방법 논문

고래 마이오글로빈의 검출을위한 콜로이드 골드 기반 면역 크로마토 그래피 테스트 스트립의 개발

DOI:

10.3791/53433

⸱

2016년 7월 13일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary Medicine, National Chiayi University, 2Department of Microbiology and Immunology/Graduate Institute of Biomedical and Biopharmaceutical Sciences, National Chiayi University

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 고래류의 미오글로빈에 강하게 반응하는 두 개의 IgG 클래스 단클론 항체(mAb)의 개발을 설명합니다. 이러한 mAb는 샌드위치 형식을 기반으로 하는 콜로이드 금 면역크로마토그래피 테스트 스트립에 적용되어 고래류의 Mb를 바다표범 및 다른 동물과 구별합니다.

초록

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이 프로토콜은 고래류의 미오글로빈(Mb)을 바다표범 및 기타 동물의 미오글로빈(Mb)과 구별하는 데 사용할 수 있는 샌드위치 형식을 기반으로 하는 콜로이드 금 면역크로마토그래피 테스트 스트립의 개발을 설명합니다. 이 스트립은 고래류 고기에 대한 신속하고 즉석에서 검사를 제공하여 불법 거래 및 소비를 억제합니다. 고래류의 Mb에 대해 반응성이 있는 두 개의 단클론 항체(mAb)가 개발되었습니다. 두 가지 합성 펩타이드(일반 펩타이드 및 특정 펩타이드)를 설계한 후 mAbs(아분류 IgG1)를 높이기 위해 다양한 동물의 Mb 항원 반응 영역의 아미노산 서열을 분석했습니다. mAb는 간접 ELISA, 웨스턴 블롯 및 점 블롯으로 스크리닝된 하이브리도마에서 선택되었습니다. CGF5H9는 토끼, 개, 돼지, 소, 염소 및 고래류의 Mbs에 특이적이었던 반면, 닭, 참치 및 바다표범의 Mbs에 대해서는 친화력이 약하거나 전혀 없는 것으로 나타났다. CSF1H13 강한 친화력으로 바다표범과 고래류를 묶을 수 있지만 다른 동물에 대한 친화력은 보이지 않았습니다. 이 연구에서는 4개 과(Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae 및 Kogiidae)의 고래류 샘플이 사용되었으며, 그 결과 이 두 mAB는 서로 다른 고래류의 Mbs에 대한 광범위한 결합 능력을 가지고 있음을 보여주었습니다. 이러한 mAb는 샌드위치 유형의 콜로이드 금 면역크로마토그래피 테스트 스트립에 적용되었습니다. 많은 종을 인식하는 CGF5H9는 콜로이드 골드 표지되어 검출 항체로 사용되었습니다. 테스트 구역에 코팅된 CSF1H13는 고래류와 바다표범 Mbs의 존재를 감지했습니다. 참치, 닭, 바다표범, 5종의 육상 포유류 및 15종의 고래류의 근육 샘플을 3회에 걸쳐 테스트했습니다. 모든 고래류 샘플은 양성 결과를 보였고 다른 모든 샘플은 음성 결과를 보였습니다.

서론

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역사적으로 고래류 고기는 세계 여러 지역에서 소비되어 왔으며 이 소비는 오늘날에도 계속되고 있습니다1. 고래류의 영양 수준으로 인해 높은 수준의 수은 및 기타 독소가 고기에 존재하는 것으로 알려져 있습니다2. 따라서 고래류 고기의 섭취는 임산부와 같은 고위험군뿐만 아니라 일반 인구에게도 건강 문제를 일으킬 수 있다3. 또한, 고래류 고기가 인수공통감염성 또는 인수공통감염성 병원체에 오염되는 것도 가공 및 보관 과정에서 발생할 수 있습니다4. 경험 많은 요원조차도 외모만으로 고래 고기를 식별하기가 어렵습니다. 따라서 고래류 고기를 다른 고기와 구별하기 위해서는 신뢰할 수 있는 과학적 식별 방법이 필요합니다. 이것은 고래류 고기의 소비를 제한하는 데 도움이 될 것입니다.

현재 종 식별 방법에는 분자 기술과 면역학적 방법이 포함됩니다. 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 및 DNA 염기서열분석(DNA sequencing)과 같은 분자 기법은날고기5 및 분해된 샘플6뿐만 아니라 조리된 소시지 및 사료7,8와 같은 가공 식품에서도 샘플을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)과 같은 면역학적 방법은 식품 생산에 일반적으로 적용되어 돼지고기9, 쇠고기10 및 메기11의 육류 함량을 검출합니다. 고래류 고기 식별을 위한 PCR 기반 DNA 분석이 가능하며12 일본, 한국, 필리핀, 대만, 홍콩, 러시아, 노르웨이 및 미국에서 고래 고기의 불법 국제 거래를 방지하는 데 도움이 되었습니다1. 이러한 방법은 효과적이고 신뢰할 수 있지만 완료하는 데 몇 시간 또는 며칠이 걸리고 힘든 단계가 필요할 수 있습니다. 고래류 고기의 식별은 일반적으로 분자 기술을 기반으로 하며 현재 사용할 수 있는 면역학적 방법은 없습니다. 규제 기관의 경우 고래류 고기를 식별하기 위해 현장에서 사용할 수 있는 신뢰할 수 있고 신속한 기술을 개발하는 것이 매우 바람직합니다.

면역크로마토그래피 스트립은 현장에서 사용하기에 적합한 간단한 프로토콜을 통해 빠른 결과를 생성할 수 있는 장점이 있는 검출 도구로 사용됩니다. 면역크로마토그래피 스트립과 ELISA의 원리는 매우 유사하며 항체, 항원 및 표지를 포함합니다. 콜로이드 금, 탄소 및 라텍스와 같은 다양한 라벨이 면역크로마토그래피 스트립의 개발에 사용되었습니다. 현재 이 방법은 항생제, 독소, 박테리아 및 바이러스를 검출하는 데 일반적으로 사용되지만(13), 육류의 단백질을 식별하는 데는 거의 사용되지 않는다14,15. 여기에서는 고래류 미오글로빈(Mb)의 신속한 검출을 위한 측방 유동 크로마토그래피 효소 면역분석법을 제안합니다.

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프로토콜

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윤리 정책 : 연구는 국립 자이 대학, 승인 ID의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 국제 가이드 라인에 따라 수행 및 승인 된 다음 고래류 샘플 사용은 대만 농업위원회 (연구 허가에 의해 허용 된 99022. 100M-02.1-C-99).

1. 근육 샘플 준비 및 SDS-PAGE

참고 : 해양 포유류 16 종, 육상 포유류 5 종을 포함한 23 종에서 근육 샘플, 참치와 닭이 연구 (표 1)에 사용되었다. 고래류 근육 샘플은 좌초 개인, 어업 ​​잡어 및 몰수로부터 얻었다. 토끼, 쥐, 개, 닭 근육 조직은 국립 자이 대학의 동물 질병 진단 센터에서 얻었다. 쇠고기, 돼지 고기, 양고기, 참치의 샘플은 로컬 슈퍼마켓에서 구입 하였다. 항구 인감 (Phoca vitulina는의 근육 샘플 ) Farglory 오션 파크 (Ocean Park)에 의해 제공되었다. 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)은 근육 시료 상이한 분자량 수용성 단백질을 분리하는데 사용되었다.

  1. 사용할 때까지 -20 ° C에서 모든 샘플을 저장합니다.
  2. -20 ° C에서 사전 멋진 박격포. 그 다음에 냉동 근육 시료 3g을 넣어.
  3. 조직 균질기를 이용하여 차가운 인산 완충 식염수 10 ㎖ (PBS) 시료 균질화.
  4. 4 ℃에서 10 분 동안 10,000 XG에서 균질 샘플을 원심 분리기. 상층 액을 수집하고 사용할 때까지 -20 ° C에서 보관합니다.
  5. (5 ㎖ % 스태킹 겔 (3.07 ml의 증류수, pH가 6.8, 40 % 아크릴 아미드 625 μL, 10 %의과 황산 암모늄 (APS)의 50 μL 및 테트라 메틸 에틸렌 디아민의 5 μL의 4X 상부 겔 완충액 1.25 mL의 (5)의 준비 TEMED)) 및 10 ml의 15 % 분리 겔 (증류수 3.65 ㎖, pH가 8.8 배 낮은 겔 완충액 2.5 ㎖, 40 % 아크릴 아미드 3.75 ㎖, 10 %, 100 ㎕ APS,와 TEMED의 4 μL).
    1. 전기 영동 셀에서, 후자는 고화 후에 분리 겔 (15 % 아크릴 아미드) 위에 겔 (5 % 아크릴 아미드)을 적층 붓는다. 스태킹 겔에서 젤 빗를 삽입합니다.
  6. 다음 조건에 따라 PAGE를 수행하여 초기 실행 조건 : 100 볼트, 20 분 및 최종 조건 : 120 볼트, 40 분.
  7. 겔 색상 균일 청색이 될 때까지 30 분 동안 실온에서 쿠마시 브릴리언트 블루로 겔을 염색.
    주 : 겔 더이상 염료 용액에서 볼 수없는 경우 염색이 완료된다.
  8. 1 시간 동안 실온에서 아세트산 용액 (10 %)와 함께 Destain. 밴드가 나타나기 시작합니다. 배경이 선명해질 때까지 밤새 4 ° C에서 탈색 계속합니다.

2. 펩타이드 합성 및 단일 클론 항체 생산

  1. 참치, 닭, 타조, 국내 포유류 시일 18 종을 포함하여 GenBank에서 메가의 아미노산 서열을 검색고래의 (표 2).
  2. 적절한 소프트웨어 (16)를 사용하여 시퀀스를 정렬 :
    1. 정렬을 선택하여 정렬 Explorer를 실행하십시오 실행 표시 줄에 정렬을 작성 / 편집; 새로운 정렬 생성을 선택하고 확인을 클릭합니다. 묻는 대화 상자가 나타납니다 "당신은 DNA 또는 단백질 서열 정렬을 구축하고 있습니까?"
    2. "단백질"로 표시된 버튼을 클릭; 열기 : 데이터를 선택하여 파일을 선택 시퀀스 파일의 시퀀스를 검색; 편집을 선택 다중 서열 정렬을 만드는 데이터 세트의 모든 시퀀스에 대한 모든 사이트를 선택하는 모든 메뉴 명령을 선택합니다.
    3. 선택 정렬 다음 ClustalW에 알고리즘을 이용하여 상기 선택된 시퀀스 데이터를 정렬하기 위해 메인 메뉴로 ClustalW에 맞추고; 후 OK 버튼을 클릭 단백질 무게 매트릭스로 "BLOSUM"를 선택합니다.
  3. 순서 정렬을 분석 :
    1. 5 항원 반응시에 초점TES 17 : 사이트 1 (AKVEADVA, 15-22), 사이트 2 (KASEDLK, 56-62) 사이트 3 (ATKHKI, 94-99) 사이트 4 (HVLHSRH, 113-119) 및 사이트 5 (KYKELGY, 145- 151)과 고래 사이에 보존 조각을 찾을 수 있습니다. * (별표, 정렬에 합의 기호 (프로토콜 2.2.3)) 하나의 완전히 보존 된 잔류 물을 위치를 나타냅니다. 고래의 다음 보존 조각이 발견되었다 (사이트 2 포함) 순서 KASEDLKKHG 시퀀스 HVLHSRHP를 (이 사이트 4 포함).
  4. 상용 서비스를 이용하여 담체 단백질과 같은 단백질 알부민 (OVA)로 서열 분석, 공액에 따른 후보 서열 단편을 합성한다.
    1. 분해 펩타이드 방지 항원 반응성 부위의 N- 말단에 소수성 아미노산 (예를 들어, 메티오닌)를 첨가 (예, M-KASEDLKKHG).
    2. 면역 세포에 항원 코어 사이트를 노출 항원 반응성 부위의 C- 말단을 연장. 또한, conju게이트 C 말단에 시스테인 (Cys 또는 C)를 첨가함으로써과 OVA 펩티드 (예, M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
  5. 면역원 1 또는 PBS의 각 합성 펩티드의 동일한 부피 (3 ml의 최종 농도가 30 ~ 50 μg의 / 100 μL)와 면역원 2 불완전 프로 인트 보조제에 대한 완전한 프로 인트 보조제를 유화.
  6. 피하 5 여성 BALB / c 마우스의 각으로 면역원 1 (0.1 mg)을 접종한다.
  7. 2 주 간격으로 피하 주사를 접종이 면역원을 사용하여 다섯 번 수행하고 모든 접종 전에 마우스의 꼬리 클립 샘플링하여 시험 혈청을 수집한다.
  8. 첫 번째 심사에 대한 혈청 역가를 결정합니다.
    1. 96 웰 플레이트의 각 웰에 반응 완충액 및 분취 용액 50 μl를 25 ml의 자유 펩티드 100㎍을 녹인다. 각 웰에 10 μl의 커플 링 시약 솔루션을 추가하고 판을 섞는다. 실온에서 2 시간 동안 플레이트를 인큐베이션.
    2. 상기 웰의 내용물을 제거증류수로 각 웰을 3 회 세척하고, 차단 용액 200 μl를 첨가함으로써 플레이트를 차단. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션. 내용물을 제거하고, 증류수로 각 웰을 3 회 세척 하였다.
    3. 첫 번째 심사에 대한 혈청 역가를 결정하는 간접 ELISA (프로토콜 5.1-5.7)을 수행합니다. 비장 모음의 가장 높은 역가 (가장 높은 광학 밀도)와 마우스를 선택합니다.
  9. 사흘 전에 비장 컬렉션, 피하 가장 높은 역가를 제시 마우스로 면역원 일 0.1 mg의 접종.
  10. 단클론 항체 생성 (18) 하이 브리 도마 세포를 얻기 위해 뮤린 골수종 세포 F0 (SP2 / 0-Ag14)를 선택한 면역화 된 마우스 퓨즈로부터 비장 세포를 수집한다.
  11. 십사일 융합 한 후, 간접 ELISA를 사용하여 무료 합성 펩티드를 향해 하이 브리 도마 상층 액 (프로토콜 5.1-5.7)의 반응성을 선별하여 양성 클론을 선택합니다.
  12. maximiz 대해 웰 당 적당한 개수로 세포를 희석하나의 단일 클론 (희석 복제)를 포함 우물의 비율을 보내고.
    1. 비어 아니라 A1 제외하고 96 웰 플레이트의 모든 웰에 세포 배양 배지 100 μl를 추가합니다.
    2. 잘 A1에 세포 현탁액 200 μl를 추가합니다. 신속 B1에 A1에서 100 μl를 전송하고 부드럽게 피펫 팅하여 혼합한다. 전체 열 아래 2 희석하고,이 위에있는 우물 같은 볼륨 끝 있도록 다음 H1에서 100 μl를 폐기 이러한 일을 반복합니다.
    3. 8 채널 마이크로 피펫으로 1 열 중간의 추가 100 μl를 추가합니다. 그리고 신속하게 같은 피펫을 사용하여 열이 이들에 열 1의 우물에서 각각 100 μl를 전송하고 부드럽게 피펫 팅하여 혼합한다.
    4. 전체 판에 걸쳐 2 희석 : 같은 팁을 사용하여 이러한 일을 반복합니다. 마지막 열에있는 각 웰로부터 100 ㎕를 폐기.
    5. 각 웰에 100 ㎕의 매체를 추가하여 200 ㎕를 모든 웰의 최종 볼륨을 가져와. 괞 찮아을 품어TE는 가습 CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 흐트러.
    6. 각 웰을 확인하고 단 하나의 식민지를 포함하는 모든 우물을 표시합니다. 단일 클론을 포함하는 웰의> 90 %가 항체 생산에 긍정적까지 둘 이상의 스크랩을 수행한다.
  13. 웨스턴 블롯 및 도트 오 (프로토콜 3.1-4.6)에 의해 클론을 화면. 그런 다음 큰 용기에 우물에서 하위 문화 식민지은 단클론 항체를 얻기위한 세포를 확장합니다. 일반적으로 각 클론은 12 또는 24 웰 플레이트에 하나의 우물에 전달된다.
  14. 모노클로 날 항체와 소, 염소, 돼지, 개, 토끼, 참치, 닭고기, 인감에서 근육 추출물, 서양 오 점과 점 오 (프로토콜 3.1-4.6)에 의해 사 대표 고래류 종 사이의 친화도를 측정한다.
  15. 복수를 유도하도록 마우스에 복강 내 (최대 3 × 106 행) 선택 하이 브리 도마 세포를 접종한다. 복부 팽창 7-10 일 하이 브리 도마 주입 게시 내의 통상적 명백하다. 피하 주사 바늘을 사용하여 유체를 수집(이하 20 게이지).
  16. 원심 분리기 복수의 유체 (10 분 동안 10,000 XG)는 세포와 이물질을 제거합니다. 0.45 μm의 필터를 통해 필터링합니다. 단백질 G 세 파로스 컬럼에 샘플 1 내지 20 ml의 결합 완충액 15 ㎖, 용출 완충액의 3 내지 5를 가하여. 쥐의 복수 액으로부터 정제 된 항체를 함유하는 용출 분획을 수집한다.
  17. 제조업체의 지침을 사용하여 항체 isotyping 키트에 의한 항체 이소 타입을 결정합니다.

3. 서양 얼룩

  1. BME의 50 μL와 배 램 믈리 샘플 버퍼의 950 μl를 혼합하여 β-머 캅토 에탄올 (BME)를 포함 2 배 로딩 버퍼를 준비합니다. 폴리 클로 날 토끼 항 - 인간 메가 항체를 사용하는 경우 5 (가축 참치)과 : 1시 50분 (고래류 날인) 및 1 : 좋은 신호를 획득하기 위해 적절한 비율로 로딩 버퍼 근육 상청액 (프로토콜 1.1 ~ 1.4)을 희석 1 : 1 (돼지, 토끼, 닭고기, 참치), 1 : 5 (소, 염소와 개), 및 1시 25분 (고래와 물개) 때ntibody는 하이 브리 도마 상층 액에서입니다.
  2. 5 분 동안 95 ℃에서 가열 샘플. 분자량 마커와 함께 SDS-PAGE 젤 (4 % 아크릴 아미드 스태킹 및 12 % 아크릴 아미드의 분리)의 우물에로드 샘플. V 후 약 1 시간에 실행을 완료 150 V의 전압을 증가 50에서 5 분 동안 젤을 실행합니다.
  3. 15 분 동안 1X 전송 버퍼에서 젤을 놓는다. 니트로 셀룰로오스로 분리 된 단백질을 이동 (NC) 막 그들이 PAGE에 의해 분리 된 후. 전송은 60 ~ 90 분 동안 100 V에서 수행 할 수 있습니다.
  4. 차단 솔루션을 준비 : 1X PBS 5 % 탈지 분유 0.1 % 트윈 20을 포함. 실온에서 1 시간 동안 차단 용액 25 ㎖의 상기 NC 멤브레인 차단. 트윈 20 (PBST) 15 ml의 인산 완충 식염수로 5 분마다 세 번 씻으십시오.
  5. 항체 희석액 밤새 4 ℃에서 5 %의 블로킹 용액으로 희석하여 10 ㎖의 막과 차 항체 (복수 액 또는 하이 브리 도마 상청액)을 인큐베이션.
  6. membran을 씻으십시오다시 PBST와 전자 세 번 과도한 항체를 청소합니다.
  7. 1 알칼리성 포스파타제 결합 염소 항 - 마우스 IgG와 함께 막을 인큐베이션 : 1250을 실온에서 1 시간 동안 교반과 함께 차단기 용액.
  8. 다시 막을 세척하고, 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 릴 인산염 / P-nitroblue 테트라 졸륨 클로라이드를 부화 (BCIP / NBT) 포스파타제 기질 혼합물을 10 분 내지 20에 대한 발색까지.
  9. 증류수 여러 변화 막을 세척하여 반응을 정지.

4. 도트 오

  1. 좋은 신호를 획득하기위한 적절한 비 PBST 5 % 소 혈청 알부민 (BSA)의 근육 상청액 (프로토콜 1.1 ~ 1.4)을 희석 1 : 가축 참치 5, 1:25 및 고래와 씰. 스팟 막 상에 샘플의 5 μL. 용액을 천천히 가하여 (대개 3-4mm 직경)를 관통하는 면적을 최소화한다.
  2. 실온 (에서 막을 건조 예를 들어, <30-60 분 동안 층류 인 / EM>)을 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 배양 접시에서 차단 용액으로 차단 한 PBST로 씻는다.
  3. 일차 항체와 함께 막을 인큐베이션 (1 단클론 항체 하이 브리 도마의 상등액으로부터 10,000 또는 복수 액을 1 : 5 %의 블로킹 용액으로 희석 100,000)을 실온에서 1 시간 동안.
  4. 실온에서 1 시간 동안 (5 % 블로킹 용액 1250 1 알칼라인 포스파타제 결합 염소 항 마우스 IgG)를 사용하여 PBST 과량의 항체를 제거한 다음, 이차 항체와 함께 배양 5 분마다 막 세 번 씻어 .
  5. 다시 막을 세척 및 색상 개발 될 때까지 10 분 ~ 20 내 BCIP / NBT 포스 기판 혼합물을 품어.
  6. 증류수 여러 변화 막을 세척하여 반응을 정지.

5. 간접 ELISA

  1. 세척 완충액 (0.02 % 트윈 20과 0.002 M 이미 다졸 완충 식염수)을 준비합니다. 플레이트를 세척 3 회 반복한다각각의 다음 단계 (프로토콜 5.2-5.5) 사이에 버퍼.
  2. 코팅 버퍼에 근육 상층 액 (프로토콜 1.1-1.4)의 1시 25분 희석을 준비합니다. 코팅 96 웰 ELISA 밤새 4 ℃에서 100 ㎕의 희석 상등액 접시 실온에서 1 시간 동안 완충액 (PBS에 1 % BSA)을 차단하여이를 차단.
  3. 희석 완충액으로 정제 된 단클론 항체의 2,000 희석 및 각 웰에 희석 된 단클론 항체의 100 μl를 추가 : 1을 준비합니다. 실온에서 1 시간 동안 플레이트를 인큐베이션.
  4. 더 배양 용 : (희석 버퍼 (200) 희석 1) 염소 항 - 마우스 IgG는 고추 냉이 과산화 효소와 결합 추가.
  5. 각 웰 (100 μL / 웰)에 퍼 옥시 다제 기판을 추가하고 10 ~ 15 분 동안 품어.
  6. 발색은 관찰 퍼 옥시다아제 정지 용액 (100 μL / 웰)하여 효소 반응을 정지.
  7. 마이크로 플레이트 분광 광도계를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 읽는다.

콜로이드 골드 표지 단클론 항체 6. 준비

주 : 금 콜로이드 용액을 첨가하고, 혼합물의 색이 항상 적색한다. 검은 침전물이 발견 될 때 pH를, 단클론 항체의 농도, 원심 분리 속도를 조정합니다. 6.1 단계 6.2는 최적화 단계입니다.

  1. 5-9에서 다양한 pH 값과 금 콜로이드 용액 100 ㎕에 단클론 항체 (50 μg의 / ㎖, 3 μL)를 검출 추가 정제. 2 시간 동안 붉은 색을 유지 최소의 pH를 최적의 pH로 간주됩니다. 참고 : 본 연구에서는 0.1 M 탄산 칼륨은 콜로이드 금 (40 ㎚)의 pH 8.0 (최적의 pH)에 솔루션을 조정하는 데 사용되었다.
  2. pH가 8.0에서 콜로이드 금 용액 100 μL에 단클론 항체를 검출하는 정제의 다양한 양 (500 μg의 / ㎖, 1-20 μL)를 추가합니다. 참고 :이 연구에서 최적 농도는 6 μg의 / ㎖ (아니 검은 침전물)입니다.
  3. 상기 결과에 따르면, 정제 된 단클론 적가 금 콜로이드 용액 10 ㎖로 60 μg의 검출을 추가한다. 실온에서 10 분간 부드럽게 혼합 유화. 광고혼합물을 PBS 중 5 % BSA 용액 (PH 7.4) 2 ㎖의 15 분 동안 실온에서 부드럽게 유화 D 배경 간섭을 감소시킨다.
  4. 4 ℃에서 30 분 동안 10,000 XG에서 혼합물을 원심 분리기.
  5. 신중하게 접합 항체 상층 액을 제거하고 1 % BSA와 0.1 % 트윈 20을 포함하는 PBST 4 ml의 결과 펠렛을 일시 중단하고, 원심 분리 및 서스펜션 여러 번 반복합니다.
  6. 1 ml의 PBST에서 최종 침전물을 일시 중단하고 사용까지 4 ° C에서 보관합니다.

면역 스트립 7. 건설

참고도 1은 면역 스트립 디자인을 보여준다. 준비하고 <(1 년) 장기 저장 수명 (20 % 상대 습도가 낮은 습도 실험실 환경 조건에서 스트립)> 조립한다. 패드와 멤브레인의 치수는 다음과 같습니다 콘쥬 게이트 패드 300mm X 10mm, 흡수 패드는 300mm X 24mm, 샘플 패드 300mm X 24mm가, NC 막 300mm X 25mm가, 300 판지mm 80 mm를 X.

  1. 공액 패드를 포화 한 후 조립 전에 1 시간 동안 37 ° C에서 그것을 건조 마이크로 피펫으로 단계 6.6에서 콜로이드 금 표지 단클론 항체 솔루션을 추가합니다.
  2. 피펫 또는 immunostrip 프린터를 이용하여 NC 막에서 단클론 항체를 검출하기위한 제어 영역에 특이 적 항원 - 캡처 테스트 영역에서 단클론 항체 (500 μg의 / ㎖), 토끼 항 - 마우스 IgG (500 μg의 / ml)에 배포한다. 간섭을 피하기 위해 두 영역 사이의 거리 (> 5mm)를 유지한다.
  3. 양면 테이프로 대지에 공액 패드, 흡수 패드 및 NC 막을 붙여 넣습니다.
    주 : 약 2mm하여 NC 막의 양쪽 패드 중첩된다. 부적절한 스트립 구조는 불완전한 테스트가 발생합니다.
  4. 공액 패드를 통해 샘플 패드 (2 mm)를 놓고 대지에 붙여 넣습니다.
  5. 종이 커터와 6 mm 전체 스트립을 만듭니다. 건조제와 함께 알루미늄 호일 가방에 스트립을 포장하고, 사용까지 4 ° C에 저장합니다.

제 교차 반응성 시험

  1. 1.5 ㎖의 원심 분리 관에 1 ml의 PBS (포함 0.1 % BSA) 대나무 스틱을 사용하거나로드 연삭와 원시 근육 샘플 0.03 g을 균질화.
  2. 테스트 영역의 대향 단부가 상기 스트립을 잡고 50-10 분 동안 시료에 샘플 패드 부분을 찍어 직접 결과를 관찰한다.
    1. 옵션 : 500 μl의 상층 액을 수집하고 새로운 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다.
      참고 : 스트립이 직접 상층 액에 담가 때 신호가 분명하지 않은 경우이 단계는 좋습니다.
  3. 세중의 다양한 근육 샘플을 테스트합니다.
    참고 : 여기에 우리가 참치, 닭고기, 물개, 고래 15 종과 지상파 포유류 5 종을 테스트했다.
  4. 다섯 독립적 인 검사관 즉, 다섯 번 8.3 반복이 총 575 스트립을 사용합니다.

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결과

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단일 클론 항체 특성

우리는 고래류 메가의 각각 두 개의 합성 펩티드 (MKASEDLKKHGNTVLC 및 AIIHVLHSRHPAEFGC를) 인식이 IgG를 1 단클론 항체 (CGF5H9 및 CSF1H13)을 개발,이는 고래류 메가의 신속한 검출을위한 샌드위치 형 콜로이드 금 면역 크로마토 그래피 테스트 스트립을 구성하는 데 사용되었다. 그림 2는 CGF5H9은 대략 17 kDa의의 예측 분자량에서 하나의 스테인드 밴드 고래와 다른 포유 동물을 감지 보여줍니다. 일반적인 밍크 고래 (대왕 고래 속을 acutorostrata는) 다른 고래류의 대역보다 상대적으로 희미한 밴드를 보여줍니다. 약 50 kDa의에서 밴드가 돼지 관찰되는 반면, 밴드, 참치, 닭과 물개 결석입니다. 돼지와 참치 여러 비특이적 밴드가 있지만 그것은 단지 대략 17 K의 예측 분자량의 밴드로 고래와 물개와 반응하...

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토론

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캐리어 단백질에 접합 된 합성 펩티드를 사용하여 동종 단백질에 비해 현저하게 더욱 효과적이다. 단클론 항체는 공지 된 상대 위치와 항원을 사용하여 개발되어 있기 때문에 샌드위치 기반 기술의 경우, 본 연구에서 두 개의 단클론 항체는 표적 항원 에피토프와의 상호 작용을 방해 할 가능성이 없다. 또한, 천연 단백질, 합성 펩티드 복합체로 면역화 된 쥐의 항체의 반응성은 천연 단백질 및 천연 단백질 (19)로부터 생성 된 항체의 반응성을보다 강하게 할 수있다. 합성 펩타이드 복합체의 사용은 따라서 적절한 항 펩타이드 단클론 항체의 효과적인 예방 접종 절차 및 생성하는 것이 좋습니다.

단백질의 구조는 주로 폴리펩티드 사슬 아미노산 서열을 포함한다. 각각의 아미노산은 곁사슬 특정 속성을 선도하고, 약간 아미노산 ACI 변경이D 시퀀스 구조의 변경을 초래한다. 10-20 아미노산 길이의 펩티드 항체 제조에 적합하기 때문에, C 말단 영역의 합성 펩티드 (면역원)의 길...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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대만 고래학회, 국립청쿵대학교의 해양생물학 및 고래류 연구 센터, 파글로리 오션 파크, 국립 자이대학교 동물 질병 진단 센터의 동료들에게 샘플 채취를 위해 감사드립니다. 이 프로젝트는 대만 농업 위원회(100AS-02.1-FB99)로부터 WCY에 대한 보조금으로 자금을 지원받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인산염 완충 식염수AMRESCOJ373
단백질 G HP SpinTrap 지  ProteinG Sepharose28-9031-34
서브클래스 및 경쇄 특이적 anti-mouse-Ig 항체 사전 코팅
Mini Trans-BlotBio-Rad170-3935
Nitrocellulose membraneWhatmanZ613630
항체 차단 솔루션 LTK BioLaboratories에서 비특이적 IgG의 비특이적 결합 상호작용을 최소화하기 위해
 KPL50-81-00
단백질 검출기 HRP 마이크로웰 키트, 안티-마우스KPL54-62-18
Nunc 면역플레이트 MaxiSorp ELISA 플레이트Thermo  피셔 사이언티픽EW-01928-08
멀티스칸  EX ELISA 리더 써모  전자  Corporation51118170
콜로이드 골드(40nm) 솔루션 REGA 생명 공학 Inc.40-50nm는 면역스트립
소 혈청 알부민Gibco15561-020
신속한 테스트 스트립 프린터REGA 생명공학, Inc.애지스마트 RP-1000 연구 개발 목적의 면역 스트립의 소규모 생산에만 적합합니다
스트립 구성 요소(NC 멤브레인, 샘플 패드(#33 유리, S& S), 켤레 패드(#16S, S& S) 및 흡수 패드 (CF6, Whatman))REGA생명 공학 Inc.
프로인드 의 보조적이고 불완전한 Freund' S 보조제 Sigma-AldrichF5881, F5506
아크릴아미드, 젤 버퍼, 과황산암모늄 (APS), 테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED)SDS-PAGE
Coomassie brilliant blue R-250Bio-Rad1610436단백질
1610710SDS-PAGE 젤에 로드하기 전에 단백질 샘플을 희석합니다.
IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit Roche 11493027001 Isotyping Strips를 함유한 Healthcare 스핀 컬럼, 샘플 BCIP/NBT 인산가수분해효소 기질에 적합합니다 . 면역원 의 수중유 에멀젼을 생산하는 데 사용됩니다.젤 Laemmli 샘플 버퍼 및 β-mercaptoethanol Bio-Rad 1610737 SDS-PAGE 젤의 단백질 염색을 위한 Protech Gel 준비 염색,

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Robards, M. D., Reeves, R. R. The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009. Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).
  2. Booth, S., Zeller, D. Mercury, food webs, and marine mammals: implications of diet and climate change for human health. Environ. Health Perspect. 113, 521-526 (2005).
  3. Endo, T., et al. Total mercury, methyl mercury, and selenium levels in the red meat of small cetaceans sold for human consumption in Japan. Environ. Sci. Technol. 39, 5703-5708 (2005).
  4. Tryland, M., et al. Human pathogens in marine mammal meat. Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM). , (2011).
  5. Matsunaga, T., et al. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Sci. 51, 143-148 (1999).
  6. Dalebout, M. L., Helden, A. V., van Waerebeek, K., Baker, C. S. Molecular genetic identification of southern hemisphere beaked whales (Cetacea: Ziphiidae). Mol. Ecol. 7, 687-694 (1998).
  7. Dalmasso, A., et al. A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs. Mol. Cell. Probes. 18, 81-87 (2004).
  8. Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages. Meat Sci. 77, 649-653 (2007).
  9. Liu, L., Chen, F. -C., Dorsey, J. L., Hsieh, Y. -H. P. Sensitive Monoclonal Antibody-based Sandwich ELISA for the Detection of Porcine Skeletal Muscle in Meat and Feed Products. J. Food Sci. 71, 1-6 (2006).
  10. Kotoura, S., et al. A Sandwich ELISA for the Determination of Beef Meat Content in Processed Foods. Food Sci. Techno. Res. 15, 613-618 (2009).
  11. Hsieh, Y. H., Chen, Y. T., Gajewski, K. Monoclonal antibody-based sandwich ELISA for reliable identification of imported Pangasius catfish. J. Food Sci. 74, 602-607 (2009).
  12. Ross, H. A., et al. DNA surveillance: web-based molecular identification of whales, dolphins, and porpoises. J.Hered. 94, 111-114 (2003).
  13. Ngom, B., Guo, Y., Wang, X., Bi, D. Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review. Anal. Bioanal. Chem. 397, 1113-1135 (2010).
  14. Muldoon, M. T., Onisk, D. V., Brown, M. C., Stave, J. W. Targets and methods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs. Int. J. Food Sci. Technol. 39, 851-861 (2004).
  15. Rao, Q., Hsieh, Y. H. Evaluation of a commercial lateral flow feed test for rapid detection of beef and sheep content in raw and cooked meats. Meat Sci. 76, 489-494 (2007).
  16. Tamura, K., et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28, 2731-2739 (2011).
  17. Atassi, M. Z. Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins. Immunochemistry. 12, 423-438 (1975).
  18. Zhang, C. Hybridoma technology for the generation of monoclonal antibodies. Methods Mol. Biol. 901, 117-135 (2012).
  19. Kao, D. J., Hodges, R. S. Advantages of a synthetic peptide immunogen over a protein immunogen in the development of an anti-pilus vaccine for Pseudomonas aeruginosa. Chem. Biol. Drug Des. 74, 33-42 (2009).
  20. Dolar, M. L., Suarez, P., Ponganis, P. J., Kooyman, G. L. Myoglobin in pelagic small cetaceans. J. Exp. Biol. 202, 227-236 (1999).
  21. Lo, C., et al. Rapid immune colloidal gold strip for cetacean meat restraining illegal trade and consumption: implications for conservation and public health. PLoS ONE. 8, e60704(2013).

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