염색질 면역 침전은 DNA가 생체 내에서 애기 단백질의 결합 부위의 식별을위한 강력한 기술이다. 이 절차는 염색질 가교과 분열, 관심의 단백질에 선택적 항체와 면역과 결합 된 DNA의 qPCR에 분석을 포함한다. 우리는 애기 장대 식물에 최적화 된 간단한 칩 분석에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
복잡한 유전자 조절 네트워크는 식물의 생물학적 과정과 발달 전환을 조율합니다. 유전자의 선택적 전사 활성화와 침묵은 환경 신호와 발달 신호에 대한 식물의 반응을 매개합니다. 따라서 식물 유전자 발현을 제어하는 메커니즘에 대한 통찰력은 식물에서 생물학적 과정이 어떻게 조절되는지에 대한 깊은 이해를 얻는 데 필수적입니다. 여기에 설명된 염색질 면역침전(ChIP) 기술은 모델 종 Arabidopsis thaliana의 유전자 또는 게놈 영역에서 단백질의 DNA 결합 부위를 식별하는 절차입니다. 전사 인자(transcription factor), 염색질 단백질(chromatin protein) 또는 번역 후 변형된 히스톤 버전과 같은 관심 단백질의 DNA와의 상호 작용은 ChIP 프로토콜로 효율적으로 분석할 수 있습니다. 이 방법은 in vivo에서 단백질-DNA 상호 작용의 고정, 염색질의 무작위 단편화, 특정 항체를 가진 단백질-DNA 복합체의 면역침전, PCR 기술에 의한 관심 단백질과 관련된 DNA의 정량화를 기반으로 합니다. 애기장대에서 이 방법론을 사용하는 것은 다양한 식물 생물학적 과정을 제어하는 전사 조절 메커니즘을 밝히는 데 크게 기여했습니다. 이 접근법을 통해 애기장대 염색질 단백질 EBS의 결합 부위를 개화 FT의 마스터 유전자 조절 영역에 확인할 수 있었습니다. FT의 게놈 영역에서 특정 히스톤 마크의 축적에 대한 이 단백질의 영향은 ChIP 분석을 통해서도 밝혀졌습니다.
서론
최근 몇 년 동안, 분자 적 유전자 및 게놈 툴의 다양한 모델 종 애기 장대에서 개발되어왔다. 이 기술은 식물 개발을 규제하는 방법을 이해하는 엄청난 발전을 촉진했다. 모델로 애기 장대를 이용하여 연구 개발 과정 중, 꽃이 피는 시간의 유전 적 제어가 광범위하게 분석하고있다. 이 연구는 식물은 호르몬과 식물의 나이 내생 단서에 대한 응답으로 꽃을 매우 정밀하게 시간을 조절하는 것으로 나타났습니다, 또한 시즌 1의 자연주기와 시간을 꽃 동기화 등 광주 및 온도 등의 환경 신호에, 2. 개화시기의 변화와 애기 돌연변이의 분리 및 특성 규명은 내인성 및 환경 인자에 응답하여 개화시기를 조절하는 유전자의 복잡한 네트워크를 공개에서 결정되었다. 이 유전자 회로는꽃의 스위치로서 작용 몇 마스터 유전자 수준에서 통합 및 꽃 개시의 정확한 타이밍은 개화 촉진 및 꽃 적분기 유전자 1,3 상류 작업 활동을 억압의 균형에 의존한다.
게놈 접근의 최근 사용에 의해 원조 꽃 개시의 제어에서의 역할에 대해 확인 된 유전자의 기능적 특성은, 꽃이 피는 시간의 변조에 전사 조절의 중심 역할을 계시했다. 사실, 꽃 인코딩 전사 마스터 유전자의 대부분은 4 요인. 또한, 크로....
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프로토콜
식물 재료 1. 가교 (1 시간)
- 애기 실험에 사용 된 선 성장 (- WT - 야생형 돌연변이 대를, 및 / 또는 태그를 표현하는 라인 대 관심의 단백질의 태그 버전을 표현하는 라인은 어떤 단백질에 융합되지 않음) 큰 페트리 접시에 12-18일에 대한 (150mm) MS 한천 배지 (1 L : 무라 시게 및 1X 스쿡 염, 10g의 수 크로스, 0.5 g의 MES, pH가 5.7 (KOH), 1 % 아가)와. 토양과 지렁이의 1 혼합 : 또는 3을 포함하는 화분에 식물을 재배한다.
주의! 포름 알데히드는 피부 접촉 및 삼키면, 흡입 독성, 그리고 적절한 개인 보호 장비를 착용 화학 후드에서 처리되어야합니다. 1.2 단계 - 1.6 흄 후드에서 수행되어야한다. - 실험실 버너 가열 바늘 50 ㎖ 튜브의 뚜껑에 작은 구멍을 확인합니다. 1 %의 최종 농도로 1X PBS 40 ml를 첨가하고 완충 포름 알데히드 1.08 ㎖ (스톡 37 %의olution). 그 50 ㎖ 튜브에 식물 재료의 1.5 G를 수집합니다. 가교 동안 얼음에 튜브를 유지합니다.
- 뚜껑 50 ml의 튜브를 닫습니다. 데시 케이 터에 튜브를 삽입하고 진공을 적용합니다. 진공 상태를 10 분 동안 조직을 침투 용액을 휘젓는 않도록 조심스....
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결과
여덟 가지 주요 단계는 성장하고 식물 재료, 염색질의 가교, 염색질 격리, 염색질의 분열, DNA와의 복합체의 선택적 분리의 수확을 포함 생체 내 단백질 DNA 상호 작용의 식별을 위해이 칩 프로토콜에 선출 될 수있다 면역 침전, 단백질 분해, DNA 정제와 qPCR의 분석 (도 1)에 의해 관심있는 단백질. 칩 프로토콜에서 중요한 단계는 가교 결합 반응에서 DNA - 단백질 상호 작용의 정착이다. 통상적으로, 포름 알데히드 가교 식물 칩에 사용된다. 포름 알데히드는 조직을 침투 DNA 1 6 NH 2 단백질의 그룹 또는 단백질, 뉴클레오티드 사이의 메틸렌 다리를 만듭니다. 생체 내에서 핵 단백질 복합체의 효율적인 정착 포름 알데히드 식물 핵 내의 염색질에 도달해야하고, 그 식물 조직이 완전히 잠기 t에서 필수적인그는 포름 알데히드 버퍼는 면역 중에 단백질-DNA 복합체가 효율적으로 내려 오게되어 있는지 확.......
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토론
여기에 설명 된 칩 프로토콜은 아라비돕시스 식물의 생체 내에서 단백질과 특정 DNA 서열 사이의 상호 작용을 분석 재현성 강력한 기술이다. 관심의 단백질 결합 부위의 성공적인 식별 관련 상호 작용이 실제로 일어나고있는 식물 기관 또는 발달 단계의 적절한 선택이 필요합니다. 또, 식물 재료의 적절한 고정 및 초음파 처리에 의해 최적의 염색질의 전단을 수득하는 것이 중요하다. 선택한 단백질 / 태그의 효율적인 면역에 매우 특이 항체는 필수적이다.
식물 칩 방식의 사용은 잠재적으로 상이한 프로토콜 단계를 방해 할 수있는 이차 대사 산물 및 셀 벽의 존재와 관련된 어려움에 직면 해있다. 또한, 식물 기관의 복잡성은 종종 다수의 세포 유형을 함유 여기서 INT의 DNA 결합 단백질erest가 차등 존재하거나 활성화 할 수 있습니다,이 방법의 사용을 방해했다. 이 칩에 사용하는 것이 가장 바람직하다 가능한 그 이유로, 관심 단백질의 존재 및 / 또는 활성은 이미 입증되었.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 그림 4에 설명된 대표적인 결과를 정교화하기 위해 이 저널에 발표된 일부 데이터를 사용할 수 있도록 허용한 The Plant Cell에 감사를 표합니다. 이 작업은 EU 7FP Marie Curie-Initial Training Network EpiTRAITS(보조금 계약 316965)와 스페인 경제부 장관(보조금 BIO2010-15589 및 BIO2013-43098-R)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige와 Skoog 기초 소금 혼합물) | Sigma | M5524 | |
| 포름알데히드 37% | Sigma | F8775-25 | 흄 후드 아래에서 사용 |
| 프로테아제 억제제 믹스 cOmplete ULTRA 정제, 미니, EDTA 프리, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor 표준 초음파 처리 장치 | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR 정제 키트 | Qiagen | 28104 | |
| 단백질 A 또는 단백질 G Life Technologies와 결합된 Dynabeads 마그네틱 비드 | 10003D/10001D | 제조사 확인 항체 친화도 | |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton X-100 Surfact-Amps 세제 솔루션 | Life Technologies | 85112 | |
| (마우스, 쥐, 토끼…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| 자기 랙 - DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac 다클론 항체 - 프리미엄 | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteina K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag 항체, 클론 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
참고문헌
- Andres, F., Coupland, G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues. Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).
- Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. Control of flowering by ambient temperature. J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).
- Jarillo, J. A., Piñeiro, M.
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재인쇄 및 허가
