재료와 I형 콜라겐의 혼합물로 구성된 3D 매트릭스에 내장되어 있습니다. 그런 다음 스페로이드에서 주변 기질로의 암세포 침투를 시간이 지남에 따라 모니터링합니다. 여기에 설명된 방법은 서로 다른 세포 유형의 공동 배양, 약물/억제제의 포함 또는 세포외 기질(ECM) 구성 요소의 변형 후 침입을 조사하기 위해 수정할 수 있습니다.

서론

그것은 암 세포의 운동성이 같은 행동이 순환 시스템 1에 기저막과 항목을 통해 침입을 용이하게 주어진, 전이 가능성의 예측이라고 설정됩니다. 운동성에 가장 연구가 광범위하게 3 차원 매트릭스에서 세포의 이동 것 실제로 방법이 동일 세포보다 대표 인 것으로 인식되고있다하더라도 세포가, 2 차원 (2D) 환경에서 동작하는 방법에 초점을 맞추었다 생체 2에서 작동합니다. 3 차원 배양 시스템은 점차 성장 역학 및 약물 감수성 3, 세포 형태의 범위 셀룰러 동작을 연구하기 위해 사용된다. 3 차원 환경의 컨텍스트 내에서 암 세포 침입을 모니터링하는 욕구는 3 차원 세포 내로 이러한 타원체 매립 하였다 매달려 드롭 배양법 (4)를 통해 3 차원 세포 집합체 (타원체)의 생성을 포함하는 이전에 확립 된 기술을 합성하게되었다 매트릭스 (ECM) 콜라겐과 기저막 재료 (5)으로 구성. 이 방법은 쉽게 실험 다양한 조건 하에서 내습과 비교하기 위해 이용 될 수있는 간소화 된 방법을 제공함으로써 이전에 확립 된 기술을 개선하고자한다.

체외에서 세포 운동성을 평가하는 전통적인 방법은 스크래치 상처 분석 및 트랜스 웰 분석 (6)이다. 전 분석은 2 차원 환경에서 세포 운동성을 도시 한 생체 침입에 중요한 다양한 기능, 예를 들면 프로테아제 활성 7 그러므로 독립적이다. 트랜스 웰 분석은 웰 인서트가 대향 막 표면에 세포의 모양, 즉 ECM 기재하지만, 단 하나의 파라미터를 더 모델 세포 침윤 코팅 할 수있을 때를 측정하고, 세포 침윤의 많은 뉘앙스 따라서 용이하게 관찰 할 수없는된다. 이러한 기술, 암세포 침윤 타원체 분석 (도 1 <대조적/ 강해>) 만 생리 관련이없는 환경에서 세포 침윤의 실시간 모니터링을 허용하지만, 또한 이러한 집단 대 개인 세포 이동 8로서 가시화 될 중요한 세포주 특정 기능을 허용한다. 이 방법은 표준 3 차원 배양 성장 분석보다 이점을 제공한다. 세포는 이러한 제한이 해제 된 후 침입하는 인센티브되도록 매달려 드롭 방법을 통해 세포 응집체의 생성은 처음에 세포의 움직임을 제한한다. 그 제약 조건이 해제되면 또한, 세포 출구는 편리하게 정량 할 수있는 일정한 방향으로 진행됩니다.

암세포 타원체 분석법에 가장 널리 사용되는 재료는 ECM의 Matrigel하고 이러한 구성 요소들의 각각은 전이 거동에 영향을 미치는 중요한 역할과 구별 갖는 경우 타입 I 콜라겐. 마트 리겔은 Engelbreth-Holm이 운집 마우스 육종 세포에 의해 생산 된 단백질의 분비 혼합물이며, baseme에 충실이러한 라미닌, entactin 및 제 4 형 콜라겐 (9)와 같은 NT를 막 단백질. 이 때문에 마트 리겔은 이제부터라고 "기저막 물질."이 기저막 물질은 세포의 행동 (11) 상에 다양한 효과를 발휘하는 다른 많은 단백질 외에 암세포 침윤 (10) 중 접착 인테그린에 필요한 필수적인 리간드를 제공한다. 비교하면, 일반적으로 힘줄 등 치밀한 콜라겐 구조 (12)의 산으로부터 제조 다이제스트 I 형 콜라겐은, 본체의 결합 조직과 기질지지 조직과 기관의 주요 구조적 요소로서 기능 훨씬 단순 매트릭스 물질이다. 이것은 콜라겐의 물리적 특성은 세포 운동성의 기능의 수를 조절할 수 있음을 입증되었다; 예를 들어, 종양 - 기질 계면에서 콜라겐 섬유의 배향은 기질 (13)에 침입 할 때 그 다음에 피 브릴을 따라 이동하는 암세포를 허용. 여기에 제시된 분석에서는 두 종류의 난 콜라겐과 기저막 재료는 3D 암 세포 - 기질 상호 작용을 연구하는 도구로 사용된다.

세포를 3 차원 매트릭스에 매립 한 후 침입이 모니터링 될 수 제어 경로의 억제 또는 자극의 효과. 세포 매달려 방울 또는 긴 치료가 침공을 조절해야합니다 여부에 따라 3D 문화로 전송시 성장하는 동안 전처리 할 수​​ 있습니다. 짧은 치료를 들어, 약물이 컬렉션 후 타원체 서스펜션뿐만 아니라 셀에 충분한 약물 노출을 용이하게하기 위해, 3 차원 배양을 둘러싸 매체와 혼합하는 것을 추천합니다. 다음에, 정상 또는 종양 - 관련 기질 세포는 종양 세포의 침윤을 변조에서의 역할을 평가하는 방법 또는자가 분비 및 주변 분비 신호의 영향 세포 행동 결정하는 매트릭스 물질과 혼합 될 수있다. 이 아이디어는 연구에 나타내었다 곳 (COL)의 공 배양암 매달려 방울의 내피 세포에 회전 타원체 (14) 내의 혈관 네트워크되었다. 암세포 침윤이 다른 기판 (15)에 의해 영향을 마지막으로, ECM 성분은 또한 변경 될 수있다. 아래에 제시된 방법에 따라서 다양한 조건 하에서 암 세포의 침윤을 평가하기위한 프레임 워크를 제공한다. 일반적으로 모든 세포주가 걸려 방울에 타원체를 생성하고 상피 보이는 세포주는 일반적으로 일반 구를 형성하지 않는 것이 발견되었다.

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프로토콜

타원체의 1 세대

  1. PBS를 사용하여 70 %의 합류 ~의 부착 암 세포 배양을 분리하여 드롭 문화를 걸려 위해 단일 ​​세포 현탁액을 준비 0.05 % 트립신 EDTA 용액에 노출 된 다음에 씻으십시오.
    1. 세포 배양 배지와 트립신 용액을 중화하고 세포 현탁액의 분취 량을 사용하여 세포를 카운트. 주 : 세포주에 달려 특정 세포 배양 배지는 테스트중인. 세포 배양 배지는 일반적으로 DMEM + 10 % FBS이고, ATCC 미디어 권장 사항을 따르십시오. 자세한 내용은 표 재료에서 찾을 수있다.
    2. 세포 배양 배지를 20 μL 방울 당 500 ~ 1,000 세포 시딩 있도록 희석을 수행한다.
  2. 10cm 접시를 취득하고 아래로 멸균 PBS의 5 mL를 추가 할 수 있습니다. 참고 :이 단계는 교수형이 증발에서 떨어 보호합니다. 저비용 "세균 등급"요리, 세포 배양 등급 요리 대신에 사용될 수있는 바와 같이, 세포를 계속하지 않을 것이다문화 표면 역할을합니다.
  3. 뚜껑의 내면에 희석 된 세포 현탁액 20 μL 방울을 전송하는 멀티 채널 피펫을 사용한다.
    1. 피펫 (40)는 10cm 접시의 뚜껑에 (8 방울의 5 행)을 삭제합니다.
  4. 배양 접시 위에 뚜껑과 장소를 반전. 스페 로이드를 생성하기 위해 72 시간 동안 37 ℃에서 배양 매달려 드롭 부화.
    1. 자신감, 아직 통제 된 방식으로 뚜껑을 뒤집습니다. 참고 : 너무 빠르거나 너무 느린 뚜껑을 반전하면 물방울이 이동하는 원인이 될 수 있습니다. 다른 소형 응집체를 생성하기 위해 72 개 이상의 시간을 요구할 수 있지만 어떤 세포주는 48 시간 이내에 구 상체를 형성 할 수있다.

3D 매트릭스에 타원체 2. 임베딩

  1. 밤새 스페 로이드를 매립하기 전에 4 ℃에서 성장 인자 - 감소 된 기저막 물질의 분취 량을 해동.
    1. 옵션 : 사전에 ECM와 레이어 우물은 조직 cultu 잠재적 회전 타원체의 상호 작용을 방지하기 위해표면 재.
      1. 24 웰 플레이트에 웰 당 ECM의 피펫 200 μL.
      2. ECM은 전체 잘 표면을 커버하도록 판을 기울.
      3. 조심스럽게 피펫으로 초과 ECM을 제거합니다.
      4. 3 시간 실온에서 또는 4 박 ° C에서 : 우물이 건조 될 때까지 판을 품어.
  2. 조직 배양 접시의 뚜껑을 틸팅 및 미디어를 풀링하여 타원체를 수집한다. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 회전 타원체와 미디어를 전송합니다.
  3. 타원체가 microcentrifuge 관의 바닥에 정착하는 10 분을 허용합니다. 타원체는 눈으로 볼 수 있어야합니다.
  4. . 감기 (4 ° C를) 100 ㎕ 내가 별도의 사전 냉각 튜브에 콜라겐 유형의 기저막 재료의 100 μl를 혼합 조기 응고에서 중 젤을 방지하기 위해 4 ° C에서 혼합물을 유지합니다.
    1. 작은 볼륨을 전송하는 경우 사전 냉장 피펫 팁을 사용합니다.
    2. 때주의를 줘I가 기포 형성을 방지하기 기저막 재료 및 콜라겐 형 혼합. 주 :이 겔에 매립 될 경우 기포 프로토콜 뒷부분 이미징을 방해 할 수있다.
  5. microcentrifuge 관의 40 μL 바닥 부분에서 타원체를 대기음, 나는 혼합물을 콜라겐 기저막 재료 / 유형과 결합. 혼합 할 때 기포 형성을 방지하기 위해주의해야합니다. 주 : 용액 100 μL 콜라겐 유형 I 및 타원체 40 μL 4 3D 배양 독립적 충분한 물질을 생성, 100 μL 기저막 재료 함유. 이 스케일 업 또는 다운 할 수 있습니다.
  6. 피펫 24 웰 플레이트에 웰의 중심에 점성 혼합물의 40 μl를 삭제합니다. 웰의 측면에 실행 혼합을 방지하기 위해 플레이트를 수평으로 유지. 참고 : 24 웰 플레이트에 하나의 열 - 4 웰 - 각 조건 테스트 할 것을 권장합니다.
  7. 판 INT 배치OA 37 ° C 배양기에서 30 분 동안 그대로 둡니다. 3D 문화는이 기간 동안 중합합니다.
  8. 서서히 세포 배양 배지 1 ㎖로 3 차원 배양 잠수함.
    1. 또한 겔 중합을 촉진하기 위해 우물에 그것을 추가 할 때 미디어가 따뜻한 있는지 확인합니다.
    2. 중요한 단계 : 부드럽게 3D 문화에 미디어를 추가 할 수 있습니다. 우물에 너무 빨리 미디어를 피펫은 조직 배양 표면에서 3D 문화의 분리로 이어질 수 있습니다.

3. 모니터링 및 회전 타원체 침공 분석

  1. 연구자에 의해 결정 시간 지점에서 주변의 3D 매트릭스로 회전 타원체에서 이미지 침공. 20 배 대물 렌즈와 거꾸로 현미경을 사용하여 사진을 획득. 주의 : 이상적 시간 - 포인트는 테스트되는 세포주에 따라 다를 것이다. 더 침습적 세포주는 곧 도금 후 타원체에서 자신의 출구를 시작하고, 따라서, 초기 사진을 취할 것입니다도금 후 몇 시간 이내의. 일반적으로, 사진은 (도금 후) 0 시간, 24 시간, 48 시간에서 가져옵니다. 침략은 일반적으로 도금 후 24 시간 내지 48을 마칩니다.
  2. 이미지 J. 같은 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 침입 능력을 정량
    1. 회전 타원체의 가장자리에서 셀 거리로 침략을 분석합니다.
      1. 반경 및 / 또는 최대 침략 거리를 표시하기 위해 직선 그리기 도구를 사용합니다.
      2. 길이 측정을 표시하는 "측정"을 상단 메뉴의 "분석"을 선택한 후 클릭합니다.
    2. 회전 타원체 외부 총 침략 영역으로 침략을 분석합니다.
      1. 회전 타원체 및 / 또는 총 침략 영역의 경계를 추적 자유형 그리기 도구를 사용합니다.
      2. 지역 측정을 표시하는 "측정"을 상단 메뉴의 "분석"을 선택한 후 클릭합니다.
    3. 이미지의 스택에 대한 측정을 만드는 데 투자 수익 (ROI) 관리자 도구와 같은 플러그인을 사용합니다.

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결과

회전 타원체 침입 분석을 이용하여 (도 1), 암 세포주의 패널뿐만 아니라, 기저막 재료 및 타입 I 콜라겐으로 이루어진 3 차원 매트릭스로 주입 후에 나타나는 셀 출구의 양 구 상체를 형성하는 능력에 대해 시험 하였다 (표 1). 이 결과는 모든 암 세포주가 시험 관내 상피 형태를 갖는 세포주 정규 매끄러운 골재를 생산하는 경향이 잘 형성된 타원체를 생성 함을 입증한다하지. 검정에 침입하는 상이한 세포주의 능력은 또한 변수였다. 4T1, E0771, 및 U-87 MG 같은 침습적 인 것으로 확립 세포주를 분석에서 회전 타원체 출구의 높은 정도를 나타낸다. 예상 된 바와 같이 덜 공격적인 세포주, MCF-7과 같이, BT474 및 MCF10DICS.com가 침입하지 않았다. 예기치 그러나, A-431, 357 COLO P​​L 세포 침윤에 의해 디스플레이의 부재였다. 이들 중 일부에 대한 데이터의 일례선 (그림 2) 표시...

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토론

본 연구는 회전 타원체 침윤 분석 (표 1) 암 세포주 패널의 성능을 평가 하였다. 일반적으로, 우리는 회전 타원체 형성 세포 간 접합이 존재 타원체 형상 구조의 형성을 촉진 더 상피 생긴 세포주에서 향상되는 것을 발견한다. MDA-MB-231 세포와 같은 상피 - 간엽 전환을받은 알려진 세포주, 그들의 감소 E-, N- 및 P-cadherin의 발현 16에 가장 가능성이 매달려 드롭 문화 타원체를 형성하지 않는다.

회전 타원체 침공 분석의 단계 중 일부는 프로토콜에 가까운 부착을 필요로한다. 그것은 기저막 콜라겐 혼합물을 피펫 팅 할 때 빨리 작동하도록 절대적으로 중요하며, 이것은 하나의 상온에서 고화하기 시작하므로 작동하면서 4 ° C 부근의 혼합물을 유지하는 것이 중요하다. 또한, 수용성 콜라겐 제제는 산성이며, 되어온 겔에 의해 유도수산화 나트륨 염 및 소량의 이온을 37 ℃로 가온 하였다. 우리 손에 단순히 기저막 물...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

NIH 보조금 P30의 CA051008 및 CA009686 T32 (ATR)에 의해 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Matrigel 성장 인자 감소CorningCB-40234
콜라겐 타입 I, 랫 테일, 100 mgMillipore08-115
DMEMLife Technologies11995-065
RPMI 1640 중간 Life Technologies11875-093
PBSLife Technologies10010-023
0.05% 트립신-EDTALife Technologies25300-054
소 태아 혈청, 열 비활성화Omega ScientificFB-12
100mm TC 처리 접시Corning Incorporated430167
24웰 TC 처리 플레이트NEST 생명공학학702001
Olympus IX-71 도립 현미경
세포주는 RPMI + 10% FBS에서 mantained 된 BT-474 및 LNCaP 세포를 예상하여 DMEM + 10% FBS에서 유지되었습니다.

참고문헌

  1. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).
  2. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).
  3. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), (2007).
  4. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 51, (2011).
  5. Del Duca,, Werbowetski, D., T,, Del Maestro,, F, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).
  6. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. 88, (2014).
  7. Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion. J Bio Chem. 274 (19), Forthcoming.
  8. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  9. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
  10. Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. Function of the integrin α6β1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor. Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).
  11. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), (2010).
  12. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), (2006).
  13. Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), (2006).
  14. Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
  15. Brenner, W., Groß, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Thüroff, J. W. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).
  16. Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol. 147 (3), Forthcoming.
  17. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), (2013).
  18. Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration. BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).
  19. Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix. J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).
  20. Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models. Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).

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