방법 논문

신생아 돼지에서 림프의 창자 림프 트렁크와 컬렉션의 장기 도관

DOI:

10.3791/53457

⸱

2016년 3월 5일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Agricultural, Food and Nutritional Science, University of Alberta, 2Department of Surgery, University of Alberta

이 논문에서

요약

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원심성 림프에서 다량의 지질 대사 성분을 채취하기 위해 신생아 돼지의 장 림프통에 카테터를 삽입하는 수술을 제시합니다.

초록

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신생아 돼지에서 장 림프 줄기의 카테터 삽입은 대량의 장(중심) 원심성 림프를 장기간 수집할 수 있는 기술입니다. 중요한 것은 장에서 중앙 림프를 수집함으로써 연구자들이 지질 대사, 장 염증 및 암 전이와 관련된 메커니즘과 지질 구성물뿐만 아니라 면역 기능 및 면역 감시에 관여하는 세포를 모두 연구할 수 있다는 것입니다. 복부 정중선 수술 접근법은 두개골 복부에 대한 탁월한 수술적 노출을 허용하고 췌장 근처에 있는 장 림프통 혈관과 오른쪽 간엽의 내장 측면 아래에 있는 문맥의 오른쪽 복부 분절에 비교적 쉽게 접근할 수 있습니다. 혈관을 꼼꼼하게 해부하여 주변 근막에서 분리한 다음 봉합사로 확장시켜 카테터를 혈관에 삽입하고 고정할 수 있습니다. 카테터는 외부로 삽입되며 7일 동안 약 1L/24시간의 림프를 채취합니다. 이 기법을 사용하면 장기간에 걸쳐 많은 양의 중심 림프를 채취할 수 있지만, 성공 여부는 신중한 외과적 절개, 조직 취급 및 적절한 수술 기법에 대한 세심한 주의에 달려 있습니다. 이는 어린 동물을 대상으로 한 수술의 경우 림프관이 쉽게 찢어질 수 있어 수술 및 실험적 실패로 이어질 수 있기 때문에 특히 중요합니다. 이 비디오는 장 림프 채취를 위한 탁월한 수술 기술을 보여줍니다.

서론

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림프 시스템은 생리학의 파악 하였다 영역입니다. 림프 카테터의 전임상 모델은 다른 동물 종 1-8에서 발생하는 지질 8-12 및 약물 대사 13-15, 실험적인 치료 (17)와 암 전이 (16)에 관여하는 메커니즘을 조사하기 위해 제약 산업 및 연구 기관에 의해 사용되며, 면역 기능 (18) -26. 본 연구는 지단백질 대사의 성분을 측정하는 돼지 모델에서 장 림프 트렁크 카테터의 사용을 탐구한다. 지단백질 대사는 생산과 분비 킬로 미크론의뿐만 아니라 연관된 지질 및 총 단백질의 변화에​​ 관여한다. 일반적으로 사용되는 설치류 모델과 인간 사이와 같은 지질 대사에 큰 차이가 있기 때문에이 날 지질 연구를 더 비교 정보를 제공 할 수있는 장 림프를 수집하기 위해 돼지 모델을 사용, 중요한 고려 사항입니다사람들 27-31에서 tabolism.

여러 가지 수술 기법은 많은 동물 종에서 장 림프 수집하는 데 사용됩니다 두개골 어깨 접근 방식 (즉, 흉부 덕트 카테터) (5), 측면 상부 측면의 접근 방식 32-34, 및 복부 정중선 또는 paramedian 접근 22,35. 이 동영상은 자세히 장 림프 줄기의 카테터를위한 복부 정중선 수술 방법을 사용하여 돼지의 수술 절차를 설명합니다. 조심 수술 기법의 허가 림프 카테터의이 방법은 장시간에 걸쳐 큰 림프의 수량과 그 구성 요소를 수집합니다.

이 기술은 다양한 생리적 기능을 검사 다양한 분야에 응용 프로그램의 무수를 엽니 다. 응용 프로그램이 포함될 수 있지만, 전신 지질 및 지단백질 대사 immunosurveillance 종양 기원 및 전이, 장 기능, developm, 이에 한정되지 않는다엔트과 장 염증 질환의 진행.

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프로토콜

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비디오와 원고 모두에 설명 된 실험 동물의 모든 절차는 동물 케어의 캐나다위원회가 설정 한 가이드 라인을 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 관찰 하였다.

1. 수술 마취 및 신생아 돼지의 수술 준비

  1. 된 azaperone (0.3 ㎎ / ㎏), 케타민 하이드로 클로라이드 (10 ㎎ / ㎏), 덱스 메데 토미 딘 (15 μg의 / kg) : 분리 대기실에서 25kg에 포함 된 근육 진정 마취 약물 칵테일 목의 기지 근처에 돼지를 premedicate.
    참고 : 향상된 내 수술 통증 조절에 대한 사전 마취 약물 칵테일에 부 프레 노르 핀 (0.005-0.02 ㎎ / ㎏)를 추가합니다.
  2. 안면 마스크를 사용하여 (500 ㎖-1000 ml / 분의 O이 4-5 %의 이소 플루 란) 흡입 이소 플루 란 흡입 가스 돼지 마취. 수의학 후두 범위 (17~25cm 긴 직선 칼날)를 사용하여 성대 시각화 및 보컬 국소 10 % 리도카인 중성화 적용코듀로이 바지. 리도카인 스프레이 성대 경련 및기도 폐쇄의 가능성을 줄이기 위해 삽관에 30 ~ 60 초 전에 성대에 문의 할 수 있습니다.
  3. 이소 플루 란 가스로 마취 성대 사이에 수갑을 차고 기관 내 튜브 (5.0-7.0 mm 내부 직경 (ID))를 전달하여 돼지를 삽관 및 유지 보수 (/ 1,000-2,000 ml의에서 0.5 ~ 2.0 %의 이소 플루 란을 분 O 2)를 사용하여 폐쇄 수술을 통해 마취 시스템을 재 호흡 회로. 턱 톤에 의한 마취의 수준, 두 페달과 눈꺼풀 반사 반응을 평가합니다. 만료 된 마취 가스는 소기 및 수술 스위트 외부에 배출된다.
  4. 70 % 이소 프로필 알코올 린스 2.0 %의 클로르헥시딘 수술 스크럽 솔루션 귀의 외부 표면을 청소합니다. 수술하는 동안, 20 G 정맥 카테터, 정맥 유체 (5-10 ㎖ / kg / hr로 락 테이트 화 링거액)을 제공 귀 정맥 카테 테르를 꽂다. 의대와 혀의 점막 표면에 맥박 산소 측정기를 고정iCal의 테이프 심박수 및 말초 혈액의 산소 포화도 (SPO 2)를 모니터링한다.
  5. 지느러미 누운 위치에 마취 된 돼지를 놓고 치골의 복부 측면에 중반 흉부 꼬리 쪽의 복부 복부를 면도. 이 2.0 %의 클로르헥시딘에게 외과 수술 및 멸균 세척을 교대로이 지역을 청소합니다.
  6. 수술 스위트 마취 돼지를 전송하고 70 % 이소 프로필 알코올 린스의 최종 수술 스크럽을 적용, 그것은 건조 할 수 있도록하고 동물을 드레이프.
  7. 체온을 모니터링 직장으로 직장 온도 프로브로부터 약 2 ~ 4 cm의 삽입. 수술 중 정상 체온 (38 ~ 40 °의 C)를 유지하기 위해 물 순환 가열 패드에 돼지를 놓습니다.
  8. 복부 주위의 상부 사분면 패턴에 배치 네 수건 커튼와 돼지 드레이프. 복부 약 5 (c)의 좌우 측면을 따라, 흉부의 검상 부부를 통해 두 번째 드레이프를 처음 드레이프를 놓습니다복부 정중선에 m의 측면. (반대편에 있지만), 약 5 센티미터 복부 정중선 측 방향 복부의 측면 측면을 따라 배치되는 제 2 드레이프처럼 골반의 회장 크레스트와 네 번째 드레이프에서 세 번째 드레이프를 놓습니다.
  9. 기본 수건 커튼을 통해, 수술 부위에 대한 액세스를 허용하는 슬릿 개구, 큰 테이블 드레이프를 놓고 돼지와 전체 수술 테이블 커버. 마지막 드레이프가 큰 테이블 드레이프에 둔 일회용 steri - 드레이프이다.

창자 림프 트렁크 2. 복부 수술 및 도관

  1. 기본 복부 근육을 노출 메스 블레이드 20cm의 피부 절개를합니다. 정수리 복막을 노출 모노 폴라 전기 소 (20 와트 설정)으로 복근 층 절개. 복부 내장과 림프관에 액세스 할 수 Metzenbaum 가위와 정수리 복막의 20cm의 직선 세그먼트를 엽니 다.
  2. 수술 기간 동안 열린 복강을 유지하기 위해 수술 절개의 두개골 측면에서 트랙터를 놓습니다.
  3. 전체 수술 따뜻한 (37 ° C) 멸균 식염수로 모든 조직을 적셔. 조심스럽게 복강에서 결장, 맹장, 회장 및 공장을 포함한 대장의 큰 부분을 들어 올려 상단 복부, 간, 림프관에 액세스 할 돼지의 왼쪽 측면에 외면 화하다. 부드럽게 장을 지원하기 위해 슬링을 형성하기 위해 추가 수건 커튼과 위치에 표면화 소장을 고정합니다.
  4. 림프관을 찾은는 약 4cm 오른쪽 신장 정맥, 6cm 꼬리-medial- 대정맥 반장의 복부 및 췌장 22,36,37 근처 오른쪽 간 엽의 내장 측면 아래의 두개골 - 중간을 낳는다. 포털 정맥 (36, 37)의 오른쪽 복부 세그먼트에 나란히 반투명 구조로 림프관을 확인합니다.
  5. 림프의 VESS를 분리엘 부드럽게 Q 팁 어플리케이터와 함께 첨부 된 조직을 멀리 괴롭 히고하여 주변의 밴드에서. 용기의 측면 측면이 주변 조직으로부터 분리되면, 미세 무딘는 집게를 팁으로 용기 아래에 "터널"개방을 만들 수 있습니다.
  6. 미세 집게로 림프관 아래에 세 2-0 실크 봉합사를 전달합니다. , 폐색 팽창과 림프와 혈관을 채우기 위해 먼저 대부분의 꼬리 봉합사를 결찰. 의도적으로 림프 혈관에 카테터를 확보하기 위해 상대적으로 긴이 봉합 (4cm)의 끝을 둡니다. 다른 두 봉합은 서로 1.0 cm를 분리하고 보안 꼬리 봉합에 두개골 1.0-1.5 cm 약입니다 놓습니다. 혈관에 카테터의 빠른 확보 할 수 있도록 '하나의 느슨한 끈 넥타이'로이 두 봉합을 둡니다.
    참고 : 대부분의 꼬리 결찰 봉합하고 (두 개의 두개골 봉합의) 중간 봉합 사이에있는 림프관의 세그먼트는 카테터를위한 사이트입니다. 스와 관련하여필요한 경우 스트럭처 재료는 2-0 polyglactin 봉합사 2-0 실크 봉합사를 대체 할 수있다.
  7. 홍채 가위로 배에 작은 구멍을 잘라 잘 무딘 집게로 혈관을 팽창. 용기에 경 사진 단부와 전문 카테터 튜브 (4.06 외경 (OD) X 2.31 mm의 ID)의 약 1.0-1.5 cm를 삽입하고 제자리에 카테터를 고정하는 두 개의 두개골 봉합을 묶어. 용기에 카테터를 확보하기 위해 꼬리 봉합의 긴 봉합 끝을 사용합니다.
  8. 따뜻한 식염수의 풍부한 양으로 표면화 장을 세척하고 부드럽게 창자의 정확한 해부학 적 위치를 확보 복강으로 돌아갑니다.
  9. (paralumbar 포사에서 5-10cm 복부) 왼쪽 중간 측면에서 카테터를 외면 화하다. 메스 피부 절개를하고 카테터의 exteriorization위한 개구를 만들 피부 표면에 복강에서 투관침을 통과한다. 복부 CAV에서 카테터를 외면 화하다하기 위해 큰 켈리 집게를 사용하여투관침 개방을 통해 ITY.
  10. 라운드 (테이퍼) 바늘 2-0 polyglactin 봉합의 간단한 연속 봉합 패턴 정수리 복막을 닫습니다. 둥근 바늘에 2-0 polyglactin 봉합과 간단한 중단 봉합 패턴으로 복부 근육 레이어를 닫습니다.
  11. 절단 바늘에 2-0 polyglactin 봉합과 표피 하 패턴으로 피부를 닫습니다. 지갑 문자열 봉합 패턴 피부와 절단 바늘에 2-0 나일론 봉합사로 표면화 카테터를 고정합니다.
  12. 여전히 배치를 용이하게하고 복구하는 동안 돼지의 스트레스를 줄이기 위해 마취 상태에서 돼지 전문 재킷을 놓습니다.

3. 포스트 수술 복구 및 림프 컬렉션

  1. 이전에 흡입 마취의 중단에 약 10 분, 즉시 수술 후 진통제를 제공하기 위해 근육 bupenorphine (0.1 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수​​ 있습니다. bupenorphine 계속 (0.1 ㎎ / ㎏) 24 ~ 48 시간 유지하기위한 모든 12 시간수술 후 진통제.
  2. 수술 후 합병증에 대해 7 일 동안 매일 8 ~ 12 시간을 돼지를 모니터링합니다.
  3. 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 코팅 및 항생제로 보충 된 500㎖의 폴리 프로필렌 세척 병 림프를 수집; 페니실린 (6000 IU), 스트렙토 마이신 (6 mg) 및 암포 테리 신 B (3 mg)을 7 일 동안 매 12 시간.

지단백질 ApoB48, 중성 지방, 콜레스테롤 및 총 단백질의 정량 4. 림프에서 수집

  1. 4 ℃에서 5 분 동안 1,800 XG에서 림프 샘플을 원심 분리기. 상층 액을 수집하고 중성 지방, 콜레스테롤 및 총 단백질의 정량을 위해 사용합니다.
  2. 희석 샘플, 샘플 희석 1시 20분 증류수와 1 희석 최종 샘플 : 증류수로 100 세 샘플로 뜨는을 나눈다.
  3. 시판의 키트, 콜레스테롤 수준을 측정하는 희석 상등액을 사용한다.
  4. 1시 20분 1:10 사용0 희석 된 샘플은 시판 키트 각각 bicinchoninic 산 총 단백질 분석과 트리글리 세라이드 및 총 단백질 수준을 측정 하였다.

림프 (38)로부터 수집 된 지단백 ApoB48 5. 정량,

  1. 적응 면역 웨스턴 블로 팅 방법 (38) 지질 단백질 ApoB48의 농도를 결정합니다. 3~8% 트리스 초산 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)으로 분리 총 림프.
  2. 항 - 염소 이차 항체로 바인딩 할 : 폴리 비닐 리덴 플루오 라이드 막 (0.45 μm의)로 분리 된 단백질을 옮기고 형 ApoB (4000 1)에 염소 폴리 클로 날 항체와이를 부화.
  3. 정제 설치류 ApoB48 단백질 표준 선형 농도계 비교하여 화학 발광 지단백질 ApoB48 정량화.

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결과

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신생아 돼지의 창자 림프 트렁크의 림프 카테터는 7 일 동안 약 1 L 중앙 림프의 / 24 시간의 모음을 할 수 있습니다. 이 실험에서 수집 된 림프 지질 대사, 즉 총 림프 단백질, ApoB48 지단백, 중성 지방, 총 단백질, 콜레스테롤의 구성 요소가 포함되어 있습니다. 표 1 주요 세 돼지 풀 림프 샘플에서 이러한 지질 성분의 대표 양. 특히, 림프의 흐름과 지질 성분은 인라인 장 림프 혈관 카테터 다음 다른 연구자에 의해보고 중앙 림프의 값 (림프 570 ± 158-979 ± 284 ㎖ / 24 시간 25, 360 ± 120 MLL / 24 시간에 흐름이다 1080 720 ± ㎖ / 24 시간 (26), 중성 지방 687 ± 110 밀리그램 / dL로 9 콜레스테롤 63.1 ± 5.6 밀리그램 / dL로 9) 림프 혈관 내 카테터의 적절한 배치를 나타내는.

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토론

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장 림프를 수집하는 다양한 실험 동물 모델에서 지질 8-12 및 약물 13-15 대사, 암 전이 16, 17, 셀 인신 매매와 면역 기능 18-26에 관여하는 메커니즘을 조사 할 수있는 좋은 방법입니다. 실제로, 장기간에 걸쳐 어느 주연 (심성) 및 중앙 (원심성 큰 트렁크 용기) 림프 다량 수확 할 수있는 능력은 면역 변조 제 18-22을 가진 도전 다음 세포 집단에서 발생하는 시간 변화를 이해하는데 특히 중요했다 , 25, 26. 마찬가지로, 중앙 림프의 컬렉션 지단백 대사 8-12에 관여하는 과정을 서술하는 데 도움이되고있다. 림프 컬렉션의 유틸리티는 카테터 절차의 성공과 림프 혈관 내 카테터의 개통에 따라 달라집니다.

관련된 주요 림프 혈관 카테터큰 동물의 창자 림프 배수는 일반적으로 세 가지 수술 방법 중 하나를 사용합니다. 제 1...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 작업은 앨버타 축육류국(Alberta Livestock and Meat Agency)과 자연과학 및 연구 위원회(Natural Science and Research Council)의 디스커버리 보조금(Discovery grant to S. D. Proctor)의 자금 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
밀러 후두경 블레이드Welch Allyn68044182mm 길이
Surgivet advisor: 바이탈 사인 모니터SurgivetV9203
직장 온도 프로브SurgivetV3417
모노 폴라 전기 수술 발전기Valley Lab
Metzenbaum 가위Fine Science14518-18
Tuffier 견인스티븐스162-11-676
모기 겸스티븐스162-7-10
켈리 겸자 곡선 (14cm)스티븐스162-7-38
알리스 조직 집게 스티븐스162-7-38
집게 드레싱 아이 (10.2cm)스티븐스162-18-780
집게 옷 매무새 - 아디슨 (12.1cm)Stevens162-17-2510
니들 드라이버Stevens162-V98-42
아이리스 가위파인 사이언14058-11
순환수 펌프JorvetJ-783X
Maxitherm-Vinyl 담요JorvetJ-784C
Q 팁 애플리케이터Fisher Scientific22-037-960
카테터 삽입  튜빙 (4.06 OD X 2.31 ID)Braintree Scientific Inc.MRE-160마이크로 르네탄 이식 튜브
2-0 실크 봉합EthiconLA556
2-0 폴리글락틴 봉합사EthiconJ443H2-0 vicryl
대형 동물 재킷Lomir Biomedical Inc.SSJ2YC
폴리 프로필렌 세척 병Fisher Scientific03-409-22C500 ml
페니실린-스트렙토마이신시그마 알드리치D4333
EDTA시그마 알드리치60-00-4
암포테리신 B시그마 알드리치A2411
아자페론엘랑코 동물 건강스트레스닐
Dexmedetomidine hydrochlorideZoetis6295Dexdomitor
IsofluraneAbbott Animal  건강05260-5IsoFlo
케타민 염산염Zoetis2626Ketaset
Bupenorphine 염산염챔피언 Alstoe 동물 건강DIN : 02347510
6mm 기관내 튜브JorvetJ-165d
10 % 리도카인 스프레이AstraZenecaDIN : 02003767
4 % 클로르헥시딘 수술 스크럽Partnar 동물 건강PCH-011희석 : 2.0 % 용액
3M 외과 steri- 드레이프3M 건강 관리1040
SDS 페이지 젤InvitrogenEA0375BOX3-8 % 트리스 아세테이트
폴리 비닐 리덴 플루오 라이드 막MilliporeIPVH000100.45 μ m 기공 크기
ApoB 항체 EMD MilliporeAB7421:4000 희석
당나귀 안티-염소 IgG-HRP산타크루즈 생명공학Sc-2304
ECL 프라임 웨스턴 블로팅 시약GE 헬스케어 생명과학RPN2232     
트리글리세라이드 키트Wako Pure Chemicals998-40391/994-40491
총 콜레스테롤 키트Wako Pure Chemicals439-17501
총 단백질  피어싱 23225비신코닌산 분석
기 자 스 사

참고문헌

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